Microbiología General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Crecimiento microbiano. Cultivo de microorganismos. Medios de cultivo.

Métodos de aislamiento. Concepto de cultivo puro. Crecimiento microbiano en medio líquido. Crecimiento microbiano en medio sólido. Concepto de muerte de un microorganismo. Medida del crecimiento y enumeración de microorganismos. Crecimiento microbiano equilibrado. Cinética de crecimiento de un cultivo estanco. Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento. Rendimiento de los cultivos. Cinética de crecimiento en un cultivo continuo. Tipos de fermentadores. Bibliografía recomendada: Cap. 1 de la 8ª edición de Brock: Biología de los microorganismos CRECIMIENTO MICROBIANO Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un único microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demográfico de una población. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y será tratada al final de este capítulo. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicación del material genético, la síntesis de componentes celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar un tamaño doble del inicial y su división por bipartición para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población. Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrónicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células que acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN, otras que están credciendo, otras que están iniciando la división celular, etc. En un cultivo sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas.

1

de NO3.017P0. Cu y Zn..61S0. el C debe estar en forma de carbono orgánico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos.72H6. etc. el N en forma de NH4. el P debe estar en forma de PO43-. MEDIOS DE CULTIVO Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. fósforo (3%). K. Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes números en un periodo de tiempo muy reducido.Microbiología General Tema 2. entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados.035K0. es necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe. La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable.95N0. Así. el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO42-. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan. El conocimiento de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más adecuado para el mismo.o de NO2. podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio. C4H7O2N lo que supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco. Mg. los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono orgánico. Mn. 2 . En general. oxígeno (32%). en ciertos casos. Co.056 esta composición puede variar ligeramente en función de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elemental más concreta es: C3.11O1.Cultivo de microorganismos.o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino. aproximadamente. por ejemplo. CULTIVO DE MICROORGANISMOS El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas. nitrógeno (14%). La fórmula elemental de un microorganismo es. Puesto que el efecto de los microorganismos es en la mayoría de los casos depende de su número. Además. químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. Mb.

Por otra parte. se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). CONCEPTO DE CULTIVO PURO Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganismos. Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el número de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento. selectivo-diferenciales cuando combinan las dos características anteriores (por ejemplo. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas. no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos. tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas.Microbiología General Tema 2. etc.01 % de las bacterias marinas son cultivables. Existen procedimientos de enriquecimiento del número de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de microorganismos hemolíticos). los medios pueden ser generales. Sin embargo. selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo.). el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli). extracto de carne. y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo).1 . Se estima que en sólo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0. Esto es debido a dificultades intrínsecas en el cultivo (microorganismos parásitos de otros). y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño. MÉTODOS DE AISLAMIENTO El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza. Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición química se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura. al desconocimiento de los requerimientos específicos de cultivo. el medio SPS para clostridios). en la mayoría de los casos. de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composición genética. los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar).0..Cultivo de microorganismos. Los cultivos puros son 3 .

Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido.. 3. se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano: 1. la fisiología de los microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros. La evolución del número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación..Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres.. por consiguiente.. 4 . CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO Si la bacteria crece en un medio líquido.Microbiología General Tema 2.Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo.Cultivo de microorganismos. esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad. 2. Sin embargo. cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio.Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo).

la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un césped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio. no hay crecimiento. La cinética de crecimiento.Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo. Si el número inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido. por ejemplo. por tanto. Por consiguiente. se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa. 5 . un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. 4. en liberación de toxinas. en este caso. Como consecuencia de esta pérdida. En estos casos. Por otra parte. podríamos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables. no se produce aumento en el número de microorganismos y. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales.. se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo.Cultivo de microorganismos. un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiológico y continuar desarrollando una actividad metabólica que se traduzca..Microbiología General Tema 2. Sin embargo. hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones físicas o químicas del entorno. En el caso de microorganismos móviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias aisladas sino formaciones más difusas o miceliares. el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SÓLIDO Las fases. parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos líquidos se presentan también en cultivos sólidos. CONCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMO Desde el punto de vista microbiológico.

