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Tincion de Azul de Metileno

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Prácticas de Microbiología

2º Curso (Lic. Biología)

Departamento de Microbiología y Genética
Universidad de Salamanca

Práctica 1
TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA: RESIEMBRA DE MICROORGANISMOS, MICROSCOPIO ÓPTICO y TINCIONES. AISLAMIENTO Y MANEJO DEL

Introducción 1. Obtención y mantenimiento de cultivos puros
El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblaciones extensas y homogéneas del microorganismo a estudiar. Por lo tanto, el microbiólogo utiliza técnicas que permiten obtener un cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo. Para obtener cultivos puros se han de utilizar instrumentos estériles, es decir, libres de otros microorganismos no deseados (contaminantes). La esterilidad se consigue por diferentes métodos: 1. 2. Calor seco. Para material de vidrio y de metal. Estos objetos (envueltos en papel o aluminio) se someten a una temperatura de 170°C durante al menos 90 minutos. Calor húmedo. Se utiliza para soluciones acuosas y plásticos. Este material se somete a una temperatura de 120°C durante 20 minutos en una atmósfera de vapor de agua a elevada presión, lo cual evita la ebullición. Se realiza en el autoclave. Filtración. Para esterilizar soluciones termolábiles, a las que se hace pasar a través de un filtro con un tamaño de poro que permite el paso de la solución, pero no de los microorganismos. Esterilización química. Se utiliza para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plástico) termolábil. Se utilizan sustancias como el óxido de etileno, que se eliminan una vez finalizado el proceso de esterilización. Radiación. La radiación UV o las radiaciones α o γ pueden utilizarse para esterilizar habitaciones o algunos plásticos.

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Para poder estudiar los microorganismos en el laboratorio el microbiólogo también debe utilizar medios de cultivo que posean los nutrientes necesarios para el crecimiento de los mismos. Si los nutrientes están en forma de solución acuosa hablamos de medios de cultivo líquidos, mientras que si añaden solidificantes, como la gelatina o el agar (2-3%), obtenemos medios de cultivo sólidos. A veces se utilizan medios de cultivo semisólidos, si la concentración de agar es 0,6-1,5%. Los medios de cultivo se esterilizan mediante calor húmedo. Para aislar un microorganismo de una mezcla de varios y obtener un cultivo puro del mismo, la técnica más utilizada es la de siembra por estría en placa Petri, en medio sólido, que permite obtener colonias separadas de individuos que proceden por división de una única

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célula. Estas colonias nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra técnica consiste en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las células en glicerol (10-30%) a -80°C, en nitrógeno líquido a -173°C, o mediante liofilización.

2. El microscopio
El microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, ya que permite la observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de iluminación utilizada, se agrupan en: • Microscopios ópticos: La fuente de iluminación es la luz. De campo claro. Permiten la observación de preparaciones, en su color natural o contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante. De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales. De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas. De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una imagen en relieve de las mismas. De fluorescencia. La luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en las células (bien de forma natural o añadidas a la preparación) que emiten fluorescencia en el espectro visible. Confocal. Permite obtener imágenes bi y tridimensionales de alta resolución. Es un microscopio computerizado que acopla un láser a un microscopio óptico obteniéndose imágenes fluorescentes. Análisis digital por ordenador. Tiene un diafragma especial llamado pinhole que elimina la señal de las regiones que se encuentran fuera de foco.

• Microscopios electrónicos: La fuente de iluminación es un chorro de electrones y las lentes son electroimanes. De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según el número de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más intensamente impedirán el paso de electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas

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El LR viene definido por la fórmula: LR = λ / 2nsenθ λ: longitud de onda de la fuente de iluminación. Alcanzan entre 1. El microscopio es mejor cuanto menor sea el LR del mismo. de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. • El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminación y la lente ocular. 4 . • El límite de resolución (LR) se define como la distancia mínima a la que se deben encontrar dos puntos para que puedan observarse separados. Oculares Objetivos Pletina móvil Condensador Diafragma Filtros Tornillos de enfoque Fuente de iluminación Soporte Esquema del microscopio óptico La capacidad de un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el número de aumentos y en el límite de resolución (LR).000 aumentos.000 aumentos. sin necesidad de cortes finos. cuyos componentes fundamentales (mecánicos. Permiten la observación de células enteras.000 y 10.estructuras aparecerán oscuras en un fondo más brillante. de iluminación y ópticos) se muestran en la Figura. De barrido. Se consiguen entre 10.000 y 100. Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro.

cristal violeta. No penetran en el interior celular. 3. Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y. lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos: Catiónicos. safranina. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno. Son sustancias que tienen carga positiva. y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción. safranina) o no (nigrosina). de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. Es importante recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite. 2. para lo que podemos intercalar entre la preparación y el objetivo un medio más denso que el aire. el índice de refracción del medio. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: eosina. Ejemplos: azul de metileno. Las tinciones pueden ser: Simples. lo 5 . casi todos los microscopios disponen de varias lentes que se pueden cambiar según el tamaño de la muestra a observar. En los microscopios que se utilizarán en las prácticas. Utilizan un solo colorante. ¡¡sólo puede utilizarse el aceite de inmersión con el objetivo de 100 ×!!.2nsenθ: apertura numérica. Normalmente se utiliza aceite de inmersión. Preparación fijada. Observación microscópica Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a: Preparación húmeda. Por lo tanto si queremos mejorar la capacidad de observación de un microscopio se debe incrementar el número de aumentos y disminuir el límite de resolución (LR). Con carga negativa. Está definida por el valor de 2senθ (característica de cada microscopio y no se puede variar) y n. Para disminuir el LR podemos utilizar una fuente con menor longitud de onda (el caso extremo es el de los microscopios electrónicos) o bien aumentar n. El colorante tiñe las células (azul de metileno. Ejemplo: negro sudán. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos). nigrosina. Diferenciales. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Liposolubles. En este caso se habla de tinción negativa. Después se tiñen mediante diferentes técnicas. Para conseguir lo primero. habitualmente. Aniónicos. Se observa directamente. Tinciones Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química. sino el entorno. con objetivos de inmersión. de modo que no tiñen las células.

