Instituto Nacional de Salud

Publica
Escuela de Salud Publica de México

I Infección por virus del Herpes

N Simplex 1 que activa PERK cinasa
S residente en retículo
P endoplasmatico y controla la
desfosforilación de eIF-2alfa por la
proteína y134.5.

QC. Miguel Ángel Ortiz Gil.

10 DE FEBRERO 2008
 Funciones del
RER:
INTRODUCCIÓN. to ERGIC, Golgi

b)Las proteínas son

traslocadas al RER

d)las chaperonas
facilitan el
plegamiento de las
proteínas.

f)Abandonan el ER
en vesículas.

h)Detecta una
proteína mal
plegada y se
degrada en el
proteasoma.

j)Acumulación de
proteínas no
plegadas, Activa la
UPR.
La Unfolded Protein Response o respuesta a proteínas desplegadas

•La acumulación de
proteínas mal
plegadas, activa
UPR.

• La función de UPR
es la de aliviar el
estrés en el RE:

5.Sobre-expresando
chaperonas.

7.Factores de
degradación de
proteínas.

9.Disminuye la
síntesis de
 Los 3 sensores de la UPR

•Cuando se acumulan proteínas mal plegadas en el RE,

BiP o grp78 se une a las proteínas defectuosas y libera a
los tres sensores.

3.PERK.
4.ATF6
5.IRE1
 
 Los 3 sensores de la UPR
 ATF6: Genes que
codifican para
chaperonas.

 IRE1: endonucleasa
remueve 26
nucleótidos del mRNA
que codifica para la
proteína XBP1, activa
la transcripción de
genes para
degradación de
proteínas mal
plegadas.
 Planteamiento del
problema:

• ¿Ventajas que deriva de la proteínas

y134.5 que actúan en elF-2alfa más
que en PKR directamente.?
 Material y métodos:Virus:
•VHS – 1
Células: •Virus R3616 .
•HeLa. (carece del gen de la región
•HEK 293 de ratón 10T1/2. y134.5).
•NIH 3T3. • Virus H9813 .
•PKR +/+ y PKR -/- de (Val-193-Glu y Phe-195-Leu en
ratón. sustitución de la codificación del
gen de la región y134.5).

Plásmidos y
ensayos de
transfección.
Las células fueron •Plásmido
propagadas en pGF9912 (expresa
medio de cultivo la proteína y134.5).
•Plásmido
pGF9913 (expresa la
proteína mutante y134.5).
Análisis
inmunoblot. Ensayo de
Fosfatasa Transcripción
(Anticuerpos contra Placa.
y134.5, fosforilados ensayos elF- inversa con
(tiempo
PERK, Perk, fosforilados 2alfa. PCR (RT-PCR).
elF-2alfa. ) postinfección)
 Resultad
os:

Características: Resultados: Interpretación:

(A)Células HeLa. •Aunque PERK fue • La infección por el
(B)Ratón 10T1/2. activado en células VHS-1 activa PERK
(C) Infectadas con VHS- infectadas, el aumento cinasa.
1 (F) o la supresión de fosforilación elF-
y134.5 mutante 2alfa se observó sólo •La expresión de la
R3616. en ausencia de la proteina y134.5 es
(D)Las membranas proteína y134.5. responsable de la
fueron probados con dephosphorylation elF-
anticuerpos p-PERK, 2alfa.
 Características: Resultados: Interpretación:
•Para explorar la •Niveles de P-PERK:• La activación de PERK
replicación del ADN VHS-1(F)> R3616. inducida por la
viral afecta la infección por el VHS-1
fosforilación de PERK. •PAA redujo P-PERK requiere la síntesis de
(Ácido moderadamente. proteínas virales.
phosphonoacetic)
•CHX no tiene ningún
• Síntesis de proteínas efecto sobre P-PERK.
virales es necesaria
para activar PERK. •CHX inhibe proteínas
(Cicloheximida) virales.

•Lisados de células se
procesaron para
westernblot
 Características: Resultados: Interpretación:
•Para determinar el •Niveles similares de •Respuesta a la
impacto de la infección elF-2alfa se expresa en infección por el virus,
por el virus, también se las células infectadas. elF-2a sigue siendo
analizaron el estado de fosforilados en
fosforilación •Sin embargo, la ausencia de PKR. Sin
elF-2alfa. fosforilación del eiF- embargo, el alcance de
2alfa exhiben la P-elF-2a se redujo en
diferentes patrones. células PKR -/- en
comparación con
 Características: Resultados: Interpretación:
•Propiedades de Virus Replic Post •PKR limita la
crecimiento de VHS-1 a replicación de VHS-1.
-PKR
(F), R3616 y H9813 en Sin embargo, R3616 y
+/+ 24h =
PKR +/+ (A) y PKR -/- H9813 se reproducen
VHS- 24h
(B) fibroblastos de menos en comparación
1(F)
embriones de ratón. En con el VHS-1 (F) en
R3616 24h
varias ocasiones células PKR -/-.
H9813
postinfection.
•PERK contribuye a una
-PKR -/- 24h
•Base de esto es disminución en el
VHS-
desconocido crecimiento del virus
1(F)
en células PKR -/-.
R3616
H9813
 Características: Resultados: Interpretación:
•Para determinar la •DTT o TG reduce la •La wty134.5 , pero no
síntesis de proteínas, síntesis de proteínas en PPi mutante es capaz
las células fueron las células de aliviar el PERK
etiquetados con [35S] transfectadas con el mediado respuesta de
metionina. y134.5 mutante (filas 5 estrés en las células.
y 6).
•Lisados las células •Esta actividad se
fueron sometidas a •wty134.5 - síntesis correlaciona con la
SDS-PAGE y normal de proteínas capacidad de la
autorradiografía. expuestas en la proteína y134.5 mediar
 Características: Resultados: Interpretación:
•La infección por el •VHS-1, R3616, H9813 •VHS-1 estimula la
VHS-1 induce la induce GADD34. expresión GADD34 en
expresión GADD34. la presencia o ausencia
de la proteína y134.5.
•ARN de cada muestra •Además, supresión de
fueron sometidas a RT- PKR no tiene ningún
PCR de amplificación efecto sobre la
de GADD34. Como expresión de GADD34
control 18s rRNA. en VHS-1 las células
infectadas.
•Es notable que el virus
induce la expresión
GADD34 antes de PERK
es fosforilados.
Conclusión:
 Conclusión:
• PKR es activado por el
VHS.

• Fosforilación en serina-51
sobre elF-2alfa, que
inhibe la replicación viral.

• La síntesis de la proteína
proteína y134.5 esta
relacionada con el VHS-1
resistencia al interferón.

• VHS-1 ha desarrollado
una única estrategia para
eludir la acción antiviral
 Conclusión:
• Proteína y134.5 se une a proteínas fosfatasa 1 (PP1), formando un
complejo de alto peso molecular que específicamente desfosforila a
elF-2alfa.

• GADD34 se estimula por la infección por el VHS- 1.

• GADD34 también dirige PP1 a desfosforilar elF-2alfa, la inducción de

la expresión GADD34 por el VHS-1 puede contribuir al retraso en
hiperfosforilación del elF-2alfa.
 Bibliografía:
• Guofeng Cheng, Zongdi Feng,Bin He. Herpes
Simplex Virus 1 Infection Activates the
Endoplasmic Reticulum Resident Kinase PERK
and Mediates eIF-2 Dephosphorylation by
the y134.5 Protein. JOURNAL OF VIROLOGY,
Feb. 2005, Vol. 79, No. 3. p. 1379–1388.