La turbidez depende de la masa en suspensión y. 2. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales. 4. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de células sea del orden de 105 por ml. por unidad de volumen de cultivo. peptidoglicano. pero nos pueden dar una idea del tamaño de las partículas. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja. de ADN.Microbiología General Tema 2.Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo sólido adecuado para estimar el número de viables contando el número de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una célula aislada. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cámaras de Petroff-Hausser. es útil porque permite estudiar el crecimiento microorganismos. Por tanto. éstos se pueden recolectar por filtración a través de una membrana (de 0. Sin embargo. 6 . 5. Estos sistemas no nos indican si las partículas corresponden a células vivas o muertas. CRECIMIENTO MICROBIANO EQUILIBRADO Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que todos los parámetros del cultivo (biomasa. es necesario contar más de 300 UFC.. por tanto.) evolucionan en paralelo.Medida del número de partículas usando contadores electrónicos de partículas. 6.Medida de parámetros bioquímicos tales como la cantidad de ADN.Medida de actividad metabólica de las bacterias como que respiran producen una disminución del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxígeno (utilización de colorantes sensibles a oxidación-reducción tales como el azul de metileno).Cultivo de microorganismos. 3..2 µm de tamaño de poro) y posterior colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias.. Este es el parámetro de medida más fácil de usar en los cultivos de laboratorio. se enumeran a continuación: 1. etc. Los principales. cantidad de proteínas. número de células. etc. es principalmente un concepto de aplicación en el laboratorio (o en microbiología industrial). Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadístico... MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos.Recuento directo: consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy pequeños de suspensiones de bacterias. midiendo esta se puede estimar aquella.. proteínas. ARN.Medida de la masa de células: el sistema se basa en que las células en suspensión dispersan la luz causando la turbidez del cultivo.. La densidad de células debe ser del orden de 105 por ml.

cuándo va a completarse el crecimiento.Microbiología General Tema 2. podemos calcular el número de bacterias (N) al cabo de un número de generaciones (n) usando la ecuación siguiente: N = N0 2n (ecuación 1) siendo N0 el número de células en el momento actual. Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos para predecir cómo va a evolucionar un cultivo. Esto lleva a que una única célula (N0=1) creciendo con un τ = 20 min. Cada vez que transcurre un tiempo de generación. De esta forma.. cómo se va a acumular el producto. TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO COMO PROGRESIÓN GEOMÉTRICA Las bacterias crecen siguiendo una progresión geométrica en la que el número de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de generación (τ).000 litros. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO DISCONTINUO En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos que crecen aislados que no forman ningún tipo de estructura. por tanto. llegue a poder producir 4. sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han podido duplicar su masa y su material genético. El número de generaciones se puede calcular de la siguiente forma: n=t/τ donde t es el tiempo transcurrido. Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden. 7 .7 x 1021 células en 24 horas. el número de células se duplica. Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las bacterias. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10. El tiempo que tarda una célula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generación (τ) y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Por consiguiente. combinando las ecuaciones 1 y 2: N = N0 2t/τ (ecuación 3) (ecuación 2) Los tiempos de generación de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de τ de 20 min). un incremento exponencial. cómo va a ir consumiéndose el substrato y cómo se van a ir acumulando los productos del cultivo. con el coste que ello supone. etc.Cultivo de microorganismos. por ejemplo. siguiendo. puesto que no podemos predecir qué va a pasar.

por ello es mejor transformarlas en otras más simples. ácidos nucleicos etc. Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células. biomasa. en la ecuación anterior N puede representar cualquiera de estos factores.. 8 . el crecimiento tendrá poca pendiente (será lento) y si τ es pequeño el crecimiento será rápido. etc. biomasa de cultivo. la ecuación que describe la cinética es la siguiente: dN/dt = µN (ecuación 5) esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al número de células presentes en el cultivo (N). acumulación de metabolitos primarios. TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DE LA TASA DE CRECIMIENTO µ Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). o bien. tomamos logaritmos en los dos términos y resulta: lnN = lnN0 + (t/τ) ln2 (ecuación 4) Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de una constante igual a ln2/τ. podemos concluir que µ = ln2/τ y. que τ = ln2/µ. Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente.Microbiología General Tema 2. Si el tiempo de generación τ es muy grande. Es decir. etc. Para transformar una ecuación exponencial en una recta. proteínas. que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación (τ). después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ. Integrando la ecuación anterior durante el tiempo de cultivo. masa celular. Comparando esta ecuación (7) con la similar presentada más arriba (4). En este caso. A la constante de proporcionalidad (µ) se le denomina tasa de crecimiento. En un crecimiento equilibrado. poder calcular la tasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento en el número de células. por consiguiente. Por tanto.Cultivo de microorganismos. todos los parámetros de crecimiento (número de células.) evolucionan en paralelo. se transforma en la siguiente función exponencial: N = N0 eµt (ecuación 6) la transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente: lnN = lnN0 + µt (ecuación 7) esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ.

