ESPECTROFOTOMETRA.

La espectrofotometra se refiere a los mtodos, cuantitativos, de anlisis qumico que utilizan la luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas. Se conocen como mtodos espectrofotomtricos y segn sea la radiacin utilizada como espectrofotometra de absorcin visible (colorimetra), ultravioleta, infrarroja.

MTODOS ESPECTRO ANALITICOS

Un mtodo analtico, depende del sistema qumico observado y de la calidad de los instrumentos utilizados para observarlo. La cantidad de ruido presente en un sistema qumico y/o instrumental determina la concentracin de analito ms pequea que puede medirse con exactitud, y tambin fija la precisin de la medida a concentraciones ms grandes. Conforme las concentraciones disminuyen hacia el nivel de traza o las fuentes de seales se tornan dbiles, el problema de distinguir las seales respecto al ruido se hace cada vez ms difcil, ocasionando una disminucin en la exactitud y la precisin de las medidas. La capacidad de un sistema instrumental para discriminar entre seales y ruido se expresa, usualmente como la relacin seal-ruido: S/N = amplitud media de la seal / amplitud media del ruido Varios parmetros permiten caracterizar una medida o un mtodo analtico: 1. El lmite de deteccin mnimo, S, se define como la razn de cambio en la respuesta del instrumento al cambiar el correspondiente estmulo: concentracin, temperatura, masa, etc, por ejemplo: S = dG/dC donde G = Seal de salida, C = Concentracin del analito La sensibilidad de un mtodo analtico, S, se define como la pendiente, m, de la curva de calibracin, ya que sta define la razn de cambio de la propiedad medida por unidad de concentracin. Para los mtodos espectrofotomtricos, S = mcal = D A/ D C de la curva de calibracin Absorbancia vs. Concentracin. La sensibilidad tambin puede expresarse en trminos de concentracin como: S = 0.0044/ mcal relacin cuyas unidades corresponden a concentracin. El valor 0.0044 es la absorbancia que corresponde a la mnima diferencia medible con precisin ( D T = 1.0% T ) en instrumentos con escala de % T entre 0.0 y 100.0 ; una absorcin de 1% corresponde a 0.0044 unidades de absorbancia, aplicando: A = log [100 / (100-% absorcin) ] = log [100 / ( 100-1)] = 0.00436 Una respuesta no lineal en la grfica de A vs C indica un cambio en el valor de la sensibilidad en funcin de la concentracin. Conforme la concentracin del analito se aproxima a cero, la seal desaparece dentro del ruido y se rebasa el lmite de deteccin. 2- El lmite de deteccin mnimo (LD) la concentracin mnima detectable es un parmetro estadstico que ha sido muy controvertido. Diferentes autores han dado diversas definiciones y metodologas para su determinacin experimental. Actualmente, algunos autores lo definen como la cantidad o concentracin mas pequea del analito que produce una seal

XL significativamente diferente de la seal del ruido de fondo Xb. ( Analyst, 1987,112,199-209) El criterio utilizado para que la concentracin mnima detectable sea distinguible con certeza (significativamente diferente o estadsticamente diferente) del ruido de fondo es que la diferencia entre la seal del analito, de concentracin muy baja, y la seal de los blancos sea igual a tres veces la desviacin estandar de la seal de los blancos, utilizados para medir el ruido de fondo. Es decir que: en donde XL es la seal lmite, obtenida para la concentracin mnima detectable de analito, Xb es la seal promedio de los blancos, y sb es la desviacin estndar de las lecturas del blanco. Experimentalmente, el lmite de deteccin se determina involucrando todos los factores que afectan la medida y se define , en general, para obtenerlo en unidades de concentracin como: LD = 3sb / mcal bajas concentraciones Donde, sb = desviacin estndar de los blancos, mcal es la pendiente de una curva de calibracin del sistema, preparada a muy bajas concentraciones. Este criterio es recomendado por IUPAC. Aplicado a los mtodos espectrofotmtricos, entonces, sb = desviacin estndar de los blancos en absorbancia y mcal pendiente de la curva de calibracin (A vs C) en unidades de Absorbancia/Concentracin, por lo tanto, al calcular la relacin el lmite de deteccin se obtiene en unidades de concentracin. Otros autores, utilizan para calcular el lmite de deteccin, la siguiente expresin:

En donde C nominal es la concentracin del patrn de baja concentracin y C promedio corresponde al promedio aritmtico, de las concentraciones halladas experimentalmente por interpolacin (despus de interpolar la absorbancia en una curva de calibracin), de por lo menos diez replicas de la solucin de baja concentracin. Este criterio aunque no lo recomienda IUPAC es muy utilizado en diferentes laboratorios. 3- El lmite de deteccin mximo: Se define como la mxima concentracin de un analito que se puede analizar. Generalmente, lo que ocurre, es que las soluciones se hacen tan concentradas, que en el caso de los mtodos espectrofotomtricos, toda la luz es atrapada por el analito y tenemos una situacin equivalente al ajuste del 0 % de transmitancia. En este caso, el detector no diferencia dos soluciones de concentraciones altas. La determinacin queda limitada a concentraciones menores del valor de lmite de deteccin mximo, pero en este caso, a diferencia del lmite de deteccin mnimo, el problema se soluciona fcilmente mediante una dilucin adecuado. En el caso del lmite de deteccin mnimo, las soluciones son concentrar la muestra o usar otra tcnica con lmite de deteccin menor. El lmite de deteccin mximo, se puede obtener de la parte superior de la curva de Ringbom, como se ver ms adelante.

4-Lmite de cuantificacin: Corresponde a la cantidad o concentracin del analito a partir de la cual es confiable realizar determinaciones cuantitativas y se define como: Lmite de cuantificacin = LQ = 10s b / m cal bajas concentraciones 5- La precisin de una medida o de un mtodo analtico tambin se determina por un parmetro estadstico que indique la dispersin de las medidas con relacin al valor medio la mediana o la moda de la medida realizada. Generalmente se expresa por la desviacin media o desviacin estndar. En los mtodos espectrofotomtricos se determina tanto la precisin del instrumento como la del mtodo en general.. La precisin del instrumento se define entonces por el error instrumental o error fotomtrico D T. Experimentalmente se obtiene midiendo la transmitancia de unas 10-20 porciones de una solucin y calculando la desviacin media de esas mediciones. Cada medida debe incluir las operaciones de vaciado, llenado y colocacin de la celda en el porta celdas, as como el ajuste del 0.0% T (con el obturador) y del 100% T con el disolvente puro. 6- El error fotomtrico o instrumental que indica la repetibilidad de las lecturas en un espectrofotmetro es comn tomarlo como: D T = 2S T- T promedio / n , el doble de la sumatoria de las desviaciones de las lecturas de T con respecto a la transmitancia promedio T , en valor absoluto, dividido entre el nmero de datos, n. Sobre la determinacin de la precisin del mtodo analtico se comentar posteriormente. La calidad de las medidas, como se observa, depende del ruido de fondo, ya sea del ruido originado por los componentes del instrumento o ruido instrumental o el ruido originado por la matriz de anlisis del sistema qumico. Las principales fuentes de ruido instrumental asociados a dispositivos elctricos o electrnicos en estado slido son: - Ruido trmico: originado por el movimiento trmico de los electrones en las resistencias u otros elementos resistivos de un circuito elctrico. Su magnitud se calcula por: Vrms = ( 4kTR D f )1/2 Donde Vrms es el ruido medio cuadrtico en el voltaje, dentro de una banda de frecuencias D f, k constante de Boltzmann (1.38x10-16 erg / grado) ,T temperatura absoluta. - Ruido de disparo o de golpeteo: tiene origen cada vez que una corriente transfiere electrones u otras partculas cargadas a travs de uniones o cuando los portadores de carga atraviesan las uniones n-p, o llegan a la superficie de los electrodos. Su magnitud se calcula por: irms = (2IeD f )1/2 , Donde i rms es la fluctuacin de la corriente media cuadrtica relacionada con la corriente media I, e es la carga del electrn 1.6x10-19 coulombs y D f el ancho de la banda de frecuencia considerado. - Ruido de parpadeo o fluctuacin: Su magnitud es inversamente proporcional a la frecuencia de la seal observada, se denomina ruido 1/f. Su magnitud es importante para frecuencias menores que 100 Hz. Existe otro tipo de ruido que es el ambiental el cual implica la transferencia de energa desde los alrededores hasta el sistema de medicin. Las fuentes

comunes son: campos elctricos y magnticos, producidos por las lneas de transmisin de potencia a 60Hz y sus correspondientes armnicos; energa radiante reflejada, vibraciones mecnicas y las interacciones elctricas entre los diferentes instrumentos. El ruido instrumental se mide por la desviacin estndar de la seal producida por los blancos, razn por la que este parmetro aparece en la determinacin del lmite de deteccin.

