PRACTICA No. 3 FIJACIN, TINCION Y MONTAJE DE ESPECIMENES.

A. OBJETIVOS ESPECIFICOS a.1.El alumno ser capaz de fijar, teir y montar parsitos con el objeto de realizar la observacin ms tcnica y conservarlos de manera permanente. Obtener preparados estables en su conservacin, para destinarlos a la formacin de la coleccin del laboratorio de parasitologa, coma material didctico; as como material para intercambio acadmica con otras escuela y universidades.

a.2.-

B.-

MATERIAL Y EQUIPO A UTILIZAR. b.1.- Microscopio compuesto. b.2.- Estufa bacteriolgica. b.3.- Cajas de petri. b.4.- Matraces, botes y varillas de vidrio. b.5.- Porta objeto y cubre objetos. b.6.- Mechero de gas o de alcohol. b.7.- Formol al 10%. b.8.- Solucin salina fisiolgica. b.9.- Alcoholes de 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 96 b.10.- Glicerina. b.11.- Alcohol ter. b.12.- Alcohol acidificado (HCl). b.13.- Papel filtro, etiquetas de papel engomado y clips. b.11.- Blsamo de Canad b.15.- Media de Berlese. b.16.- Tincin de Haemalurnbre de Mayer. b.17.- Xilol-fenicado-creosato. b.18.- Carbonato de Litio. b.19.- Tincin Tricrmica de Gmori. b.20.- Fijador de Bouin o de Faurel. b.21.- Parsitos colectados.

C.- PROCEDIMIENT0S.

c.1.- Montaje de tremtodos, cstodos, nemtodos. Conservacin para observaciones macroscpica. Previo lavado de agua corriente y enjuagado con solucin 16

fisiolgica formulada al 5 %, dentro de un frasco de boca ancha y con tapa esmerilada. Tambin pueden conservarse sumergidos en alcohol de 70 (ver figura No. 3.1). Para facilitar la observacin macroscpica, los grandes cestodos y nemtodos, se mantendrn enrollados sobre varillas, cilindros o lminas de vidrio color Azul o negro, que por contraste permiten observar contornos, poros, genitales, etc. Los pequeos trematodos debern conservarse en glicerina al 50% entre portaobjeto y cubre objetos, pegados con blsamo de canad.
Figura No. 3.1 Conservacin de parsitos en alcohol al 70% o formol al 10%

Fijacin de trematodos y cestodos para montaje a usar en el microscopio. La mayora de los trematodos y cestodos son muy musculosos y reaccionan a los fijadores por contracciones y enrollamiento, a menos que sean relajados o sostenidos por medios fsicos. El parsito recin colectado y lavado con S.S.F. se coloca entre dos porta-objetos o placas de vidrio, dependiendo del tamao del parsito y se sostienen los portaobjetos con ligas de hule o clips, dando una ligera presin, de manera que el ejemplar quede extendido completamente ( ver figura No. 3.2). Se introduce en un fijador durante 24 hr (formol al 10% o fijador de Bouin), al cabo del cual sacar los portaobjetos del fijador, se retiran los clips y se separan con agujas de diseccin, procurando que el parsito queda adherido a una sola lmina para no romperlo. Luego se prepara utilizando pinceles del No. 2 humedecidos con agua. Los ejemplares pueden ser conservados por tiempo indefinido en el fijador o si se desea, se pueden montar en placas de vidrio de tamao apropiado, de tal manera de que queden en frascos 17

de boca ancha, El espcimen se fija al vidrio por medio de grenetina caliente, posteriormente de la coagulacin se introduce en el frasco con el fijador. Si se desean teir para destacar sus estructuras internas, se deben seguir las tcnicas de Haemalumbre de Mayer para tremtodos y la tcnica de Tricrmica de Gmori para cestodos.
Figura No. 3.2 Montaje de parsitos. A.- Etiquetas. B.- Ejemplo de etiqueta. C.- Montaje en laminilla. D.- Estilete o aguja de disecciones. E.- Atado de laminilla. F.- Montaje con soportes. G.- Montaje de una tenia. H.- Doblado de un acantocfalo para montaje.