Suspensión de una mezcla de microorganismos. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química. Resiembras de microorganismos: Bacillus megaterium. Escherichia coli. Ej. Estas tinciones utilizan más de un colorante. tinción de esporas. Obtención de cultivos puros de microorganismos mediante estría en medio sólido y mantenimiento de los mismos en tubos de agar inclinado. Agar Nutritivo (AN) Extracto de levadura 2 g/l Extracto de carne 1 g/l Peptona 5 g/l ClNa 5 g/l Agar 20 g/l pH 7. Serratia marcescens. Portaobjetos. También realizaremos tinciones diferenciales que nos permitirán clasificar microorganismos en distintos grupos (tinción de Gram y de ácidoalcohol resistencia). En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). de flagelos. 3. Materiales Asa de siembra. AISLAMIENTO A partir de una suspensión de microorganismos se realizarán estrías sucesivas en placas de medio sólido. Las placas se incuban luego a 28ºC durante 24 horas. así como algunas estructuras especiales (esporas en Bacillus y corpúsculos metacromáticos en Lactobacillus). Mechero de alcohol.que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos. cubreobjetos y colorantes. Realización de preparaciones húmedas de suspensiones de microorganismos y tinciones que nos permitirán observar la forma y tamaño de distintos microorganismos. Manejo del microscopio óptico de campo claro. 2. Microscopio óptico. placas de medio sólido y tubos de agar inclinado (Agar Nutritivo). de paredes celulares. de corpúsculos metacromáticos. Yogurt preincubado a 37°C. Objetivos 1. 6 . Selectivas. según su capacidad de tinción. Pueden utilizarse uno o más colorantes.4 Procedimiento 1. de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Micrococcus luteus.

TINCIONES • Simples a) Azul de metileno (Tinción positiva). Procedimiento 1. 2. se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula. Se trata de un colorante aniónico. Algunas estructuras. 6. 3. b) Nigrosina (Tinción negativa). 4. Observar primero con el objetivo 40×. 3. 3. 7 . 5. • Selectivas a) Tinción de corpúsculos metacromáticos en células de Lactobacillus. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra. Procedimiento 1. RESIEMBRA Mediante el asa de siembra se transfieren microorganismos desde unos tubos de agar inclinados con la muestra a otros estériles. hasta que se seque. Añadir Azul de metileno y esperar 2 minutos. sin permitir que llegue a hervir. luego se añade aceite de inmersión y se observa con el objetivo 100×. 2. Extensión: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra (Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra. 4. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. Observar (primero 40× y luego 100× con aceite de inmersión). Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol. Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Luego se incuban a 28ºC durante 24 horas. Permite teñir el interior celular. Secar al aire. como los corpúsculos metacromáticos. que no penetra en el interior celular. Secar. Lavar con agua 5.2.

Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-). Extensión (B. cambios de temperatura.. B. b) Tinción de endosporas. 2. 8. Fijación. botulinum (botulismo)] y Bacillus [ej. Estas estructuras. 3. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los géneros Clostridium [ej. Safranina 1 minuto. anthracis (antrax)]. tetani (tétanos). perfringens (gangrena gaseosa) y C. megaterium). Retirar el papel y lavar con agua. mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. C.Procedimiento 1. que contienen una copia completa del genoma.). Las endosporas germinarán cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. C. Observar (100×). Empapar el papel con Verde malaquita y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de vapores. 4. Tomar una muestra de un yogurt con el asa de siembra y colocar en un portaobjetos. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared. 7. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-). acumulación de metabolitos tóxicos. 2. Secar.tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Lavar con agua. • Diferenciales a) Tinción de Gram. se desarrollan en el interior de la célula bacteriana y cuando la célula muere y se lisa la endospora queda libre. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Teñir con azul de metileno como se ha descrito anteriormente.. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie en situaciones adversas (agotamiento de nutrientes. Procedimiento 1. En esta preparación se observan dos microorganismos: Lactobacillus (con los corpúsculos metacromáticos en su interior) y Streptococcus (forman cadenas). volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. 5. mientras que las bacterias Gram. según se comporten ante esta tinción. 6. 8 . Repetir hasta 5 minutos.

4. Cristal violeta 1-2 minutos. Extensión de la muestra (Escherichia y Bacillus).Procedimiento 1. 10. 5. Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!). Decolorar con etanol-acetona (20 segundos) 7. Secar. 9. Añadir lugol. 11. Observar (100×). Gram(+) Peptidoglicano Gram(-) Peptidoglicano Membrana Plasmática Membrana Plasmática Espacio periplásmico Lipopolisacárido y Proteína Gram (-) Exterior Polisacárido O Membrana externa Gram(-) Núcleo Polisacarídico Proteína Porina 8 nm Fosfolípido Lipoproteína Peptidoglicano Membrana Plasmática Interior 9 Lípido A Lipopolisacárido (LPS) Espacio Periplásmico . 2. Fijación. 3. Lavar con agua. 8. Añadir Safranina (colorante de contraste). esperar 1 minuto y tirar el exceso (¡No lavar con agua!) 6. esperar 1 minuto. Lavar con agua.

4. Repetir hasta 5 minutos. 9. tales como Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis) o M. Observar (100×). Extensión (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus). Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración con alcohol ácido.Proteína asociada a la pared Gram (+) Acidos Teicoicos Acidos Lipoteicoicos Peptidoglicano Membrana Plasmática b) Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Procedimiento 1. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. A estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes. 5. leprae (lepra). Lavar con agua 7. volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Secar. debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos micólicos). Se basa en que ciertos microorganismos no son desteñidos con alcohol ácido si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Añadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos. Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua. Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias. Lavar con agua. 2. 3. 8. 10 . 6. Fijación. Empapar el papel con Fucsina fenicada y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de vapores. 10. Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos.

2. Es poco preciso. La procedencia y características del inóculo. que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc.. etc. 3. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica. El microorganismo en sí. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecerán más o menos rápidamente (por ejemplo. Contadores electrónicos. Existen varios tipos de cámaras de recuento. Las células crecerán más lentamente en un medio mínimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Así por ejemplo. mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas. No diferencia entre células viables y no viables ni entre células o partículas inertes. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula individual y su división celular.. Entre ellos: Recuento directo del nº de células al microscopio. una de ellas es la cámara Thoma que es la que nosotros utilizaremos. en condiciones óptimas E. se refiere al crecimiento de poblaciones. Este método tiene el inconveniente de que no diferencia entre células viables y no viables. crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal). es decir. Cada célula que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos convenientemente amplificados son registrados electrónicamente dando una medida directa del nº de células en el medio. la concentración de CO2 en la atmósfera de cultivo. Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano: Métodos directos: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen conocido y así se estima el nº total en la población. La temperatura de incubación.Práctica 2 DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO Introducción El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: 1. La curva de crecimiento variará dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial. son factores importantes. Se utilizan portas especialmente diseñados para el recuento celular y denominados cámaras de recuento. 11 . La composición del medio de cultivo. la agitación. Las condiciones de incubación.coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos. 4.