El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1. el metabolismo celular se enlentece y las células paran de crecer.15 15 .35 ºC). Por tanto.35 Mesófilo 5 .75 60 .8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 . 1. se produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío. la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada.45 35 .FACTORES FÍSICOS Y QUÍMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO. Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas. Tipo de Temperatura Temperatura Temperatura microorganismo mínima óptima máxima Psicrófilo -5 +5 12 . máxima y óptima. cuando la temperatura es superior a la óptima.30 30 . Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento mínima. podemos observar una temperatura mínima por debajo de la que no hay crecimiento.5 y 2..Cultivo de microorganismos. Sin embargo. a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es máxima.. Si estudiamos la variación de la velocidad de crecimiento en función de la temperatura de cultivo.45 55 . aunque no tienen porqué morir. Por encima de esta temperatura óptima. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura.90 Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 .. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar.20 Psicrótrofo -5 +5 25 . 9 . se les puede considerar como psicrófilos facultativos. La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de las proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas. La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento por la reducción de la velocidad de reacción y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. En términos generales.15 30 . 12.47 Termófilo 40 .Microbiología General Tema 2.

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja. En función de su tolerancia a ambientes con baja aw. 3.80. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo. En este último caso. los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (mucho más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. 2. sin embargo. respectivamente. sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. De hecho. la actividad de agua es mucho menor que en el primero. Como puede verse. en muchos casos. El pH interno en la mayoría de los microorganismo está en el rango de 6. su crecimiento se detiene.pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. La utilización de almíbares. el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. tanto mesófilos como psicrófilos..85. El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR). los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son.Microbiología General Tema 2. los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que.0. En el caso de las esporas.90. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio.Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0). levaduras aw>0. El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente.0 a 7.Cultivo de microorganismos. 10 .. la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. hongos filamentosos aw >0. disminuye su actividad de agua. La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. psicrótrofos y termófilos pueden producir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias. salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatación de los iones de la sal disuelta. halófilos y xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas. a título orientativo. la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo. Los microorganismos capaces de producir infecciones son los mesófilos y algunos psicrótrofos ya que sus temperaturas óptimas de crecimiento coinciden con las corporales. los siguientes: bacterias aw >0. La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria..

Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entéricas.. cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables. mientras que otros necesitan ambientes reductores. En este sentido. De esta forma.5).Microbiología General Tema 2. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento. sin embargo. hay que tener en cuenta que la acción bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. por ejemplo. distintos. Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxígeno (anaerobios) que. Esto es. El efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conservación de alimentos acidificándolos.0 Hay que considerar que. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son. el pH del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. o como Saccharomyces cerevisiae. o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). por ejemplo) y la producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas. llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de 11 . esto es: sus características oxidantes o reductoras. como consecuencia del metabolismo. aunque no el único. por ejemplo). Por otra parte. los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos. 4. uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico. En general. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox. acético. las bacterias competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante. La bajada del pH se puede deber a varios factores. la adición de ácido acético en forma de vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches. De esta forma. la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. las bacterias lácticas que producen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4. es la concentración de oxígeno [O2].Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar electrones.. también. láctico) por ciertas bacterias.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10.Cultivo de microorganismos. Así. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer.