METODO COLORIMTRICOS
Fotometra. Dentro de los mtodos colorimtricos, un gran nmero de determinaciones que se realizan habitualmente en el laboratorio, utiliza medidas de energa radiante, ya sea emitida, absorbida o reflejada. Estas medidas se determinan a travs de tcnicas fotomtricas. Las tcnicas fotomtricas tienen su fundamento en las interacciones de las radiaciones electromagnticas sobre la materia. Radiaciones Electromagnticas Pueden considerarse como un conjunto de corpsculos, llamados fotones, los cuales llevan asociada una onda. La energa de radiacin esta relacionada con la longitud de onda. Las longitudes de onda ms cortas poseen mayor energa que las longitudes de onda ms largas. De tal manera que podemos hablar de un espectro electromagntico constituido por las radiaciones electromagnticas, mismo que se ha dividido en varias regiones, de acuerdo con la longitud de onda () y la energa. 1. 2. 3. 4. 5. Rayos X (1-100 nm) Ultravioleta (100-390 nm) Visible (390-700 nm) Infrarrojo (700-100 000 nm) Microondas (100 000- 1 000 000 nm) MTODO ESPECTROFOTOMETRICO un mtodo espectrofotomtrico para que sea cuantitativo son: Que el mtodo sea selectivo al analito que se desea analizar. Que est libre de interferencias que afecten el resultado analtico que las interferencias se puedan controlar. Que tenga alta precisin y exactitud. Que tenga una alta sensibilidad y Que el lmite de deteccin corresponda a una concentracin baja. Experimentalmente para el establecimiento de un mtodo espectrofotomtrico, despus de optimizar las condiciones qumicas del sistema (pH, temperatura, control de interferentes, concentracin adecuada de reactivos, solvente apropiado, proteccin a la luz para evitar reacciones fotoqumicas, etc.) que

garanticen que se tiene la especie de inters en condiciones adecuadas para la medida, se establecen los siguientes parmetros: 1-Longitud de onda analtica: Se escoge mediante el registro y/o la observacin de la curva espectral o espectro de la sustancia que indicar si es adecuado tomar la longitud de onda de mxima absorcin u otra banda caracterstica de la sustancia como longitud de onda para realizar las medidas, la longitud de onda escogida se conoce como longitud de onda analtica. 2- Intervalo ptimo de concentraciones : Se debe trabajar, en lo posible, con concentraciones que permitan que se cumpla la ley de Beer, con el fin de obtener una curva de calibracin que tenga una relacin lineal. Para obtener el intervalo ptimo de concentraciones primero se construye la curva de Ringbom, que consiste en construir una grfica de absortancia (100- %T) vs. lg Concentracin. Los datos se obtienen preparando una serie de soluciones patrn del analito, que cubran una variacin de por lo menos dos rdenes de magnitud de concentracin de este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de onda analtica escogida. Para la mayora de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta grfica permite obtener el intervalo de concentraciones ptimo o el intervalo que presentara una relacin lineal entre absorbancia y concentracin. En esta grfica, los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor para los lmites de deteccin mnimo y mximo, respectivamente. 3- Curva de Calibracin: Con los datos de la parte recta de la curva de Ringbom se construye la curva de calibracin Absorbancia ( en las ordenada ) vs. Concentracin (en la abcisa) previo ajuste de los datos por mnimos cuadrados (que incluyen el punto 0.0, 0.0000) revisando que el coeficiente de correlacin sea estadsticamente significativo. La grfica de la recta de calibracin debe incluir los puntos experimentales. La recta ajustada tambin se conoce con el nombre de curva de trabajo. 4- Curva de Crawford: Con todos los datos obtenidos para la curva de Ringbom, se calcula el error analtico por unidad de error fotomtrico, y se construye la curva del error para el sistema de inters, previa determinacin experimental del error fotomtrico o instrumental. Si no se conoce D T, entonces solo se puede obtener (D C/C)/D T. 5- Sensibilidad del mtodo analtico: Se calcula la sensibilidad del mtodo de la pendiente de la curva de calibracin y se expresa como se indic anteriormente. Lmite de deteccin: Se preparan, por lo menos, diez soluciones del blanco de procedimiento, se leen las transmitancias o absorbancia respectivas y se calcula como se indic anteriormente. Precisin del mtodo. Carta de dispersin: La precisin indica la dispersin de las medidas o la variabilidad del mtodo. La precisin se mide mediante un