liberación de CO2 u otro producto de fermentación.Recuento de células viables. Medir el contenido proteíco del cultivo. aumento de la concentración de alguna enzima constitutiva. Determinación del nitrógeno celular. Medida de la turbidez del cultivo. 12 . Un cultivo celular aparece turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Determinación del DNA Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de oxígeno (en aerobios). etc. Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Entre los métodos indirectos se encuentran: Determinación del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el nº de células proporcional a ésta. El espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y detecta la luz no dispersada. Métodos indirectos: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células. etc. Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros.). incorporación en la célula de algún material radiactivo. La turbidez es proporcional al número de células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro. actividad metabólica. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una única célula.. Sólo detecta viables pero es un método lento y caro por el elevado número de placas que hay que utilizar para que los resultados sean significativos. pero que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular. Si se multiplica por el factor de dilución tendremos el nº de células en cultivo.

3). lo sustituimos en la ecuación (A) y obtenemos el valor de g: g = 0. Cuanto mayor sea el nº de células mayor es la turbidez del cultivo o densidad óptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la muestra.3 (Tf . Por tanto. el valor de g se expresará como: g = (Tf . después de la tercera división N0 × 23…….To)/ (log Nf – log No) El crecimiento de una población en el que el número de células se dobla cada un tiempo g se conoce como crecimiento exponencial y está representado por la ecuación (B). Por tanto.To)/n (A) Si inicialmente tenemos en el cultivo N0 células. Si consideramos que entre un tiempo inicial (To) y otro final (Tf) han transcurrido n generaciones. en algunos casos será necesario diluir la muestra antes de realizar la medida (ej. Por tanto. Sin embargo. para hacer una dilución 1/10 se mezclaría 1 ml de cultivo con 9 ml de medio de cultivo o agua). se trata de una progresión geométrica cuya sucesión se puede expresar como: Nf = No × 2n (B) Despejando el valor de n se aplican logaritmos: Log Nf = log(No × 2n) log Nf = log No + n log 2 n = (log Nf – log No)/log 2 Conocido el valor de n. después de la segunda división N0 × 22. la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. cerevisiae la relación entre la DO y la concentración de células es lineal hasta un valor de DO de aproximadamente 0. esto es así dentro de ciertos límites. después de la primera división el número de células será N0 × 21. puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares y producirse un efecto “pantalla” de unas células sobre otras (en el caso de S. después de n divisiones. g es el tiempo que necesita una población para duplicar el nº de células. el número final de células (Nf) será N0 × 2n. para una dilución 1/50 primero se hace una dilución 1/10 y despues se hace una dilución 1/5 de la dilución 1/10). Cálculo del tiempo de generación El tiempo requerido para que una célula microbiana se divida dando lugar a dos células se denomina tiempo de generación (g). Nº de Células (escala aritmética) Logarítmica Nº de Células (escala logarítmica) Aritmética Tiempo (horas) 13 .Este instrumento mide la relación de intensidad entre la luz incidente y la emergente después de atravesar la muestra. Por tanto. Cuando la dilución sea alta (mayor de 1/10) conviene hacer diluciones seriadas para reducir el error (ej..

Es en este periodo donde puede calcularse el tiempo de generación de un microorganismo. Esta gráfica es característica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados. Fase en la que las células se están dividiendo regularmente a ritmo constante. En la curva se distinguen cuatro fases: Fase de latencia. A veces la muerte va acompañada de lisis celular y ésto disminuye la absorbancia del cultivo. esta fase de latencia varia dependiendo del medio al que se transfieren y de las condiciones de incubación. En condiciones apropiadas durante esta fase. El nº de células no se incrementa más porque los nutrientes del medio se van agotando y posibles sustancias tóxicas pueden ir acumulándose.O. que nos viene dada por una gráfica del tipo: Fases de Crecimiento Latencia Exponencial Estacionaria Muerte Viables Turbidez (D. Las células son metabólicamente activas. obtenemos su curva de crecimiento.Sin embargo. se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. 2. Para un mismo inóculo. Fase de muerte celular. el nº de células que se originan es igual al nº de las que mueren. 14 . No hay incremento neto del nº de células. Fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones del medio de incubación al que han sido transferidas. Las células no crecen inmediatamente sino después de este tiempo de latencia.cerevisiae) utilizando dos métodos distintos: Medir de la turbidez del cultivo (método indirecto) y recuento del nº de células al microscopio (método directo) Determinar el tiempo de generación de la población (S.cerevisiae). Las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de los nutrientes y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas. Fase de crecimiento exponencial. Fase estacionaria. el grado de desarrollo es máximo.) Tiempo El incremento en el número de células es lento al principio y después llega a ser de forma exponencial. Medir el crecimiento de una población microbiana (S. cuando seguimos el crecimiento de una población microbiana. midiendo por ejemplo su DO en función del tiempo. Objetivos 1.

05. cerevisiae. Está dividida en 16 cuadrados y éstos a su vez divididos en 16 ó 25 celdillas.O.O. Utilizando esta curva patrón. obtenidos a lo largo del tiempo.25).1 mm de profundidad. obtenidos en nuestras lecturas al espectrofotómetro y haremos una gráfica del nº de células en función del tiempo. Cada celdilla tiene una superficie de 0. a diferentes tiempos durante unas 24 horas. 3.O. S. a 600 nm y comprobaremos que esta D. Procedimiento 1. Como hay 16 celdillas por cuadrado.00025 mm3.O. conocida. Mecheros de alcohol. Tomaremos muestras cada dos horas. Matraz con 25 ml de medio YED (extracto de levadura y glucosa). microscopio óptico.O. calcularemos por extrapolación el nº de células que corresponden a los valores de D. Al mismo tiempo haremos una recta patrón usando la cámara de recuento y suspensiones celulares de D. Recuento directo del número de células al microscopio.O. cámara de recuento (Cámara Thoma).004 mm3. haremos un cálculo de g de nuestro cultivo. inicial (to) es aproximadamente de 0. incubadores a 28 ºC. Seguiremos la evolución de la turbidez del cultivo midiendo la D.0025 mm2 y una profundidad de 0. Como 1 mm3 = 10-3 ml. se calcula la media (X) de células por celda y se expresa la concentración en células por ml: X cel / 4 × 10-6 ml = X × 25 × 104 células/ml Los valores de células/ml se representan gráficamente frente a su DO correspondiente para obtener la curva patrón.1 mm. 2. el volumen total de una celda (VT) es de Vc × 16 = 0. Y en algunos de estos puntos tendremos que hacer diluciones para medir la D. 15 . Mediremos la D. Por tanto el volumen de cada celdilla (Vc) es de 0. espectrofotómetro.Materiales Inóculo de Saccharomyces cerevisiae 1 ml (DO: 1. La cámara de recuento consiste en un porta modificado con una hendidura de 0. Por último. Pipetas estériles.O. La curva obtenida será la curva de crecimiento del cultivo. Representaremos en una gráfica los valores de D. V = 4 × 10-6 ml (volumen de una celda) Se cuentan 6 celdas al azar. utilizando dos valores consecutivos comprendidos dentro de la fase exponencial de crecimiento. Para la determinación de la curva de crecimiento: Inocularemos el matraz que contiene el medio de cultivo con un preinóculo.