Las células se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superóxido dismutasa (SOD) y catalasa. El gráfico siguiente representa la variación de la biomasa (o número de células. fermentativo. las bacterias que "respiran" nitratos (NO3-). aunque viven en presencia de oxígeno.. 13. se va consumiendo un substrato cuya concentración decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Definiremos el rendimiento de utilización del substrato (Ys) al valor que representa la cantidad de biomasa producida por unidad de substrato consumido: 12 .Cultivo de microorganismos. etc. membranas y ácidos nucleicos produciendo la muerte de las células. Hay microorganismos que.Microbiología General Tema 2. formas superóxido) que pueden dañar las proteínas. En el curso de ciertas reacciones metabólicas redox se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres. En este cultivo. por ejemplo).) de un cultivo a lo largo del tiempo. no son capaces de utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lácticas que son anaerobias aerotolerantes. Por ejemplo. hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. La detección de estas enzimas tiene valor taxonómico. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia.. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno.RENDIMIENTO DE LOS CULTIVOS. Por otra parte. electrones que actúa como oxidante ambiental. sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgánicos oxidados (respiración anaerobia).

qs = Ys/µ (ecuación 12) Asimismo.Microbiología General Tema 2. por ejemplo) o de carbono presente en las células (aproximadamente el 50% de la masa celular corresponde a carbono). 1 13 . varía entre diferentes microorganismos (hay microorganismos que "engordan" más que otras comiendo lo mismo) y varía también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno). Haciendo las transformaciones que se indican a continuación sobre la fórmula que relaciona la variación de biomasa con la de substrato (8). Podemos calcular el rendimiento de la utilización del substrato en función de la cantidad de substrato añadido al cultivo. la tasa específica de consumo de substrato (qs) la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. podemos calcular la cantidad de biomasa total (gramos de células. también mayor será la tasa de crecimiento. µ = Ys qs (ecuación 11) (ecuación 8) (ecuación 9) (ecuación 10) Esto es. o en función de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo). Evidentemente.Cultivo de microorganismos. Ys = dN/dS dN/dt = Ys (dS/dt) (dN/dt)/N = Ys (dS/dt)/N como. cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor será la tasa de crecimiento (µ). A esta relación inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur. Ys = dN/dS (ecuación 8) El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos.. o alimentos. cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido. el rendimiento disminuye). Asimismo. llegamos a la definición de un nuevo concepto qs denominado tasa específica de consumo de substrato por el organismo. hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento más bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa. La expresión "3engordar" está usada de forma metafórica: las bacterias no engordan. También varía el rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos serán revisados más adelante). µ = (dN/dt)/N. de acuerdo con la ecuación (5). Sin embargo. La uso porque resulta útil esta metáfora antropòmórfica para entender algunos de los conceptos relacionados con el rendimiento de cultivos. que "engordan"1 más que otros).

En la práctica. En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo el tiempo de cultivo. sí existe ese efecto. Este tipo de cultivo es también importante en los estudios de fisiología y de ecología microbiana. metabolitos secundarios. etc.CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO CONTINUO. pero cuando el substrato se hace limitante. Por último.Cultivo de microorganismos. de la concentración de substrato (S) y de un valor constante.. La ecuación de Monod tendrá mucha importancia al tratar de cultivos continuos. En la naturaleza un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto de procesos microbianos intestinales de todos los animales. En un cultivo continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constante porque se añade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos nutrientes) y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes) a la misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante. Estos parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación: 14 . QUIMIOSTATO El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen tener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la concentración de substrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la máxima) 14. Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estén creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente productos de interés (biomasa. que representa la concentración de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la máxima. lo que indica que los microorganismos crecen con tasas (µ) muy próximas a las máximas (µmax) a concentraciones de substrato bajas y sólo cuando estas son extremadamente bajas. Ks.Microbiología General Tema 2. La expresión matemática que relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación de Monod y es la siguiente: µ = µmax [S/(Ks+S)] (ecuación 13) En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima que puede alcanzar el microorganismo (µmax). la velocidad de crecimiento se reduce. los valores de Ks suelen ser muy bajos.). Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes se van consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho. Para que se cumpla esta ecuación el rendimiento debe ser independiente de la concentración de substrato. la concentración de este no afecta al valor de µ. En condiciones de substrato abundante. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante).. nos falta relacionar la tasa de crecimiento (µ) con la concentración de substrato (S).