parmetro estadstico de dispersin, generalmente se utiliza la desviacin estndar, S: S = [ ( X- X promedio)2 /( n -1)] 1/2 donde X es la variable medida concentracin, absorbancia, etc., X promedio el valor medio de la variable medida y n el nmero de medidas o datos. Un valor pequeo de desviacin estndar con relacin al valor medio, indica que las medidas presentan poca dispersin o que son precisas. En muchos casos, se observa si todos los datos de una serie de medidas caen entre el valor medio y ms o menos dos desviaciones estndar, X promedio 2S, si es as, se dice que el mtodo tiene una precisin del 95 %. El procedimiento que se sigue para obtener los datos que permitan el calculo de la desviacin estndar en concentracin, se ilustra a continuacin: Se preparan, por lo menos, diez soluciones patrn del analito de la misma concentracin (concentracin que produzca una transmitancia cercana a 37.0%) siguiendo todos los pasos del procedimiento, se lee su transmitancia, se calcula la absorbancia para cada solucin, se interpolan los valores en la curva de calibracin y se obtienen las concentraciones respectivas. Con las concentraciones halladas se obtiene el valor promedio de concentracin y la desviacin estndar, S, que corresponde a la medida de la dispersin de los datos. Se construye la carta de dispersin de los datos y se calcula el coeficiente de variacin del mtodo as: % Coeficiente de variacin = (desviacin estndar / valor medio) Fotometra de Absorcin Qu sucede cuando las molculas absorben o emiten luz? Por qu diferentes sustancias absorben radiacin de slo cierta energa especfica, o frecuencia o longitud de onda, en las diferentes zonas del espectro electromagntico o por qu una sustancia permite la transmisin de luz de ciertas longitudes de onda o energa mientras otras energas o longitudes de onda son absorbidas en forma selectiva? Cmo se produce y qu efectos tiene sobre las sustancias la interaccin del campo elctrico y/o magntico de la radiacin sobre la materia que a su vez esta constituida por partculas que tambin generan o poseen campos elctricos y/o magnticos? Qu sucede con la energa de tomos y molculas cuando absorben o irradian luz de una cierta frecuencia o energa? Las diferentes observaciones realizadas, a travs de muchos aos, desde diferentes campos de la ciencia han llevado al planteamiento de diferentes modelos y varias teoras para responder el fenmeno de la absorcin y emisin de luz por tomos y molculas. Algunas teoras han sido rebatidas porque los hechos experimentales las contradicen, otras se han mantenido y confirmado porque los hechos experimentales o son explicados por ellas o la confirman. El conocimiento actual, tanto terico como experimental indica que la absorcin y emisin de luz por parte de las sustancias se origina en la estructura misma de las molculas y de los tomos. El tamao, la forma, la flexibilidad de las molculas, la distribucin de los electrones en tomos y molculas, es decir la estructura de la sustancia origina la especificidad en la radiacin absorbida por ellas o emitida por ellas. La espectroscopia es el campo de la ciencia que estudia los espectros de las sustancias y la relacin entre la absorcin y/o emisin de luz con la estructura de la materia. Si se observa absorcin de luz se denomina espectroscopia de

absorcin y si se observa emisin de luz, espectroscopia de emisin. Segn la zona del espectro utilizada, se clasifica como: Espectroscopia Mossbauer o de rayos g , de rayos X, espectroscopia ultravioleta, visible, infrarroja, de microondas, de resonancia spin electrn, de resonancia magntica nuclear, etc. Dentro de la fotometra de absorcin, uno de los aparatos ms utilizados en la determinacin de las concentraciones de los analitos es el espectrofotmetro; que es un instrumento que utiliza medidas de absorcin de las radiaciones electromagnticas. Adems ste ser nuestra principal herramienta de trabajo, ya que en l se harn las lecturas de absorbancia para la determinacin de las concentraciones de los diferentes analitos a determinar durante el semestre. Las determinaciones por espectrofotometra requieren que se lleve a cabo previamente una reaccin qumica especfica que varia segn el analito a determinar. Los productos finales de esta reaccin son los que se cuantifican utilizando la lectura de la absorbancia de la muestra, as como la de estndares conocidos (Calibradores). Las determinaciones en el Laboratorio requieren un control de calidad por lo que es importante obtener los valores de desviacin Standard. El principio del Espectrofotmetro esta basado en la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la intensidad de luz incidente y la de la luz transmitida, cuando es atravesada una longitud de onda de un medio que absorbe.