Tcnica de tincin con Haemalumbre de Mayer (para trematodos). Despus de haber fijado el espcimen con formol al 10% corno se indic anteriormente, lavar con agua corriente 5 a 10 minutos. Colocar un crculo de papel filtro en el fondo de una caja de petri. Colocar el espcimen sobre el papel filtro. Cubrir totalmente con el colorante los parsitos y dejar que acte durante 24-48 hr (dejar la caja de petri tapada). Decantar el colorante, filtrarlo para su posterior uso. Lavar los especimenes varias veces con agua, hasta que este quede claro. Iniciar la deshidratacin con la serie alcohlica mediante pases sucesivos en alcohol de 40, 50, 60 y 70. Decolorar con alcohol cido (alcohol etlico al 70% con 5% de cido clorhdrico), 18

unos minutos hasta obtener la coloracin deseada. Lavar varias veces con alcohol al 70% para quitar todas los residuos de cido. Continuar la deshidratacin con alcohol al 80, 90 , 96 y absoluto en cada pase 12 - 24 Hrs. como mnimo. Aclarar los especimenes con Xilofenicadocreosotado (ms o menos 20 minutos). Montar entre portaobjetos y cubreobjetos con una pequea cantidad de blsamo de canad. Hacer presin con un clip, adaptado coma pinza (vase figura No. 3.3). Dejar en la estufa para su secado o a temperatura ambiente, limpiar y etiquetar.

Figura No. 3.3 Fijacin entre laminillas de un parsito

Tcnica de Tricrmica de Gmori (para cstodos). Aplanar el parsito limpio y vivo, colocndolo entre dos portaobjetos o placas de vidrio, sujetndolo con ligas o hilaza (ver figura No. 3.2 E). Para que el ejemplar no se salga por capilaridad, se debe colocar seco entre las laminillas de vidrio. Para fijar se colocan los portaobjetos con el parsito en una caja de petri o en un frasco de boca ancha y se cubre totalmente con el fijador de Bouin (o formol al 10% durante 24 Hrs.), conservarse cerrados. Se sacan los portaobjetos del fijador y se separan con agujas de diseccin, procurando que el parsito quede adherido a un solo portaobjetos para no romperlo, para ello se separa de ste utilizando pinceles del No. 2 humedecidos con agua. Se quita el exceso del fijador con agua destilada, haciendo varios cambios (5), de 5 minutos cada uno, en cajas de petri, y si el parsito queda amarillo se debe poner en una solucin acuosa de carbonato de Litio al 30%, hasta que desaparezca el color amarillo, esto puede tardar varias horas. Lavar con agua destilada el parsito (2 cambios) una vez que ha quedado blanco. Deshidratar con alcoholes sucesivos de concentracin ascendente, desde 30, 50, 70, 96 y absoluto (12 a 24 Hrs. en cada paso). Teir con tricrmica de Gmori, una gota de solucin madre por 2 c.c. de alcohol de 96% durante 3 a 5 Hrs. Quitar el exceso de colorante mediante alcohol acidulado al 2% (HCl.), hasta que los bordes estn blancos, esto ltimo es muy necesario. Se lava el alcohol acidulado con alcohol del 96%, dos cambios de cinco minutos. Para terminar de deshidratar, se introduce la preparacin en alcohol absoluto. Aclarar con Xilolfenicadocreosotado. Montar en blsamo de canad.

Montaje de Nematodos. Los gusanos colectados deben colocarse en recipiente con suero fisiolgico, lavarse varias veces y antes de 24 Hrs. fijarse v colocarse en una solucin conservadora. La fijacin se lleva a cabo colocando a los gusanos vivos y limpios en alcohol etlico al 70% caliente (6070C). Cuando el material se encuentra muerto se puede fijar en alcohol 70% o en formol al 5 o 10 % o bien en solucin Barbagayo. El aclarado se hace 19

colocando a los ejemplares fijados en una caja de petri o en un vidrio de reloj, luego se cubren con lactofenol, glicerina o creosota. Para preparaciones rpidas, pueden montarse en grenetina, en Faur o bien en

Berlese; estas preparaciones duran algunos meses. Para preparaciones permanentes se puede seguir la tcnica de Hemalumbre de Mayer. c.2.- Montaje de huevecillos. Debern utilizarse los de reciente emisin y previa identificacin montndose luego. Los huevos de tenia podrn obtenerse presionando un progltido maduro, sobre un portaobjeto, en el sentido de uno de los orificios genitales, recogindolos con un asa, extendindolos sobre el portaobjeto para examinarlos al microscopio. La conservacin puede efectuarse en tubos de ensaye o en preparaciones microscpicas entre porta y cubreobjetos. En el primer caso, colocar el sedimento o el sobrenadante, segn el mtodo empleado, en un tubo conteniendo solucin de formol al 5% en solucin fisiolgica, glicerinada al 10%. Para la

conservacin mediante preparados microscpicos, se colocar una gota del material fijado, previamente identificado sobre un portaobjeto limpio, desengrasado con alcoholter, agregar una gota de lanolina fundida, emulsionar y colocar inmediatamente encima un cubreobjeto limpio y seco, pegndolos con blsamo de canad.