•Inhiben la síntesis de ácidos nucleicos: mitomicina. -Son productos del metabolismo secundario. Su estructura química •ß-lactámicos: penicilinas. -Son efectivos a bajas concentraciones. •Actúan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad. -Solubles en agua. -Poseen toxicidad selectiva: actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador. -Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas. -Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro. 16 . •Inhiben la síntesis proteica. Aspergillus. Su mecanismo de acción •Actúan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su síntesis: penicilinas. Streptomyces. •Semisintéticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada químicamente. Nocardia) como en el de eucariotas (Penicillium. •Aminoglucósidos: estreptomicina.Práctica 3 ANTIBIÓTICOS Introducción Los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados por microorganismos. Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparición de resistencia a determinados antibióticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infección. •Polipeptídicos: bacitracina. •Macrólidos: eritromicina. que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros microorganismos. •Poliénicos: anfotericina B •Tetraciclinas •Derivados del benceno: cloranfenicol. cefalosporinas. •Sintéticos: obtenidos completamente por síntesis química. Los microorganismos productores se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas (Bacillus. -Poseen estabilidad química. Cephalosporium) Se pueden clasificar según: Su origen •Naturales: sintetizados por microorganismos. Se caracterizan por: -Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas).

Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. papel semilogarítmico de 3 periodos. placas Petri. invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. baño a 50ºC. Bacillus subtilis. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima 2 tacos de agar. 100 µg/ml y concentración desconocida.cerevisiae (organismo sensible). antibióticos: penicilina G 25. Para ello se emplearán dos posibles microorganismos productores del género Streptomyces y un microorganismo sensible (Saccharomyces cerevisiae). PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS Mediante un bioensayo en medio sólido podemos determinar si un microorganismo produce algún antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de un organismo de prueba. 2. Tapar el tubo con Parafilm. 2. Saccharomyces cerevisiae. cada uno con uno de los microorganismos a ensayar. Procedimiento 1. Detectar la producción de antibiótico por microorganismos Valorar la cantidad de antibiótico presente en una solución Determinar qué antibiótico entre varios es más efectivo frente a un organismo (“antibiograma”). 5. microorganismos: Streptomyces. cicloheximida: 2 mg/ml. Esta técnica se emplea en los procesos de mejora de la producción de un 17 . 6. Tomar un tubo con medio YED fundido mantenido a 45-50ºC en un baño a dicha temperatura. 3. Procedimiento 1. VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ANTIBIÓTICO La concentración de un antibiótico en una solución se puede determinar por comparación con el efecto de cantidades conocidas del mismo antibiótico sobre un microorganismo sensible. bacitracina: 10 mg/ml. 3. mecheros. 50. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar la existencia o no de halos de inhibición del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. 4. pipetas estériles. 2. regla. Bacillus subtilis.Objetivos 1. pipetas pasteur. Materiales Tubos con 20 ml de AN y YED fundido. Añadir 1 ml de la suspensión de células de S.

Tapar el tubo con Parafilm.1 mg/ml). 3. 18 . invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. Se compararán tres antibióticos. “ANTIBIOGRAMA” El antibiograma se utiliza para comprobar cuál de una serie de antibióticos es más activo frente a un determinado microorganismo. Resultado: Observar el tamaño de los halos de inhibición del crecimiento. subtilis (organismo sensible). 4. Bacillus subtilis en este caso. Procedimiento 1. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). 3. Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. 6. 2. 3. subtilis (organismo sensible). hacer la representación gráfica sobre papel semilogarítmico de 3 periodos y deducir la concentración de antibiótico desconocida. 4. Penicilina G (0. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20 minutos) colocar con ayuda de pinzas tres discos de papel saturados con la correspondiente solución de los diferentes antibióticos: Penicilina G (0. Se valorará la concentración de Penicilina G en una solución frente a una recta patrón generada con cantidades conocidas del mismo antibiótico. subtilis. 6. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. Tomar un tubo con medio AN fundido. Tomar un tubo con medio AN fundido. 5. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. 5. Indicar qué antibiótico es el más efectivo frente a B. invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. Resultado: Observar la aparición o no de halos de inhibición del crecimiento y su tamaño. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. El proceso se lleva a cabo mediante bioensayo en placa sobre un microorganismo sensible.1 mg/ml). Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). Cuando el medio esté sólido (después de unos 15 minutos) colocar con ayuda de pinzas cuatro discos de papel saturados con la correspondiente solución de antibiótico. 2. Tapar el tubo con Parafilm. Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. Procedimiento 1.determinado antibiótico por la especie productora. medir los diámetros con una regla.