velocidad de dilución D se iguala a la tasa de crecimiento µ. El valor D indica el número de volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo.. la situación fisiológica del orga 15 . D = f/V (ecuación 14) donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml.Microbiología General Tema 2. La velocidad de crecimiento aumenta (µ aumenta y τ disminuye) cuando la energía aportada por los nutrientes entrantes supera la energía de mantenimiento de los microorganismos del cultivo. Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato está dentro del reactor. de esa forma. pequeños incrementos de la velocidad de dilución producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan más nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento (µ) según lo indicado en la ecuación de Monod (ecuación 13). de forma que el control de la tasa de dilución (control del flujo f) permite regular la tasa de crecimiento y. A valores bajos de D la concentración de nutriente limitante (S) en el efluente es baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que alcanzan unas poblaciones de gran tamaño creciendo a una tasa (µ) baja porque se encuentran en condiciones de limitación de nutrientes (S<Ks).Cultivo de microorganismos. En una situación de equilibrio (steady state). densidad celular o biomasa Tiempo de generación concentración de substrato Velocidad de dilución A velocidades de D muy bajas. las dimensiones de D son [h-1]. A valores más altos de D no todo el nutriente es consumido por los microorganismos del cultivo por lo que S en el efluente aumenta. Tanto la tasa de crecimiento µ como el nivel de población microbiana están relacionados con el valor de D. Por consiguiente.

ya que en los cáculos se partía de esta condición para poder reformular la ecuación de Monod. podemos calcular la producción de biomasa en el fermentador con las siguiente ecuaciones Ñ = Ys(SR-Sr) Ñ = Ys{SR-[DKs/(µmax-D)]} (ecuación 18) (ecuación 19) Estas ecuaciones nos permiten modular la cantidad de biomasa producida o la cantidad de substrato consumido regulando la tasa de dilución del fermentador.DX (ecuación 15) Por consiguiente. el microorganismo no es capaz de crecer lo suficiente como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y. considerando que el substrato consumido en el fermentador (SR-Sr) es transformado en biomasa durante el estado estacionario (Ñ) con un rendimiento Ys. Despejando de la ecuación 16 el valor de Sr en función de los demás. TURBIDOSTATOS En realidad. A valores de D> µmax.2 Habida cuenta de que en el estado estacionario D = µ. La evolución de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuación siguiente: dX/dt = crecimiento . esto no es una demostración de que en el steady state las tasas de dilución y crecimiento se igualan. En el steady-state. por consiguiente S alcanza un valor máximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la concentración del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos (µ) dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece). 2 16 . nismo. si µ > D hay un incremento positivo de la población en el quimiostato. µ = D como se había explicado anteriormente. se obtiene la ecuación siguiente: Sr = DKs/(µmax-D) (ecuación 17) que permite calcular cómo varía la concentración del nutriente limitante en el efluente en función de la tasa de dilución D.salida = µX .. la ecuación de Monod ((13) puede reformularse en los siguientes términos D = µmax [Sr/(Ks+Sr)] (ecuación 16) donde Sr es la concentración de nutriente limitante en el efluente del cultivo continuo. Si llamamos SR a la concentración de nutriente limitante que entra en el fermentador y Sr la concentración de este nutriente en el efluente.Cultivo de microorganismos. como (dN/dt) = 0. cuando µ = D el tamaño de la población se mantendrá estable (equilibrio) y si µ < D la población disminuirá como consecuencia de la dilución de las bacterias.Microbiología General Tema 2.