Mtodo de Loose.- Diluir material que contenga huevos en agua corriente, filtrar a travs de un colador de alambre de malla fina, fijar en alcohol de 70 glicerinado al 5%, calentar a 70C, enfriar y agregar alcohol glicerinado fresco, evaporar a la estufa de cultivos y montar en glicerina gelatinada. El material que se destine a colecciones no deber obtenerse por mtodos de enriquecimiento que contengan soluciones saturadas de sales o azcares ya que los cristales que forman estas sustancias, alteran la morfologa de los huevos. c.3.- Fijacin, tincin y montaje de Artrpodos. Fijacin.- El mtodo ms simple consiste en cubrir el artrpodo vivo a muerto por anestesia a una mezcla da alcoholter, con una gota grande de cloral o Faur, cuya frmula es la siguiente: Agua destilada........................................50 cc. Cloral hidratado......................................50 gr. Goma arbiga.........................................30 gr. Glicerina..................................................20 cc. Se recubre con una laminilla v se deja secar. Hay que lavar con agua las objetos y no ponerlas directamente con alcohol. Tincin.- Algunas veces es til hacerlo para teir artrpodos con tegumento incoloro, se emplea carmn Haemalumbre o mejor an cido Piroglico, segn el de Racovitza: 30 minutos en la solucin al 1% de cido Piroglico en agua destilada o alcohol del 70%, glicerina y se les deja que viren con la luz durante algunas horas, se pueden montar con la glicerina simple o con grenetina o blsamo, pero el medio no debe ser cido. 20

Linguatlidos. Las ninfas o paracfalos se deben fijar mediante el alcohol caliente, luego se montan entre porta y cubreobjetos, previa evaporacin del alcohol, pegndolos con blsamo de canad. caros de sarna. El material que puede contenerlos (pelos, costras secrecin sebcea, etc). Se colocar sobre un portaobjeto, se agrega una gota de lega de sodio o de potasio al 10% dejndola actuar en fro durante unos minutos. Si el material no se desintegrara lo suficiente para permitir la observacin del parsito, se calienta suavemente sobre la llama del mechero hasta desprendimiento de vapores o la formacin de burbujas. La clarificacin del material en la forma expresada deber verificarse bajo observacin microscpica. Para montaje deber eliminarse la leja, mediante el lactofenol de Amman, colocando blsamo de canad cerrando con un cubreobjeto. Garrapatas. Muertas por el alcohol de 95% se dejan evaporar y se montan con blsamo de canad , entre porta y cubreobjetos, debiendo disecarse previamente eliminando los rganos internos y la sangre ingerida. Se separa la regin ventral de la dorsal y se montan separadamente. Piojos.- Mtodo de Berlese, modificado por Borges Ferreira, cuyo medio es: cido actico glacial .......................................................3 ml. Hidrato de cloral .............................................................74 gr. Colofonia pulverizada ......................................................8 gr. Solucin de glucosa al 98% ........................................... 5 ml. Agua destilada ..............................................................10 ml. Mezclar en fro el agua destilada, el cido actico y el hidrato de cloral, se agitan varias veces hasta la dilucin completa, agregar los otros componentes; agitar nuevamente la mezcla, colocar en autoclave, calentando a 60C durante una hora. Colocar el parsito previamente pasado por los alcoholes, dejar evaporar, agregar una a dos gotas del medio descrito, colocar el cubreobjeto y mantener en posicin horizontal hasta que el material se haya endurecido. El reemplazo de la goma arbiga del mtodo original por colofonia, proporciona un preparado mas compacto que al cabo de tres horas del montaje se vuelve ntido. D.- EJERCICIOS d.1 El alumno realizar el montaje y tincin de los parsitos recolectados en el campo, observando los especimenes al microscopio e identificndolos.

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