Aparte del problema de transmisión de enfermedades. las cuales suelen contener restos de heces que pueden portar microorganismos patógenos. 100 ml). Determinar si el agua está contaminada por heces humanas o de otros animales. a partir de marzo de 2003 los criterios de calidad del agua de consumo humano se determinan de acuerdo a la normativa publicada en el BOE de 21 de febrero de 2003. la contaminación del agua también acarrea otras consecuencias. No obstante.). Pseudomonas. Además de la flora normal (Bacillus. creando un ambiente desprovisto de toda forma de vida que no sea anaeróbica: mueren los peces. Objetivo 1. Medios de cultivo: Placas de agar nutritivo (AN) (4). tubos de medio Caldo Lactobiliado (3 EC concentrado y 6 EC simple). Materiales Muestra de agua (aprox. disminuye la vida vegetal y se produce el hedor característico debido a las actividades de los microorganismos anaerobios. Una de las fuentes principales de contaminación son las aguas residuales. La calidad del agua se determina principalmente por análisis bacteriológicos. en el agua pueden existir microorganismos contaminantes. Las pruebas que se realizan son: Recuento de aerobios totales Colimetría Estreptometría Clostridiometría Estos ensayos siguen en líneas generales la normativa publicada en el BOE de 20-IX-1990. los cuales afectan en mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus características organolépticas. la degradación biológica por los microorganismos de grandes cantidades de residuos orgánicos vertidos al agua hace disminuir rápidamente el oxígeno existente. 6 AR simple). Tubos con 1 ml de agua estéril para 19 . etc. medio Wilson Blair (1 tubo de agar WB fundido). placa de medio Eosina Azul de Metileno (EMB).Práctica 4 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA Introducción En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos. Por ejemplo. tubos de medio Caldo Azida de Rothe (3 AR concentrado.

Sembrar 0. oxidasa negativas. Este ensayo sólo nos indica la cantidad de microorganismos de este tipo que hay en la muestra de agua. Estufa incubadora a 37°C. mechero de alcohol y alcohol de quemar. Tabla estadística de “Número Más Probable” (NMP). Gram (-). capaces de crecer en un medio rico (AN). aerobias o anaerobias facultativas. 1/4 y 1/8. Asa de vidrio. transcurrido un determinado tiempo de incubación a 37 °C. no esporógenas y capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 37°C en un tiempo máximo de 48 horas. el ensayo se considera positivo si dan positivas ambas pruebas. Preparar diluciones seriadas de la muestra original: 1/2. pero NO IDENTIFICA microorganismos concretos. Si se hiciera el mismo ensayo a 22 °C nos daría una idea de la flora autóctona. Citrobacter. Ya que los microorganismos patógenos son muy sensibles y se encuentran en bajas concentraciones se toma como indicador de contaminación fecal la presencia en las aguas de los géneros arriba indicados y principalmente de Escherichia coli. El resultado se expresa como microorganismos por ml de agua. Se realizan dos pruebas. 1. Procedimiento 1. seleccionar la placa que contenga entre 30 y 300 colonias para la realización de los cálculos. Pipetas estériles (de 1 y 10 ml). en la que se ha sembrado un volumen de agua conocido.diluciones. aerobias y anaerobias facultativas. Al incubar a 37°C se seleccionan bacterias de origen fecal (adaptadas a vivir en el interior del cuerpo de los animales). Bacterias coliformes (Colimetría) Son bacterias de morfología bacilar. mesófilas. Las bacterias coliformes de origen fecal se incluyen dentro de las bacterias entéricas o "enterobacterias" y se caracterizan por habitar el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Baño a 80°C. Baño a 60°C. Bacterias aerobias totales Las bacterias que vamos a identificar en este ensayo son bacterias heterótrofas. Parafilm™. Klebsiella y Enterobacter. 1 tubo de vidrio estéril. El ensayo se basa en contar el nº de colonias capaces de crecer en una placa de medio rico. 20 . ¡Hay que tener en cuenta las diluciones!. Incubar las placas a 37 °C durante 24 horas. algunas de cuyas especies causan infecciones intestinales como la fiebre tifoidea y la disentería bacilar.2 ml de la muestra original y de cada una de las diluciones (1/2. 1/4 y 1/8) en cuatro placas de AN. Resultados: Contar el número de colonias existentes en cada placa. Proteus y Shigella. 2. Las heces pueden ser vehículos de transmisión de otras bacterias no coliformes que son patógenas como Salmonella. 2. 1. presuntiva y confirmativa. Este grupo incluye los géneros: Escherichia.

La bilis inhibe el crecimiento de cocos Gram (+) y bacilos formadores de endosporas y no inhibe a los bacilos entéricos Gram (-) ni otros ambientales (ej. que permite el enriquecimiento e identificación de bacterias coliformes. Es un medio de enriquecimiento y selectivo. coli es sembrar los microorganismos que han crecido en caldo lactobiliado a 37°C en este mismo medio pero incubando a 44°C.1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con campana de Durham. azul o violeta con o sin brillo metálico (por ejemplo.Prueba presuntiva: El agua problema se siembra en el medio denominado caldo lactobiliado (EC). 2. Incubar a 37°C durante 24 h. Procedimiento 1. Esta tabla indica el número más probable de microorganismos presentes en 100 ml de agua (NMP). Agitar suavemente hasta mezclarlo bien. 4. La prueba es + si aparecen este tipo de colonias fermentadoras de lactosa. coli es capaz de fermentar la lactosa en estas condiciones. 3. Siembra en estría en placas de EMB (medio selectivo y diferencial para coliformes) a partir de "tubos gas+". Otra prueba confirmativa de la presencia de E. Prueba confirmativa: 1. Pseudomonas). La lactosa existente es fermentada produciendo ácido y gas que se detecta en la campana de Durham. Resultados: En este medio los microorganismos fermentadores de lactosa forman colonias características opacas y pigmentadas en rosa. 2. coli forma colonias de color verde-violeta oscuro metálico características sobre este medio). Incubar a 37°C durante 24 horas. Sembrar 1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con campana de Durham. teniendo en cuenta los tubos en que hay crecimiento así como las diluciones y aplicando métodos estadísticos. 21 . Sembrar 10 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado concentrado (ECC) con campana de Durham. E. Resultados: se consideran "tubos gas +" aquellos en los que aparece enturbiamiento y acumulación de gas en la campana. E. Sembrar 0. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien. La interpretación se realiza según la tabla de “número más probable” (NMP) adjunta. Los "tubos gas -" se incuban otras 24 h. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien.