mientras que el quimiostato a valores de D bajos. la producción de penicilina se realiza mediante un cultivo de estas características. sistemas de ajuste de pH mediante la adición de ácidos o bases.Cultivo de microorganismos. Por ejemplo.. la altura máxima de un tanque de fermentación se sitúa en los 15 m ya que por encima de esa altura se alcanzan valores de presión inhibidores. En general. CULTIVO SEMI-CONTINUO Un cultivo semi-continuo (feed-batch) es un cultivo estanco al que se añaden en diferentes momentos nutrientes concentrados para permitir un mayor crecimiento o una producción más efectiva de metabolitos secundarios. 15.Microbiología General Tema 2. El diseño de un fermentador líquido requiere tener en cuenta una serie de factores que influyen en el crecimiento. Por otra parte. es variable. y en el rendimiento del proceso: temperatura. el diseño físico de los fermentadores líquidos tienen que incluir la presencia de sondas que permitan medir estos parámetros durante el cultivo y de sistemas que permitan corregir las desviaciones que se puedan producir (sistemas de refrigeración para control de temperatura. Tienen especial importancia dos problemas: la agitación destinada a asegurar una mezcla correcta de los ingredientes del medio y de los microorganismos que crecen en él.. El valor D en un turbidostato.TIPOS DE FERMENTADORES Podemos distinguir dos grandes tipos de fermentadores según el estado del medio de cultivo: fementadores líquidos y sólidos. y la aireación.). etc. FERMENTADORES LÍQUIDOS En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desarrollan flotando libremente en el volumen de medio de cultivo o formando agregados más o menos esféricos (pellets) en el caso de los cultivos de hongos. etc. En un cultivo de estas características el nutriente añadido suele ser una fuente que aporte el carbono necesario para obtener energía y elementos para la síntesis de los metabolitos secundarios de interés. por tanto. Los turbidostatos funcionan mejor valores de D altos. en un turbidostato el medio de cultivo no contiene nutrientes limitantes. Un aspecto adicional que considerar en el diseño de un fermentador es la presión hidrostática que se alcanza en su base y que puede limitar el crecimiento de microorganismos. 17 . Este tipo de cultivos se denomina en ocasiones cultivo sumergido. Por consiguiente. aireación. El segundo tipo de cultivo continuo es el turbidostato en el que se ajusta la velocidad de dilución de tal forma que la densidad óptica del cultivo se mantiene constante. pH.

. pero operado al revés.Microbiología General Tema 2. es un fermentador similar al anterior. La agitación se consigue por un sistema de palas unidas a un eje y un motor y por las turbulencias creadas por un sistema de bafles adosados a las paredes de la cuba de fermentación. La aireación se consigue por un difusor de aire que emite desde la parte inferior de la cuba de fermentación. El principal problema de estos fermentadores es el elevado coste del sistema mecánico de agitación. la entrada de aire produce un convección que se canaliza por un tubo vertical interior en la cuba. Fermentadores en tanque Son los fermentadores más sencillos. las burbujas de aire van aumentando de tamaño conforme ascienden por el tubo interior por lo que su relación superficie/volumen disminuye y la transferencia de oxígeno al cultivo es menor. La aireación también permite reducir la cantidad de calor producida durante la fermentación. La transferencia de oxígeno al cultivo se hace por las burbujas que van ascendiendo por el volumen de cultivo. Fermentadores Air-lift En estos fermentadores la agitación y a aireación se logran mediante la inyección de aire por la parte inferior de la cuba de fermentación. y a partir de ahí las burbujas vuelven a crecer al ascender por la parte exterior de la cuba de fermentación. principalmente cuando se realizan cultivos de hongos filamentosos en los que la viscosidad debida al micelio aumenta mucho. 18 .Cultivo de microorganismos. En este fermentador. Fermentadores Deep-Jet En ellos el aire se inyecta a presión desde la parte superior de la cuba de fermentación de forma que las burbujas de aire se van haciendo más pequeñas (mejor transferencia de oxígeno) hasta llegar al final del cilindro interior. En la práctica.

Bandejas 3. existen sistemas semisólidos en los que los microorganismos están adheridos a superficies estáticas y los nutrientes pasan por filtración o goteo a través de ellos (sistema de la producción de vinagre por goteo). FERMENTADORES SÓLIDOS En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desarrollan en la superficie del substrato o penetrando en él. Sistema de lecho (bed system) Por otra parte. etc.) y también la que tiene lugar en los procesos de compostaje de residuos orgánicos.Microbiología General Tema 2. koji.Cultivo de microorganismos.. Hay varios modelos de fermentadores sólidos: 1. o los microorganismos se encuentran formando agregados que se mantienen en suspensión por medio de una corriente de medio de cultivo líquido (reactores de lecho fluidificado). Tambor 2. 19 . Es un tipo de fermentación muy aplicada en la producción de algunos alimentos (setas cultivadas.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful