2011 - 2 Cultivo de Tejidos I

Agrobiotecnologa
Curso 2011
Cultivo de tejidos vegetales I

Mara Mercedes Rivero
Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires
Sumario
Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales Micropropagacin vegetal Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis Sistemas de micropropagacin vegetal. Proliferacin de yemas axilares o apicales Sistemas de micropropagacin vegetal. Proliferacin de yemas axilares o apicales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Sistemas de micropropagacin vegetal Cultivo de meristemas Sistemas de micropropagacin vegetal Liberacin de patgenos
Sumario
Conservacin de germoplasma Cultivo in vitro de clulas haploides y de embriones
-Cultivo de anteras -Cultivo de polen -Cultivo de vulos -Cultivo de embriones
Semillas sintticas Cultivo de protoplastos Variacin somaclonal

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Referencias
Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales
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Principales conceptos fisiolgicos aplicables a los cultivos in vitro
Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- Desdiferenciacin / Rediferenciacin
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- Balance de reguladores del crecimiento vegetal
Fundamentos tericos y prcticos del cultivo de tejidos vegetales
La teora de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo XX, postula que toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc. La desdiferenciacin consiste en la transformacin y prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta es la redifereciacin de las clulas previamente desdiferenciadas.
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Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales
Micropropagacin vegetal Regeneracin de plantas (embriognesis y organognesis) Cultivo de meristemas Cultivo de suspensiones de clulas vegetales Cultivo de protoplastos Cultivo de anteras Cultivo de vulos y embriones
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Micropropagacin vegetal
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La micropropagacin constituye la principal aplicacin comercial del cultivo de tejidos vegetales
La micropropagacin vegetal, o propagacin clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtencin y cultivo de plantas a gran escala. Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sinttico nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperodo.
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Alcances de la micropropagacin vegetal
Propagacin vegetativa rpida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicacin de plantas recalcitrantes a las tcnicas convencionales Reduccin en el tiempo de multiplicacin y en el espacio requerido para tal fin Mayor control sobre la sanidad del material propagado Introduccin rpida de nuevos cultivares
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Conservacin de germoplasma Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal
Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas
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La micropropagacin requiere una infraestructura mnima especializada y condiciones controladas de cultivo
Laboratorio
- Area de preparacin de medios - Area de lavado y esterilizacin - Cuarto estril - Cmara de cultivo - Area de rusticacin
Material vegetal
- Plantas madres seleccionadas (preacondicionamiento) - Explantos (eleccin, diseccin, esterilizacin, etc.)
Condiciones de cultivo
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- Asepsia - Recipientes - Temperatura - Luz y fotoperodo
Medios de cultivo: composicin general
Compuestos inorgnicos Macronutrientes: NO4- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotnico (C) Biotina Aminocidos Glicina
Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semislidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite pH 5,6 5,8 Esterilizacin 1 atmsfera, 15 a 20 min en autoclave
Formulacin bsica de un medio de cultivo para tejidos vegetales
Soluciones concentradas de macroelementos (100x) Soluciones concentradas de microelementos (100x) Vitaminas grupo B (500 1000x) Mio-inositol (100 mg/L) Azcares: sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extrado a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L
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Propiedades fsicas de los medios de cultivo
Semislido Consistencia del medio Lquido

El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las caractersticas del medio de cultivo (lquido o semi-slido). En el caso de un medio slido, la concentracin y calidad del gar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.) El cultivo en medio lquido resulta imprescindible cuando la propagacin in vitro es desarrollada a travs de las siguientes vas: - Induccin de embriognesis - Cultivo de protoplastos - Cultivo de suspensiones celulares
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Propiedades fsicas de los medios de cultivo
Intercambio gaseoso:
Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno (Resinite ) para posibilitar el intercambio de gases. La organognesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.
- La induccin de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxgeno - La acumulacin de etileno puede inhibir la regeneracin de brotes
pH:
- Constituye un factor crtico - Se ajusta en el rango 5,5-5,8 - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos
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Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Concentracin en el medio de cultivo (mg/L)
Compuesto White Ca(NO3)2 KNO3 NaNO3 NH4NO3 NH4H2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O KCl KH2PO4 NaH2PO4.H2O MnSO4.H2O MnSO4.4H2O KI H3BO3 ZnSO4.7H20 CuSO4 CuSO4.5H2O NaMoO4.2H2O 142 81 74 65 12 Schenk y Hildebrandt (SH) 2.500 300 400 200 10 1 5 1 0,2 0,1 Gamborg (B5 300 134 500 150 150 10 0,75 3 2 0,025 0,25 Heller 600 250 75 750 125 0,1 0,01 1 1 0,03 Murashige y Skoog 1.900 1.650 370 440 170 22,3 0,83 6,2 8,6 0,025 0,25
Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Concentracin en el medio de cultivo (mg/L)
Compuesto
White CoCl2.6H2O AlCl3 NiCl2.6H2O FeCl3.6H2O FeSO4.7H2O Fe(SO4)3 Sequestrene 330 Fe Na2EDTA Mio-inositol Tiamina-HCl Acido nicotnico Piridoxina-HCl Extracto de Levadura Sacarosa pH 2,46 100 20.000 Schenk y Hildebrandt (SH) 0,1 15 20 1.000 5 5 0,5 30.000 5,9 Gamborg B5 0,025 28 100 10 1 1 20.000 5,5 Heller 0,03 0,03 1 Murashige y Skoog (MS) 0,025 27,86 37,26 100 0,4 30.000 5,8
Reguladores del crecimiento comnmente usados en medios de cultivos vegetales

Clase Auxina Nombre Acido clorofenoxiactico Acido 2,4diclorofenoxiactico Acido indol 3-actico Acido 3-indolbutrico Acido 1-naftalenoactico Acido -naftoxiactico Citoquininas 6-bencilaminopurina N-isopentenilaminopurina 6-furfurilaminopurina (kinetina) Zeatina Abreviatura pCPA 2,4-D AIA IBA NAA NOA BAP 2iP K Zea Peso Molecular 186,6 221,0 175,2 203,2 186,2 202,2 225,2 203,3 215,2 219,2 Rango de concentracin (M) 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 Es termolbil, no debe ser autoclavada. Es comnmente necesario para la iniciacin o el mantenimiento de callos y cultivos en suspensin. Algunas veces necesario para la regeneracin de plntulas. Las citoquininas son normalmente disueltas en NaOH diludas o en etanol acuoso La zeatina es termolbil y no debera ser autoclavada Las auxinas son usualmente tituladas en solucin con NaOH El AIA puede ser oxidado por clulas vegetales. Es frecuentemente usado como nica fuente de auxinas en el medio de cultivo Preparacin de solucin stock Comentarios
Giberelina
Acido giberelico
GA3
364,4
10-7-5x10-6
Soluble en agua
Reguladores del crecimiento
Grupos bsicos de reguladores del crecimiento: - Auxinas - Citoquininas - Giberelinas - Acido abscsico - Etileno Generalidades: - Actan a bajas concentraciones - Interactan unos con otros (los resultados estn determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). - Los reguladores endgenos del crecimiento estn presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentracin flucta. Su concentracin relativa vara en funcin del estado fisiolgico de la planta y en cada uno de los rganos de sta. - Estn involucrados en numerosos procesos fisiolgicos.
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Las auxinas se emplean como promotores de la proliferacin celular y la induccin de la morfognesis
O Acido indol actico (AIA) (auxina endgena)
OH N
Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongacin y de la respuesta fototrpica del coleoptile de gramneas. - Alargamiento y divisin celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formacin de races adventcias - Dominancia apical - Accin herbicida - Estimulacin de la produccin de etileno Se sintetizan en las yemas, hojas jvenes, frutos y en el embrin. La concentracin endgena en la planta vara entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.
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Su transporte es polar Auxinas sintticas: - Acido indol butrico (IBA) - Acido naftalen actico (ANA) - 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)
Las citoquininas determinan diferentes respuestas morfogenticas en combinacin con las auxinas
Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la divisin celular in vitro. Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas: - Promocin de la divisin celular - Promocin de la organognesis (relacin auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia - Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos Citoquininas endgenas: - Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP) Citoquininas sintticas: - Kinetina (Kin) - Benziladenina (BAP)
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Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentran en todos los tejidos. La concentracin endgena en plantas vara entre 0,1 y 500 g/Kg. Su transporte es no polar.
Las giberelinas favorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes
O Acido giberlico (GA3) HO H CH3 C O H H COOH CH3 OH
Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinas diferentes. Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinacin de semillas en dormicin - Floracin - Movilizacin de reservas en la semilla
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Se sintetizan en hojas jvenes, en yemas y en el embrin. Su transporte no es polar.
Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores
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El proceso de micropropagacin de especies vegetales consta de varias etapas
Eleccin de una planta madre selecta Explantos

ETAPA 1
Desinfeccin superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicacin

ETAPA 2
Formacin de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Pasaje a maceta en un invernculo
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ETAPA 3
ETAPA 4
Eleccin del explanto inicial

MS + 2,4-D
Escarificacin Esterilizacin
Tritn X-100 3%, 10 min Hipoclorito de Na 15%, 20 min
Semillas estriles Germinacin

Esterilidad Medio de Hoagland
% de germinacin?
M. apical Hoja M. axilar Tallo Raz M. radicular
Diseccin bajo lupa
Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo
Protocolo tipo de esterilizacin superficial de material vegetal:

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg. - Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diludas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. - Enjuagues con abundante H2O estril (4 5 veces).
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- En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difcil de eliminar.
Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Ambiente Respuesta Sin respuesta Cultivo infectado Explanto (asepsia) Regeneracin indirecta Regeneracin directa
Cultivo
Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis
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Existen dos posibles vas morfogenticas para la diferenciacin de novo de brotes o plantas completas
Posibles vas morfogenticas: - Organognesis - Embriognesis Diferencias entre las dos posibles vas:
- La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de clulas del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un rgano vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas. - La embriognesis se presupone de origen unicelular. Una clula del explanto se asla y constituye el punto de partida para la obtencin de un embrin somtico. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es una planta completa.
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Fotomicrografas de las dos vas morfogenticas

Organognesis
d pf pf
Embriognesis
av
cv
ar
Propagacin vegetativa por embriognesis somtica
Explanto (disco de hoja) Callo
Explanto (clulas vegetales)
REGENERACIN
Suspensin celular
Embriones somticos GERMINACIN ENCAPSULACIN
GERMINACIN
Semilla artificial
Sistemas de micropropagacin vegetal Proliferacin de yemas axilares o apicales
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Propagacin vegetativa a partir de yemas preexistentes
Proliferacin de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicacin de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleracin in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas. - La tasa de multiplicacin (tm) se calcula en base al nmero de brotes o vstagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestin, entre otras variables. - Por ejemplo, con una tm de 5/mes podran obtenerse 10.000.000 plantas en un solo ao a partir de una nica yema inicial. - El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta tcnica.
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Sistemas de micropropagacin vegetal Proliferacin de tejidos desdiferenciados
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Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro
Consideraciones generales:
- Callo: masa de clulas desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, clulas en suspensin, etc.) - Es posible regenerar brotes o vstagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagacin clonal a gran escala.
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Sistemas de propagacin vegetativa in vitro Regeneracin directa e indirecta

Explanto (disco de tejido) Explanto (suspensin de clulas)
Regeneracin directa
Regeneracin indirecta
Formacin directa de brotes
Callo
Formacin indirecta de brotes Planta regenerada
Sistemas de propagacin vegetativa in vitro
Propagacin vegetativa in vitro Regeneracin directa e indirecta
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Sistemas de micropropagacin vegetal Cultivo de meristemas
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El empleo de meristemas como explantos es una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas
Cultivo de meristemas
Meristema apical
Meristema axilar
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Domo meristemtico
Los meristemas son grupos de clulas indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta
Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes rganos
Posibilitan la micropropagacin de diferentes especies

vegetales.
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Constituyen el explanto ideal para liberar de patgenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias. Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservacin y conservacin de germoplasma.
Aplicaciones del cultivo de tejidos: Liberacin de patgenos
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El cultivo de meristemas facilita la eliminacin de patgenos
- El domo meristemtico no est vascularizado (muchos patgenos se translocan por los tejidos de conduccin).
- El nmero de partculas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de divisin celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicacin de un virus.
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- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.
El cultivo de tejidos posibilita el saneamiento de las plantas multiplicadas vegetativamente
Mediante esta tcnica es posible sanear plantas infectadas sistmicamente por diferentes tipos de patgenos como bacterias, hongos, virus y viroides.
Sntomas producidos por el Tomato mosaic virus.
Partculas de Potato virus Y
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El tratamiento de plantas madres puede efectuarse por distintas tcnicas
El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes tcnicas:
Termoterapia Quimioterapia Cultivo de meristemas
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Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan su efectividad notablemente cuando se los combina, trabajando in vivo e in vitro.
Consideraciones prcticas para el saneamiento de plantas madres por termoterapia
Termoterapia
El tratamiento por calor es un mtodo eficaz para inactivar algunos virus y viroides. Se debe elegir una temperatura y tiempo de tratamiento tales que la planta sea capaz de sobrevivir, pero que permita la inactivacin del virus.
Ejemplo: El tratamiento de plantas madres de Solanum tuberosum a 8C durante 4 meses permiten obtener un 30% de platas libres de Potato spindle tuber viroid (PSTV).
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Sintomas inducidos por PSTV en tubrculos de papa
Aspectos prcticos del saneamiento de material vegetal por quimioterapia
Quimioterapia
Esta tcnica implica el tratamiento de las plantas madres o explantos (in vivo o in vitro) con las siguientes sustancias: - Fungicidas en el caso de hongos - Insecticidas frente al ataque de insectos - Antibiticos en el caso de bacterias - Inhibidores metablicos (actinomicina D)
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- Anlogos de aminocidos (fluorofeniladenina)
La metodologa de saneamiento empleada debe ser evaluada
Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminado el patgeno considerado. Estas pruebas se denominan ensayos de indizacin (indexing) y difieren segn el sistema huesped-patgeno de que se trate. Se incluyen entre estas pruebas:
- Seleccin visual u observacin de sntomas - Empleo de hospedantes indicadores
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- Mtodos serolgicos - Microscopa electrnica
Observacin visual
Consiste en la observacin de sntomas. Se trata de un mtodo impreciso. Resulta confiable en el caso de enfermedades que inducen sntomas muy caractersticos o conspcuos.
Potato Virus X
Coliflower Black Rot Agrobiotecnologa

Enfermedades bacterianas y/o virales con sntomas distintivos
Mosaico clortico producido por Tomato mosaic virus en tomate
Sntomas de pie negro y podredumbre blanda causados por Erwinia carotovora en papa.
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Pie negro Tubrculo inoculado con E. carotovora Tuberculo no inoculado
Sntomas de enfermedades causadas por hongos
Antracnosis en Fragaria spp. causada por Colletotrichum
Sntomas en estolones
Sntomas en frutos
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Powdery Mildew en Solanum tuberosum causado por Erysiphe spp.
Sntomas de enfermedades causados por nematodes
Disminucin de tamao causada por nematodes en maz
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Micrografas de un nematode del gnero Trichodorus (tamao aproximado: 0,5 M de dimetro, 1 mm de largo).
Empleo de hospedantes indicadores
Es una tcnica frecuentemente utilizada para detectar virus que pueden transmitirse mediante el jugo infeccioso extrado de plantas enfermas.
Se usan como indicadoras variedades muy susceptibles de la especie estudiada u otras especies que desarrollan sntomas caractersticos en un corto tiempo.
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Los sntomas inducidos en la planta indicadora revelan la presencia del patgeno y permiten identificarlo.
Mtodos serolgicos
Se basan en la alta especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo, por la cual un anticuerpo reconoce y se combina slo con la porcin de antgeno que le dio origen.
- Pruebas inmunoenzimticas
(DAS-ELISA) - Floculacin de ltex sensibilizado (partculas de ltex recubiertas por anticuerpos especficos, se observa agregacin de partculas con formacin de precipitado) - Microprecipitacin (gotas de antisuero y antgeno, se observa formacin de precipitado)
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Microscopa electrnica
Observacin de partculas virales en extractos vegetales (dip method) Inmunoelectromicroscopa Cortes ultrafinos de tejidos vegetales (observacin directa del patgeno o de anomalas citolgicas o efectos histopatolgicos como secuela de la presencia del patgeno)
Inclusiones virales detectadas con el microscopio ptico
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Cultivo de tejidos vegetales Inclusin cristalina del virus del mosaico de tabaco (I) en clulas epidrmicas de Nicotiana tabacum Clula de tricoma de Vicia faba con inclusin amorfa (I)
La metodologa de saneamiento empleada debe ser evaluada
Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminado el patgeno considerado. Estas pruebas se denominan ensayos de indizacin (indexing) y difieren segn el sistema huesped-patgeno de que se trate. Se incluyen entre estas pruebas:
- Seleccin visual u observacin de sntomas - Empleo de hospedantes indicadores
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- Mtodos serolgicos - Microscopa electrnica
Conservacin de germoplasma
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Conservacin de germoplasma
Las tcnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales costituyen parte esencial de una estrategia general para la conservacin e intercambio de recursos fitogenticos.
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Gentillieza W. Roca
Existen diferentes mtodos para la conservacin de germoplasma
Colecciones in vitro Bancos de semillas Crioconservacin
Agrobiotecnologa
www.cgiar.org
Bancos de germoplasma in vitro
La conservacin de germoplasma mediante el cultivo de tejidos se basa en la limitacin del crecimiento del material vegetal.
Implementacin:
- Medios de cultivo de composicin subptima - Baja intensidad lumnica (<500 lux) - Temperaturas inferiores a las adecuadas para el activo metabolismo de las clulas y tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 C)
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- Alta concentracin de compuestos osmticamente activos (sacarosa, manitol)
Los bancos de semilla permiten la conservacin de especies vegetales que se propagan sexualmente
Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas semillas se mantienen viables durante un largo perodo de almacenamiento. El material debe mantenerse bajo condiciones controladas en una cmara de mantenimiento:
- Bajas temperaturas - Bajo contenido de humedad
Este mtodo no puede aplicarse a la conservacin de plantas cuyas semillas presentan longevidad reducida, especies autoincompatibles o especies de propagacin vegetativa obligada
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Crioconservacin de germoplasma
Consiste en el mantenimiento de material vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 C), por inmersin en nitrgeno lquido Diferentes explantos (pices de yemas, meristemas, anteras, embriones inmaduros) as como callos y suspensiones celulares pueden ser crioconservados a -196 C.
Agrobiotecnologa
www.science.siu.edu
Etapas del proceso de crioconservacin de material vegetal
Crioproteccin Congelamiento Almacenamiento Descongelamiento Pruebas de viabilidad
Agrobiotecnologa
Recultivo
Crioconservacin y cultivo de meristemas de soja
Cultivo in vitro de clulas haploides y embriones
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo in vitro de clulas haploides
Mejoramiento vegetal.
Estudios de gentica cuantitativa.
Estudios de diferenciacin celular y alternancia de generaciones.
Agrobiotecnologa
Ttradas de microsporas Sacos polnicos (con granos de polen)
Cultivo in vitro de anteras
Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en medios sintticos que promueven la divisin celular y la formacin de embriones o callos. Los embriones, transferidos a un medio de regeneracin, darn lugar a plantas haploides.
anteras
Agrobiotecnologa
Condiciones que afectan el cultivo de anteras
- Genotipo de las plantas donantes - Fisiologa de las plantas donantes - Caracterizacin citolgica y bioqumica de etapas muy tempranas del desarrollo de los granos de polen - Pretratamiento de las anteras con altas o bajas temperaturas o con choque osmtico - Medios de cultivo con alto contenido en osmticos para la induccin de callos y menores concentraciones de sacarosa para la regeneracin de plantas
Agrobiotecnologa
El cultivo de anteras ofrece numerosas ventajas para el mejoramiento de plantas de inters comercial
- Permite la expresin e identificacin de alelos recesivos - Constituye una fuente til para el mejoramiento intravarietal - Permite la rpida introduccin de caracteres citoplasmticos en un fondo gentico homocigtico - Crea y acrecienta las reservas citogenticas y citoplasmticas de los cultivos - La obtencin de haploides duplicados resulta til para el desarrollo de nuevas variedades con el fin de distribuirlas en ambientes ecolgicos muy diversos y para ensayarlas en ellos. - Las microsporas o clulas haploides pueden usarse para la induccin de mutantes y para la seleccin de caracteres esporofticos.
Agrobiotecnologa
El cultivo de embriones inmaduros permite realizar diferentes aplicaciones
Estudio de requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo. Rescate de embriones hbridos derivados de cruzamientos interespecficos e intergenricos. Producin de monoploides. Superacin de la latencia de las semillas.
Embrin cigtico
Agrobiotecnologa
Corte longitudinal de una semilla de Brassica
Aplicaciones del cultivo de vulos
Rescate de embriones (mediante polinizacin y fertilizacin in vitro) Induccin de la embriognesis somtica a partir de nucelos de diferentes especies vegetales.
es
Agrobiotecnologa
Embriones somticos (es) obtenidos a partir del cultivo de vulos de Arabidopsis.
Semillas sintticas
Agrobiotecnologa
Semillas sintticas
Embriones somticos de Pinus sp
Agrobiotecnologa
Las semillas artificiales reproducen la estructura de una semilla de origen sexual
Las semillas artificiales poseen una cubierta de proteccin, contienen sustancias de reserva y portan un embrin en su interior.
Agrobiotecnologa
Procedimiento para encapsular embriones somticos
Agrobiotecnologa
Cultivo de protoplastos
Agrobiotecnologa
Los protoplastos son clulas vegetales desprovistas de pared celular
Suspensin de protoplastos de mesfilo de tabaco
Agrobiotecnologa
Protoplastos de la lnea celular By2 Protoplasto de mesfilo de tabaco
Los protoplastos constituyen un explanto ideal para diferentes fines biotecnolgicos
Esquema general de la manipulacin gentica de protoplastos in vitro para la realizacin de tcnicas de mutagnesis, fusin o transformacin.
Agrobiotecnologa
Mtodos para el aislamiento de protoplastos
Mtodo mecnico
- Bajo rendimiento - Procedimiento tedioso - Aplicabilidad limitada Choque osmtico para producir plasmlisis celular y ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las clulas rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmtico.
Mtodo enzimtico
Consiste en la incubacin de las clulas en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular: celulasas, hemicelulasas y pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas contienen adems proteasas, nucleasas y lipasas.
Pasos implicados en el aislamiento de protoplastos de mesfilo de tabaco
Protocolo para la obtencin de protoplastos . de mesfilo de hoja de tabaco:

- Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jvenes de tabaco). - Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de hoja. Disponer los explantos en un regulador osmtico. - Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri conteniendo la solucin mezcla de enzimas y medio nutritivo para el cultivo de protoplastos en una proporcin 1:1. - Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 h en oscuridad, a 22-25C, a 50 rpm. Observar la liberacin de los protoplastos en un microscopio invertido.
Agrobiotecnologa
- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizndolos y centrifugndolos a 100 g. Usar las soluciones formuladas para tal fin. - Remover el sobrenadante y resuspender los protoplastos en medio de cultivo.
Variacin somaclonal
Agrobiotecnologa
La variacin somaclonal puede explicar la variacin fenotpica de las plantas regeneradas in vitro
Entre otras causas: Modificaciones genticas heredables por las progenies de las plantas obtenidas mediante cultivo in vitro Prevalencia del cariotipo especfico de plantas y tejidos quimricos y de mosaicos Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a los procedimientos de cultivo (composicin del medio, etc.)
Agrobiotecnologa
Aneuploides no separables en el cultivo
Otra posibles causas de la variabilidad de las plntulas regeneradas
Cese mittico que lleva a lneas poliploides Mutaciones del cariotipo Amplificacin o disminucin de genes Reordenamiento de mutaciones en genomas de organelas Transposones Inversiones, traslocaciones y otros accidentes cromosmicos
Agrobiotecnologa
Caractersticas de la variacin somaclonal

Indeseable en la micropropagacin de plantas de inters comercial (diversidad genotpica)
Potencial para el mejoramiento vegetal cuando se trata de verdaderas modificaciones del material gentico (variabilidad)
Agrobiotecnologa
Referencias
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Altman, A. and Loberant, B. Micropropagation: clonal plant propagation in vitro. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 2: 19 40 Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. Cassells, A. S. In vitro production of pathogen-free plants. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 4: 57 82. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. Doods, J. H. and Roberts, L. W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press. Cambridge, U.S.A. 1992. Herrera Estrella, A. and Chet, I. Biocontrol of bacteria and phytopathogenic fungi. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 11: 263 282. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. Litz, R. E. Cultivo de embriones y vulos. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 12: 295 312, 1991. Roca, W. M., Nez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 294, 1991. Sasson, A. Biotechnology and Natural Products. Prospects for Commercial Productio, ACTS, African Centre for Technology Studies. Nairobi, Kenya. 1992. Roca, W. M., Nez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 294, 1991. Scragg, A. H. Large scale plant tissue culture. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 9: 225 249. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.
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2011 - 2 Cultivo de Tejidos I

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Agrobiotecnologa

Cultivo de tejidos vegetales I

Semillas sintticas Cultivo de protoplastos Variacin somaclonal

Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales

Principales conceptos fisiolgicos aplicables a los cultivos in vitro

- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Fundamentos tericos y prcticos del cultivo de tejidos vegetales

Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales

La micropropagacin constituye la principal aplicacin comercial del cultivo de tejidos vegetales

Alcances de la micropropagacin vegetal

Conservacin de germoplasma Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal

Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas

La micropropagacin requiere una infraestructura mnima especializada y condiciones controladas de cultivo

- Asepsia - Recipientes - Temperatura - Luz y fotoperodo

Medios de cultivo: composicin general

Formulacin bsica de un medio de cultivo para tejidos vegetales

Propiedades fsicas de los medios de cultivo

Semislido Consistencia del medio Lquido

Propiedades fsicas de los medios de cultivo

Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Reguladores del crecimiento comnmente usados en medios de cultivos vegetales

Reguladores del crecimiento

Las auxinas se emplean como promotores de la proliferacin celular y la induccin de la morfognesis

O Acido indol actico (AIA) (auxina endgena)

Las giberelinas favorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes

O Acido giberlico (GA3) HO H CH3 C O H H COOH CH3 OH

Se sintetizan en hojas jvenes, en yemas y en el embrin. Su transporte no es polar.

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

El proceso de micropropagacin de especies vegetales consta de varias etapas

Eleccin de una planta madre selecta Explantos

Desinfeccin superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicacin

Eleccin del explanto inicial

Semillas estriles Germinacin

Diseccin bajo lupa

Protocolo tipo de esterilizacin superficial de material vegetal:

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis

Fotomicrografas de las dos vas morfogenticas

Propagacin vegetativa por embriognesis somtica

Explanto (disco de hoja) Callo

Explanto (clulas vegetales)

Embriones somticos GERMINACIN ENCAPSULACIN

Sistemas de micropropagacin vegetal Proliferacin de yemas axilares o apicales

Propagacin vegetativa a partir de yemas preexistentes

Proliferacin de yemas apicales o axilares

Sistemas de micropropagacin vegetal Proliferacin de tejidos desdiferenciados

Sistemas de propagacin vegetativa in vitro Regeneracin directa e indirecta

Formacin directa de brotes

Formacin indirecta de brotes Planta regenerada

Sistemas de propagacin vegetativa in vitro

Propagacin vegetativa in vitro Regeneracin directa e indirecta

Sistemas de micropropagacin vegetal Cultivo de meristemas

Posibilitan la micropropagacin de diferentes especies

Aplicaciones del cultivo de tejidos: Liberacin de patgenos

El cultivo de meristemas facilita la eliminacin de patgenos

El cultivo de tejidos posibilita el saneamiento de las plantas multiplicadas vegetativamente

Partculas de Potato virus Y

El tratamiento de plantas madres puede efectuarse por distintas tcnicas

Termoterapia Quimioterapia Cultivo de meristemas

Consideraciones prcticas para el saneamiento de plantas madres por termoterapia

Sintomas inducidos por PSTV en tubrculos de papa

Aspectos prcticos del saneamiento de material vegetal por quimioterapia