22 . catalasa negativos y fermentadores de glucosa con producción de ácido láctico a 37°C en un tiempo máximo de 48 h. capaces de formar esporas y con actividad sulfito reductora (desasimilatoria). anaerobios estrictos. 6 tubos AR). Los estreptococos y otros microorganismos poseen un metabolismo fermentativo y carecen de cadena de transporte de electrones por lo que no se ven afectados por la azida. Sembrar de la misma forma que en bacterias coliformes en medio selectivo para estreptococos. El ensayo consiste en contar el número de bacterias anaerobias formadoras de endosporas con capacidad sulfito reductora en un medio que contiene sulfito sódico y una sal de hierro. Este grupo comprende especies como Streptococcus faecalis. Incubar a 37°C durante 24 h. El medio utilizado. El ensayo incluye prueba presuntiva y confirmativa y se considera positivo si ambas pruebas son positivas. Fundir previamente el medio Wilson-Blair 2x (WB) y mantener en baño a 60°C. otras en el suelo. bovis y S. Gram(+). caldo azida de Rothe (3 tubos ARC. S. Clostridios sulfito-reductores (Clostridiometría) Son bacterias de morfología bacilar. Interpretación según la tabla NMP (microorganismos/100 ml de agua). faecium. anaerobios aerotolerantes. Procedimiento 1. Resultados: Se consideran "tubos +" aquellos en que existe enturbiamiento y/o sedimento.3. Procedimiento 1. Prueba presuntiva El ensayo se basa en saber si existen microorganismos capaces de crecer a 37 °C en un medio líquido glucosado con agentes inhibidores selectivos. equinus. Estreptococos fecales (Estreptometría) Son cocos Gram (+). Prueba confirmativa Se trata de realizar una tinción de Gram del sedimento de los tubos con objeto de reconocer al microscopio los estreptococos. denominado caldo azida de Rothe (AR) es un medio selectivo que contiene azida que inhibe la cadena de transporte de electrones del metabolismo respiratorio de los microorganismos. etc. 4. Algunas especies de Clostridium habitan en el tracto intestinal de animales. S. denominado medio Wilson Blair (WB). que se observarán como cadenas de cocos Gram (+). Los estreptococos fecales son residentes normales del intestino del hombre y animales y reciben la denominación general de enterococos. Estas colonias aparecen de color negro debido a la formación de sulfuro ferroso por reducción del sulfito. Agitar 2.

1 ml 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 Índice NMP/100ml 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 Límite de confianza del 95 por 100 Límite inferior < 0.2.5 < 0. Añadir la muestra de agua precalentada al tubo de WB 2x 4. Enfriar en el grifo. para matar formas vegetativas e inducir la germinación. Las normas legales exigen: Aerobios totales: No existe límite legal pero los valores máximos recomendados son: Aerobios a 37°C: 10 /ml. Interpretación de los resultados El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los límites establecidos por la ley.5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150 Límite superior 9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 149 120 130 379 210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800 23 . Incubar a 37°C durante 24-48 horas. 3. Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. (Ver normas vigentes). Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml. Tapar bien el tubo con algodón y con Parafilm™. entre los cuales pueden variar para diversas combinaciones de resultados positivos y negativos. Resultados: Contar el nº de colonias negras existentes en la totalidad del tubo (sin tener en cuenta las colonias puntiformes). Estreptococos fecales: < 1 / 100ml. El resultado se expresa como nº de clostridios existentes en el volumen de agua sembrada. Mezclar por inversión. Aerobios a 22°C: 100 por ml. Número de tubos que dan reacción positiva entre 3 tubos de 10 ml 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 tubos de 1 ml 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 tubos de 0.5 < 0. 5. NMP (Número más probable) Con los intervalos de confianza del 95 por 100. Calentar la muestra de agua (10 ml) durante 10 minutos a 80°C.

065 g/l 13.0 g/l Extracto de carne 4.0 g/l Sales biliares 1.0 g/l Lactosa 5.5 g/l Glucosa 7.0 g/l Sulfito sódico 0.5 g/l Cloruro de sodio 5.Composición de los medios de cultivo empleados Caldo lactobiliado (EC) Biotona 20.5 g/l Citrato férrico 0. cambia de incoloro a negro a pH ácido) Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) Agar pH 7.5 g/l Caldo azida de Rothe (AR) Peptocomplex 15.5 g/l Azida sódica 0.2 g/l Agar nutritivo (AN) Extracto de levadura Extracto de carne Peptona ClNa Agar 2 g/l 1 g/l 5 g/l 5 g/l 20 g/l Medio Wilson Blair (WB) Peptona 10.0 g/l Fosfato de potasio 5.2 5 g/l 5 g/l 10 g/l 2 g/l 0.5 g/l Agar 15.5 g/l 24 .4 g/l 0.5 g/l Cloruro de sodio 7.0 g/l Medio EMB (Eosina-azul de metileno) Lactosa Sacarosa Peptona Difosfato potásico Eosina (indicador de pH.

.. ácido-alcohol resistentes. temperatura óptima de crecimiento. 25 . anaerobios facultativos. utilización de citratos como única fuente de carbono. La identificación de bacterias puede basarse en muchos caracteres: morfología celular o de las colonias. Otros como Salmonella o Vibrio pueden causar enfermedades por la ingestión de alimentos o agua contaminados.Práctica 5 DETERMINACIÓN DE ENTEROBACTERIAS Introducción En esta práctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una muestra (heces. Morfología celular: forma (bacilos. Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiología. rosarios).. Concretamente. en el que se incluyen las enterobacterias. consistencia. borde.. vamos a realizar la determinación de bacterias pertenecientes al grupo de bacilos Gram (-) anaerobios facultativos. desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su manipulación en el laboratorio. racimos. De ahí la necesidad de desarrollar pruebas que permitan aislar e identificar rápidamente estos microorganismos. diferenciales y de enriquecimiento. La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras clínicas o de otros orígenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones. fisiológicos. selectivos. bioquímicos.. No obstante. Tinción (Gram. cocos) y agrupamiento (diplococos. seguir el curso de las enfermedades y decidir los tratamientos a aplicar. color. para identificarlos posteriormente mediante un conjunto de pruebas. etc. tipo de fermentación de carbohidratos. tinción. sección. Presencia o ausencia de estructuras especiales: flagelos. todavía muchas pruebas requieren el empleo de métodos de cultivo tradicionales. Muchas de ellas forman parte de la flora normal del tracto digestivo del hombre pudiendo producir enfermedades en determinadas circunstancias. anaerobios.. etc Actualmente existen kits que agrupan muchas pruebas fisiológicas y bioquímicas en un formato sencillo y que produce resultados rápidos. endosporas Morfología de las colonias: forma. Todos los puntos del proceso son importantes. El grupo de bacterias gram (-) anaerobias facultativas incluye bacilos o cocobacilos que pueden crecer en presencia o en ausencia de O2 (anaerobios facultativos).). agua o alimentos contaminados. de tipo serológico y de patogenicidad. movilidad. Bioquímica: presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metabólica.) Fisiología: aerobios.

cocobacilos Movilidad: inmóviles o móviles por flagelos peritricos Catalasa (+) y Oxidasa (-) La mayoría de enterobacteriáceas pueden fermentar glucosa y otros azúcares. como Vibrio cholerae que es el agente causal del cólera. Shigella. Por ejemplo. 26 . color y otras características de los distintos tipos de microorganismos presentes en la muestra. En este grupo se incluyen las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae. mientras que Salmonella. Familia Vibrionaceae Forma: bacilos ligeramente curvados. Algunos son patógenos. Klebsiella. Materiales Se describen para cada experimento Procedimiento 1. Movilidad: móviles por flagelos polares Catalasa (+) y Oxidasa (+) Las vibrionáceas crecen bien en medio alcalino. empleando las mezclas A o B. La capacidad o no para fermentar algunos sustratos se utiliza para la identificación de las distintas especies. Enterobacter fermentan la lactosa (coliformes). Proteus no fermentan la lactosa (no coliformes). AISLAMIENTO Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias. donde podremos ver la morfología. Objetivo Aislamiento e identificación de las bacterias presentes en una muestra (suspensión que contiene una mezcla de microorganismos). Verde Brillante. Familia Enterobacteriaceae Forma: bacilos. Escherichia. La mayoría son inofensivas y se encuentran en ambientes acuáticos. Se llevarán a cabo inoculaciones en placas de medios sólidos (Agar nutritivo. TCBS) y en medio líquido (Peptona alcalina).En anaerobiosis obtienen la energía por fermentación. EMB.

con el fin de obtener colonias bien aisladas: 1 placa de Agar nutritivo.Procedimiento 1. Cultivos en medio líquido Añadir con una pipeta Pasteur estéril varias gotas de la suspensión bacteriana en un tubo de peptona alcalina.2. por lo tanto permite el crecimiento de muchos microorganismos.065 g/l Es un medio selectivo de la familia Enterobacteriaceae. 1 placa de Verde Brillante. acidifican el medio y la eosina vira a negro dando lugar a la aparición de colonias oscuras.2. Incubar a 24 h a 37 °C. 1. Incubar a 37 °C y observar la presencia o no de crecimiento bacteriano. También es un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloración de la colonia si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa.4 g/l 0.1. 1 placa de EMB. Si las bacterias fermentan lactosa o sacarosa. Cultivos en placas Tomar una muestra de la suspensión microbiana con un asa de siembra estéril y sembrar por estría los siguientes medios. 27 . Observar la morfología de las colonias y determinar cuantos microorganismos distintos hay en cada mezcla. 5 g/l 5 g/l 10 g/l 2 g/l 0. cambia de incoloro a negro a pH ácido) Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) pH 7. Características de los medios empleados Agar Nutritivo Extracto de levadura 2g/l Extracto de carne 1 g/l Peptona 5 g/l ClNa 5 g/l Agar 20 g/l No es un medio selectivo. 1 placa de TCBS. Medio EMB (Eosina-azul de metileno) Lactosa Sacarosa Peptona Difosfato potásico Eosina (indicador de pH. Las bacterias que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias claras.

con un halo rojo brillante.Medio Agar Verde Brillante Lactosa Sacarosa Peptona Extracto de levadura NaCl Rojo de fenol (indicador de pH) Verde Brillante (colorante que inhibe el crecimiento de muchas bacterias) Agar pH 6.0125 g/l 20 g/l Es también un medio selectivo de la familia Enterobacteriaceae y un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloración del medio si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa.04 g/l 0. Por su pH alcalino sólo permite el crecimiento de Vibrio.0 Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo la familia Vibrionaceae. aunque algunas especies pueden crecer dando pequeñas colonias. 28 . Medio Peptona Alcalina Peptona 15 g/l NaCl 30 g/l pH 9. Medio Agar TCBS Tiosulfato Sódico Citrato férrico Bilis de vaca Sacarosa ClNa Colato de sodio pH 8. Las colonias de Salmonella son blanco-rosáceas. Las colonias de Vibrio son grandes. Este medio inhibe selectivamente el crecimiento de la Familia Enterobacteriaceae. lo que se observa es la existencia de crecimiento por turbidez del medio. Si no son fermentadores. Está indicado para el aislamiento de Salmonella (no para S.04 g/l 14 g/l Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo de la familia Vibrionaceae. Es un medio líquido.6 10 g/l 1 g/l 5 g/l 20 g/l 10 g/l 3 g/l Extracto de levadura Citrato sódico Peptonas Azul de Timol Azul de Bromotimol Agar 5 g/l 10 g/l 10 g/l 0.9 10 g/l 10 g/l 10 g/l 3 g/l 5 g/l 0. Si crecen microorganismos fermentadores el pH del medio se acidifica y se torna amarillento debido al Rojo de Fenol. el pH se vuelve más alcalino por la utilización de las peptonas. de color amarillo o azul.08 g/l 0. en concreto de Vibrio cholerae y otros vibrios enteropatógenos. y medio vira a rosa o rojo debido al mismo colorante. typhi).

una enzima capaz de destruir el agua oxigenada generada en algunos procesos metabólicos. Para ello se utiliza un compuesto orgánico que puede ser reducido por el sistema citocromo-oxidasa/citocromo c en presencia de oxígeno molecular. Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin añadir agua. Prueba de Kligler y Manita-movilidad. Poner la colonia sobre el porta y añadir una gota de sustrato cromógeno fresco (10 mg/ml).2. Si se pone azul es (+). 29 . 2. Esperar 20-60 segundos y observar si existe algún cambio en la coloración. el microorganismo es oxidasa positivo. Prueba de la Oxidasa. 2. el API20E. Se trata de determinar si un microorganismo posee citocromo c-oxidasa. → azul de indofenol Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de EMB o TCBS (o bien hacer una suspensión de una colonia en agua) y depositar en un porta. Además se llevará a cabo una prueba compuesta por varias reacciones bioquímicas. originando un producto coloreado fácilmente apreciable. Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa. bien aerobias o anaerobias facultativas. 2. Resultado: La aparición de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo. Esta enzima está presente en la mayoría de las bacterias que contienen citocromos.1. 1. Observar si se forman burbujas de oxígeno. IDENTIFICACIÓN Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los aislamientos en placa. 3.2. Test de la Catalasa. oxidasa 1-naftol + dimetilparafenilendiamina Procedimiento 1. Resultado: Si la tira se pone de color azul oscuro. catalasa 2 H2O2 Procedimiento → 2 H2O + O2 Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar) de la placa de EMB (Enterobacteriaceae) y TCBS (Vibrionaceae) 2. 3. Se llevarán a cabo 4 pruebas individuales: Prueba de la oxidasa. Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %. 4.

