ACTIVIDAD 9 TEMA 3

1. Se quiere clonar un gen humano cuyas mutaciones provocan una enfermedad muy grave. El tamao del genoma humano es de 3x109 pb y su contenido medio en G+C del 46%. Para ello se prepara una genoteca genmica en un plsmido, utilizando la diana AvaII(GG[A/T]CC) para la insercin de los fragmentos. a) Cul ser la longitud media de los insertos de la genoteca si el digerido del ADN con la enzima es total? P: (0,23)2x(2x0,27)x(0,23)2= 1,51x10-3 3x109x1,51x10-3= 4.530.000 dianas 3x109/4,53x106= 662,25 pb b) Cuntos cortes se espera que realice la enzima en el genoma de la especie? 3x109x1,51x10-3= 4.530.000 dianas c) Cuntos clones de la genoteca habra que rastrear para obtener al menos uno positivo con una probabilidad del 95%? N= ln (1-p)/ln(1-(T/C)) N=ln(1-0,95)/ln(1-(662/3x109)= 13.555.348,15 clones d) Crees que un plsmido bacteriano como el usado es un vector adecuado para construir esta genoteca? Por qu? No, porque son necesarios demasiados clones para conseguir una alta probabilidad de tener todos los genes en la genoteca. 2. El plsmido utilizado en el ejercicio anterior tiene un tamao de 3,2 kb. Para elaborar un mapa de restriccin del plsmido para una serie de enzimas de restriccin que nos interesa, se digiere con tres enzimas de restriccin: AvaII,EcoRI y BamHI. Los resultados en kb fueron los siguientes: Resultados de las digestiones en kb A E B A+E A+B E+B 3,2 1,0 0,5 0,9 0,4 0,2 2,2 1,2 1,0 0,5 0,3 1,5 1,3 1,1 0,5 1,2 0,9 1,3

a) Representar el mapa de restriccin del plsmido en relacin con la posicin 0/3,2.

Para clonar el gen deseado, se rastre la genoteca descrita en el ejercicio 1 con una sonda heterloga del gen y se aisl un clon recombinante que contena parte del gen buscado. El plsmido recombinante aislado de dicho clon fue por digerido con AvaII y BamHI. Con los fragmentos resultantes de cada digerido se realiz un Southern utilizando como sonda el inserto clonado. El resultado del Southern se muestra en la figura siguiente: Figura 3.2

a) Representar el mapa de restriccin del plsmido recombinante, mostrando la posicin de todos los sitios AvaII, EcoRI y BamHI en relacin con la posicin 0. b) Cul es el tamao del fragmento clonado (inserto)? Resalta el fragmento en el mapa. c) Tiene el fragmento clonado algn sitio EcoRI? y BamHI? En qu posiciones? Mustralos en el mapa.