Est basada en la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la intensidad de luz incidente y la de la luz transmitida, cuando es atravesada una longitud deonda de un medio que absorbe.

Material para la espectrofotometra Rango de Trabajo: 200-6400 cm-1. Detector DTGS-CsI. Dimetro de apertura variable. Interfermetro de sistema AutoTune (alineacin dinmica). Purga continua de CO2. Accesorio interno de reflectancia total atenuada, dotado con cristal de ZnSe, que permite obtener espectros de infrarrojo de slidos y lquidos en un rango de trabajo de 650-6400 cm-1. Librera de espectros. Celda de gases para anlisis de los gases desprendidos en el analizador termogravimtrico (ver foto).

Espectrofotometro ultravioleta visible 4200

Longitud de onda Modelo 4200/20 4200/51 4210/20 4210/50 4250/50

Exactitud

Ancho Concentracin/RS de 232 banda

325-1000 +/- 0.8% T mm 200-1000 +/- 0.8% T mm

5 nm 5 nm

Si Si Si Si Si

320-1000 +/5 nm nm 0.004A@0.5A 190-1000 +/5 nm nm 0.004A@0.5A 190-1000 +/5 nm

nm Espectrofotometro visible 4100

0.004A@0.5A

Longitud Exactitud de onda

Ancho Concentracin de /RS 232 banda

Modelo 4100 4110 RS 4110 UV 360-1000 +/- 2% T mm 330-1000 +/- 2% T mm 200-450 +/- 1% T mm 8 nm 8 nm 6 nm No Si Si

Espectrofotometro UV-VIS con barrido 4418

Exactitud

Ancho de banda

Concentracin/RS 232

Longitud de onda 200-1100 nm +/0.002A@0.5A 2 nm Si

Espectrofotometro UV-VIS de doble haz. 4419

Ancho de banda

Concentracin/RS 232

Longitud de onda 190-900 nm 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 y 5.0 nm Si

Se refiere al mtodo qumico cuantitativo de anlisis qumico que utilizan la luz para medir la concentracin? A) Mtodo de la espectrofotometra B) Mtodo analtico C) Mtodo de la absorcin D) Mtodo calorimtricos C) Mtodo Lambert-Beer Se define como la mxima concentracin de un analito que se puede analizar? A) El lmite de deteccin mximo B) El lmite de deteccin mnimo C) El lmite de deteccin mnimo D) Lmite de cuantificacin E) La precisin de una medida Campo de la ciencia que estudia los espectros de las sustancias y la relacin entre la absorcin y/o emisin de luz? A) La espectroscopia B) La espectrofotometra C) La fonometra D) La espectrofotometra analtica E) La espectrofotometra de absorcin Cmo se le denomina a la relacin entre la absorcin y/o emisin de luz con la estructura de la materia? A) La espectroscopia B) La espectrofotometra C) La fonometra D) La espectrofotometra analtica E) La espectrofotometra de absorcin Es uno de los aparatos ms utilizados en la determinacin de las concentraciones de los analitos? A) Espectrofotmetro B) Calibradores C) Espectroscopia D) Fotoqumicas E) Calculador de exactitud Se escoge mediante el registro y/o la observacin de la curva del espectro? A) Longitud de onda analtica B) Intervalo optimo C) Curva de calibracin D) Curva de Crawford E) Mtodo analtico

Cul es la ley que relaciona la intensidad de luz incidente y la de la luz transmitida? A) Ley de lambert-Beer B) Ley de crawford C) Ley de Beer D) Ley de la espectrofotometra E) Ley de la absorcin de luz Es un conjunto de corpsculos llamados fotones, los cuales llevan asociada una onda? A) Radiaciones Electromagnticas B) Espectrofotometrico C) Ondas largas D) Ondas cortas E) Fotones Nombre que recibe el instrumento para determina tanto la precisin del instrumento como la del mtodo en genera? A) Error instrumental o error fotomtrico B) Ruido intomental C) Sistema qumico D) Valor medio E) Error de calculo Tipo de ruido que cada vez que una corriente transfiere electrones u otras partculas cargadas a travs de uniones? A) Ruido de disparo o de golpeteo B) Ruido trmico C) Ruido de parpadeo o fluctuacin D) Ruido electromagntico E) Ruido de ondas