pero como se encuentra en el medio en muy baja concentración se agota rápidamente. 3º) Posteriormente se produce el consumo de lactosa. pero sólamente en aerobiosis (se corresponde a la zona de la lengüeta del tubo). Procedimiento 1. produce gas o ácido sulfhídrico. lo que significa que existe un periodo de latencia entre el agotamiento de la glucosa y la producción de las primeras moléculas de ßgalactosidasa. la glucosa.2. produciendo una basificación del medio. El indicador vira a rojo en esta parte del tubo. El medio contiene una pequeña cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismo capaces de fermentar cualquiera de estos compuestos darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del medio. Test de Kligler. Inocular los microorganismos aislados en la placa de EMB en un tubo de medio KIA con el asa de siembra. 30 . Es un medio que requiere un procedimiento de inoculación especial. Esto da lugar a un descenso de pH por lo que cambiará el medio de rojo a amarillo. de tal forma que después de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a utilizar lactosa. La razón de que la lactosa se utilice después es debido al tipo de regulación de la ßgalactosidasa. en el caso de los microorganismos que sean capaces de utilizar este disacárido. La sucesión de eventos metabólicos es la siguiente (ver dibujo): 1º) El microorganismo utiliza la fuente de carbono más asequible en el medio. Se trata de una enzima inducible. En este medio se puede obtener la siguiente información fisiológica: a) Fermentación de glucosa y/o lactosa. Los productos de su degradación acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. que es la enzima que hidroliza este disacárido para dar los correspondientes monosacáridos. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio. La siembra se hará de la siguiente manera: sembrar la superficie por estría y sembrar la parte interna del medio por picadura. Incubar 18-24 h a 37°C. 2. En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar Hierro de Kligler") y proporciona varios datos fisiológicos importantes para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar la lactosa. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. Este consumo da lugar a residuos amoniacales. 2º) Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas.3.

son “gas (+)” aquellos microorganismos que produzcan esta enzima.2 g/l 0. La producción de gas se detecta por la formación en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el medio. El gas se origina mediante la reacción catalizada por la formiato liasa a partir de ácido fórmico.4 3 g/l 3 g/l 15 g/l 10 g/l 1 g/l 0. formiato liasa H-COOH → CO2 + H2 Por tanto.3 g/l 0.Lac + Glc + 6h 10 h Rojo Amarillo 24 h Amarillo Lac Glc + Rojo Amarillo Rojo Amarillo Medio KIA Extracto de carne Extracto de levadura Peptonas Lactosa Glucosa Tiosulfato sódico Sulfato ferroso (Fe2+) Rojo de fenol ClNa Agar pH 7.024 g/l 5 g/l 12 g/l b) Producción de gas. 31 .

10 g/l 1 g/l 7.5 g/l 0. Se utiliza un medio semisólido para detectar la movilidad de las bacterias. Manita-Movilidad. 2.04 g/l 3. Este medio contiene manitol como fuente de carbono. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reacción a partir del tiosulfato añadido al medio: tiosulfato reductasa 2 S2O3 + 4 e + 4 H 2+ - + → 2 SO32+ + 2 SH2 El ácido sulfhídrico se detecta porque reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+) presentes en el medio. Inocular por picadura un tubo de medio semisólido con cada uno de los distintos microorganismos aislados.4. oscureciendo el medio.5 g/l 2. 32 . Medio MM Peptona de caseina Nitrato potásico Manitol Rojo fenol Agar pH 7. Si el microorganismo es capaz de usar el manitol se produce una acidificación del medio. Incubar 24 horas a 37°C. 3. lo que da lugar a un viraje del indicador de pH de rojo a amarillo.6 Procedimiento 1.c) Producción de SH2. Observar la zona de crecimiento del microorganismo y si ha habido cambio en la coloración del medio. Esto da lugar a la formación de sulfuro de hierro que se deposita en gran parte del tubo. sobre todo en el fondo.

Si el crecimiento se limita a la zona de la picadura. el microorganismo no es móvil. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Batería de pruebas API20E La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para enterobacterias y otras bacterias Gram(-). Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos ADH. Procedimiento 1. 2. 33 . | GEL | con la suspensión de bacterias. Géneros Escherichia Shigella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Yersinia Gas + + + + + + + SH2 + + + Lactosa + + + + + Manita-Movilidad + + + + + + + + 2. Básicamente consta de 20 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. en agua o solución salina.Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento del microorganismo. | VP |. Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogéneamente en 5 ml de solución salina (1% de ClNa) o 5 ml de agua estéril. LDC. 4. Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos. eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez.5. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido. de los demás pocillos. no la cúpula. ODC. Las tiras se incuban a 37°C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir cambios de color espontáneos o bien al añadir reactivos. Preparación de inóculo. 5. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta (ver tabla "sumario de los resultados con API 20E "). URE. Cada pocillo tiene un tubo y una cúpula (ver dibujo). Llenar el tubo y la cúpula de los pocillos | CIT | . el microorganismo es móvil. que rehidrata los medios. La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reacción según el color aparecido. H2S para obtener anaerobiosis. Si el crecimiento se produce por todo el medio. Inoculación de los pocillos. Llenar los tubos. 3.

1. Positivo= aparece un anillo rojo en los dos primeros minutos de la reacción. IND: Añadir una gota de reativo de Kovacs. Positivo=color marrón oscuro. no hay que añadir reactivos. 7. 2 o 4 según corresponda: 1. Cuando esto ocurre se hacen otros tipos de API como el API OF. 3. Si la reacción es negativa………… 0 Si la reacción es positiva…….…… 1 (primer pocillo de un triplete) 2 (segundo pocillo de un triplete) 4 (tercer pocillo de un triplete) Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras. 4. Identificación: del conjunto de reacciones se obtiene un perfil numérico. Los pocillos están separados en grupos de tres. 2.6. En total hay 7 tripletes (el test número 21 corresponde al test de la oxidasa). Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata. 34 . Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios: Si la glucosa es positiva y/o 3 o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos: VP: Añadir una gota de KOH 40 % y una gota de α-naftol 6% y esperar 10 minutos. A cada pocillo se le da el valor 0. Poner la tira en la cámara de incubación. TDA: Añadir una gota de Cl3Fe 10 %. Positivo= color rojo o rosa fuerte. el API M o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales. Interpretación de los resultados La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de la tabla de lectura. Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2. Previamente poner agua en los alveolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación. Incubar a 37°C durante 24 h.

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