TECNICAS GENERALES

EN MICROBIOLOGIA
vinificatum.blogspot.com
Jose Mara Xandri Taguea

Consecuencias Enolgicas
De la FML
Consecuencias Enolgicas
de la FML
La fermentacin malolctica es originada por una descomposicin del cido
mlico de los vinos, por la actuacin de bacterias que se desarrollan en la masa del -
mismo, produciendo a p ~ r t i r del cido mlico cido lctico y gas carbnico.
La ecuacin de esta fermentacin es la siguiente:
COOH - CH2 - CHOH - COOH =CH3 - CHOH - COOH + C02
En la que se aprecia que el cido mlico que es dicido, se transforma en -
cido lctico, monocido, y en C02 que se desprende, por este motivo la acidez del-
vino es disminuido.
Las diferentes etapas de esta fermentacin, son las siguientes:
DPN
COOH - CH2 - CHOH -COOH - Deshidrogenasa mlica - COOH - CH2 - CO - COOH
- 2H
cido mlico cido oxalactico
COOH - CH2 - CO -COOH --- Descarboxilasa - CH3 - Co - COOH
cido oxalactico cideo pirvico
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DPNH2
CH3 - CO - COOH - Deshidrogenasa lctica - CH - CHOH - COOH
cido pirvico + 2H cido lctico
La transformacin malolctica, puede ser realizada por accin enzimtica, -
aplicando un enzima que ha sido aislado del hgado de paloma y del lactobacillus ara-
binosus, adems del enzima mlico del lactobacilJus arabinosus, para realizar esta reac-
cin se necesita lodehidrasa e iones de manganeso. La reaccin no es una descarbo-
xilacin directa, sino que pasa por un proceso de oxido-reduccin y por el estado de
cido pirvico:
DPH2 M112+
COOH - CH2 - CHOH - COOH - enzima mlico - CH3 - CO - COOH
cido mlico -C02 - 2H cido pirvico
DPNH2
CH3 - CO - COOH - deshidrag. lctico - CH3 - CHOH - COOH
cido pirvico + 2H cido lctico
Consecuencias de li! fermentacin malolctica.- Prdida de acidez total, por
P '.lf el c i d ~ mlico de dos funciones acidas a cido lctico de una sola funcin; que-
dando reducida la acidez mlica transformada a 1/2, y ligera precipitacin de birtar-
trato al disminuir la acidez del medio.
La acidez voltil aumenta ligeramente por ataque del cido ctrico presente
en el vino por las bacterias malolcticas especialmente por los cocos, tambin hay -
una ligera formacin de cido actico de los residuos de pentosa.
BACfERIAS LACfICAS DE LOS VINOS
Las bacterias lcticas existentes en los vinos.- Pertenecen a varios gneros:
Leuconostoc ( cocos heterofermentativos ), Pediococos ( cocos homofermentativos )
y Lactobacilos ( bacilos ). Los efectos de la actuacin de estos diferentes gneros -
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son variados, por lo que so clasificacin es de gran importancia para conocer su pro-
bable actuacin en el vino. A continuacin se expone un cuadro resumen de las -
principales especies de bacterias lcticas.
Cocos hornofermentativos
Cocos heterofermentativos
Bacilos homofermentativos
Bacilos heterofermentativos
Pediococcus cerevisiae
{
Leuconostoc gracile
Leuconostoc vinos
{
Lactobacilos plantarum
Lactobacilos casei
Streptobacterium
Lactobacilos hilgaudi
Lactobacilos fructivoraus
Lactobacilos desidrsus
Lactobacilos brevis
Respecto a la actuacin de las bacterias lcticas en los vinos, puede ser fa-
vorable perjudicial, segn los tipos de bacterias y natrualeza de los vinos. Se con-
sideran los dos tipos siguientes:
a) Bacterias capaces de descomponer principalmente el cido mlico, pero -
tambin de atacar los azcares, posiblemente al cido ctrico, pero no al cido trtri-
co y al glicerl; son las ms frecuentes. Estas bacterias suelen ser las ms corrientes
en la fermentacin malolctica, pero tambin son los agentes de ataque a los azcares
de los vinos de fermentacin incompleta.
Estas bacterias no actuan sobre los azcares, si el pH no es suficientemente
elevado.
b) Las bacterias capaces de descomponer el cido trtrico y el glicerl, son
las ms peligrosas como agentes de verdaderas enfermedades de los vinos.
En resumen: Hay bacterias lcticas que segn las condiciones de los vinos,
pueden actuar solamente como malolcticas, pero pueden ser peligrosas si hay pre-
sencia de azcar, y otras siempre peligrosas, que son los verdaderos agentes de las en-
fermedades. De todo ello se deduce que no hay bacterias lcticas completamente -
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inofensivas, pero hay diferentes categorias segn sus propiedades especficas y compo-
sicin de los vinos.
A pesar de esto Peynaud opina que pueden considerarse dos tipos de bacte-
rias 1cticas; por una parte las bacterias de enfermedad, que siempre sern peligrosas,-
por ser capaces de atacar a los principales de los vinos; por otra parte
las bacterias que provocan habitualmente la fermentacin malolctica, peligrosas sola-
menr-: accidentalmente, pero ms aptas para transformar el cido mlico que a los -
azcares.
Considerando que existen grados en el peligro que representa una bacteria,
segn sus propiedades de especie y segn las condiciones, principalmente que hay -
no presencia de azcar residual en los vinos, especialmente glucosa y fructosa.
El caracter homolctico sea la fermentacin lctica de la glucosa, no es -
una caracterstica de inocuidad, como se cree frecuentemente.
Las bacterias homolcticas pueden formar cidos voltiles a partir de la fruc-
tosa y de las pentosas y siempre elevan la cifra de la acidez fija.
Su presencia es frecuente en vinos alterados y algunas lactobacilos homofer-
mentativos atacan incluso al cido trtrico.
Influencia del pH del medio, sobre la forma de actuar las bacterias malolc-
ticas.- Las variaciones del pH, influyen en la multiplicacin y en el ataque de las bac-
terias al cido mlico, y en general sobre su actuacin sobre los sustratos que es capaz
de metabolizar.
El pH ptimo para desarrollo de las bacterias del vino es de 4,5-4,8, pero -
no es raro encontrar cepas capaces de crecer a pH 3, segn las observaciones realizadas.
Respecto a la fermentacin malolctica segn algunos autores, las cepas bac-
terianas pueden caracterizarse, segn su actitud de producir una fermentacin malolc-
tica pura, por dos cifras, una indicando pH-umbrl de ataque. del cido mlico, la otra
de pH-umbrl de ataque a los azcares con formacin de elevada cidez voltil. Cuan-
to ms separadas sean estas cifras tanto ms aptas sern las bacterias para la fermenta-
cin malolctica: Cuadro de pH-umbrl para diferentes bacterias:
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COCOS BACILOS
pH-umbrales
Acido mlico Azcares Acido mlico-azcares
I
3,0 36 7 24
3,2 31 12 28
3,4 21 31 27
3,6 6 29 8
3,8 4 14 8
4,0 1 4 3
4,2 1 3 2
Como se aprecia en el cuadro, este caracter de poder fermentar el cido -
mlico del vino en presencia de los azcares sin atacar a estos, es de gran importancia
y destaca a los cocos como los agentes ms convenientes de esta transformacin, pus
salvo alguna excepcin esta propiedad no se manifiesta en los lactobacilos. De 398
cepas de cocos heterolcticos y de 253 de bacilos heterolcticos, en los valores que -
representan los pH-umbrales, el 36 %de cocos atacan al cido mlico a partir de pH=
= 3, Y el % atacan los azcares. Los pH-umbrales de ataque del cido 'lctico y
de los azcares, son en termino medio los mismos para los bacilos.
Influencia de la temperatura.- La temperatura influye sobre la velocidad y
sobre el lmite de las fermentaciones.
La temperatura ptima puede considerarse de 25
Q
, a esta temperatura la ac-
tuacin microbiana se realiza bien.
El pH bajo y el grado alcohlico alto frena la actuacin y desarrollo de las
bacterias lcticas, siendo ms sensible esta accin en temperaturas ms altas. La tem-
peratura de 15
Q
se considera como la ms preferible para condiciones difciles del me-
dio vino.
Influencia de la aireacin.- La anaerobiosis favorece en unas ocasiones el -
crecimiento y actuacin de las bacterias lcticas y otras veces no, por lo que no se -
puede generalizar.
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Para los bacilos heterolcticos la anaerobiosis estricta retrasa ligeramente el
principio de la multiplicacin, pero la poblacin finl es ligeramente superior y la aci-
dez formada sigue siendo del mismo orden.
Por el contrario para los bacilos homolcticos, los cultivos en anaerobiosis -
( bajo pirogall ) disminuyen francamente el mismo de bacterias en un 10 %y la in-
tensidad de la fermentacin en un 23 %.
Entre los cocos heterolcticos, se distinguen los que fermentan las pentosas
y las pentosas negativas, los primeros tienen crecimiento ptimo, bajo pirogall, y los
segundos son fuertemente frenados, con esta disposicin pudiendo disminuir la produc-
cin de cido lctico en un 50 %'
Necesidad de factores de crecimiento.- Las necesidades son diferentes segn
los momentos de desarrollo y actuacin de las bacterias. Al principio del crecimiento
estas necesidades son mayores; algunas posibilidades de sntesis, hace que las bacterias
puedan sufrir en algunos casos, la consecuencia de algunas de estas sustancias, por eso
son menos sensibles a los 20 das de su desarrollo.
Las mismas carencias afectan generalmente a la vez al crecimiento y a la fer-
mentacin lctica, pero en algunos casos puede haber diferencias, como por ejemplo:
la carencia de glicerl y . serina, impiden al mismo tiempo la fermentacin lctica y la
multiplicacitl de los bacilos.
Los cocos tienen ms necesidades de aminocidos que los bacilos ( * ), esto
se explica por su diferentes los metabolismos nitrogenados. Las mayores exigencias -
de los cocos que los bacilos, hace que los primeros sean ms raros en los vinos despus
de la fase de fermentacin malolctica.
Acido lctico formado.- Distingue tres clases de bacterias:
A) Las que forman cido L (+), son relativamente poco numerosas, son so-
lamente bacilos homofermentativos pertenecientes a la serie de L. casei.
( *) Ver Etudes Rcentes sur les Bactries Lactiques du vin por E. Peynaud, 2
Q
Sym-
posium International d'Oenologia. Bordeaux-Cognac 1967 - pg. 227.
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B) Las que forman cido lctico O (- ), son los cocos heterofermentativos
los que entran en esta categoria. Se encontraron como excepcin solo dos bacilos -
heterofermentativos.
C) Las que forman una mezcla de cidos lcticos L ( +) y O ( - ); estos son
todos los bacilos heterofermentativos a excepcin de los dos precedentes ( los bacilos
de la especie heterofermentativos L. Plantarum y otros Streptobacterium, no clasifica-
dos) y los cocos hornofermentativos.
Pero aqu no puede hablarse de cido lctico racmico DL, pero de una -
mezcla de dos cidos lcticos, depende de la presencia de una u otra de las lactohidro-
genasa en las clulas de las dos a la vez, pudiendo ser no iguales las proporciones
de ambos cidos lctico formado.
Influencia del alcohol.- La resistencia al grado alcohlico vara considera-
blemente segn las cepas y segn la riqueza del medio de cultivo.
Han sido realizados estudios experimentales, para comprobar la influencia -
del alcohol en las fases de multiplicacin y fermentacin, de las bacterias lcticas lo -
que Peynaud reune en el siguiente cuadro.
Tantos por ciento medios de disminucin de crecimiento y de la fermenta-
cin lctica.
ACCION DEL ALCOHOL ETILICO SOBRE LAS BACfERIAS LACfICAS
6 alcohol 10 alcohol grado alcoh-
lico lmite -
crecimiento fermentacin crecimiento fermenta.
medio.
Bacilo hetero. 22 10 40 21
<13 4
Bacilo horno. 9 6 25 13 125
Bacilo hetero. O 11 18 30 12 4
El crecimiento de los bacilos es doblemente afectado que la fermentacin, -
con los cocos el fenmeno es inverso, la poblacin es poco afectada.
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Pero en los grado lmites de crecimiento, se destacan los bacilos como ms
resistentes a] alcohol que los cocos. Esto se comprueba por ser dominante en los -
vinos de "postre" ( dessert ) generalmente los bacilos.
Segn experiencias de Ribereau Get Peynaud ( * ) al trazar las curvas de in-
hibicin del alcohol, se aprecia dos clases de influencias: Primero hasta 10-11
0
de -
alcohol, solamente un ligero efecto retardador, pero a partir de este grado, una fuer-
te inhibicin. Hasta los 11
0
de alcohol, las clulas son perjudicadas pero permane-
cen VIvas. A partir de 11
0
aunque hay algunas que resisten y necesitan largo tiempo
para multiplicarse, otras son eliminadas. La resistencia al alcohol de una cepa es da-
to de gran inters para su aplicacin prctica.
En Jos ensayos de adaptacin por siembras en medios con dosis crecientes -
de alcohol, no di resultado suficientemente seguro. Por el contrario cuando las bac-
terias se desarrollan al mismo tiempo que las levaduras en un medio que as se enri-
queciendo progresivamente en alcohol, el xito de las siembras directas del vino es -
mucho mejor.
Formacin de polioles.- Las bacterias hetero]cticas forman siempre glice-
rol y 2 - 3 butanodiol en la fermentacin lctica de la glucosa y de pentosas, y mani-
to] de ]a fermentacin ]ctic de ]a fructosa. Las bacterias homo]olcticas no forman
polio]es solamente trazos de g]icerJ. No se considera como caracter especfico y
seguro de clasificacin, pus incluso algunas bacterias homolcticas pueden formar pe-
queas cantidades de diversas clases de polio]es.
ENSAYO DE CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS
LACTICAS ESTUDIADAS
Ante ]a diversidad e imperfeccin de las clasificaciones, Peynaud despus -
de una exposicin resumen de los fundamentos de varias de ellas resalt la convenien-
cia de una clasificacin basada en propiedades enolgicas de las bacterias en cuestin
( *) Pg. 229 - Etudes Recentes sur les Bact. Lactiques du vin 2
Q
Symposium Bur-
deos. 1.967.
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y poder as elegir con conocimiento de causa, entre ellas para una actuacin enolgi-
ca determinada.
CLASIFICACION GENERAL DE LAS BAcrERIAS LAcrICAS
DEL VINO
La clasificacin propuesta se basa en las siguientes caractersticas:
Forma microscpica de las bacilos
clulas bacterianas. cocos
Caracteres de fermentacin (horno. lctica
de la glucosa. ( hetero. lctica
Fermentacin de las pen- (+
tosas. ( -
Aisladas al. usar en los vinos, se encontraron cocos y bacilos, pero
con mayor dificultad el aislamiento de los primeros.
La reparticin de los cocos y bacilos en relacin con la manera de fermen-
tar las pentosas, se expone como interesante:
Sobre 100 bacterias
P - hay 84 cocos
A+ hay 98 cocos
X+ hay 95 bacilos
P + hay 84 bacilos
En esta distribucin a pesar de ser hecha al azar, resalta el autor las siguien-
tes observaciones:
- Los que hacen fermentar la xilosa ( X +) son raros en los vinos.
- Los bacilos que hacen fermentar la arabinosa ( A + ) son an ms raros.
- Tambin son raros los cocos que hacen fermentar a la vez a estas dos pen-
tosas y los bacilos que no fermentan ninguna.
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BACfERIAS LACfICAS (S. Schanderl, H )
I
111 11
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IV '
V VI
VII
VIII
IX
Pgina 11 de 16
BACTERIAS LACTICAS ( Leyenda)
1.- Lactobacillus acidophilus.- Colonia sobre agar-Ieche ( 90 aumentos ).
11.- Iniciador de la acidificacin para mantequera ( 960 aumentos ).
111.- Lactobacillus heveticus.- En leche (960 aumentos ).
IV.- Lactobacillus bulgaricus.- En leche. Muestra grnulos de volutina ( 960 au-
mentos ).
V.- Lastobacillus deibrcki.- Aislado a partir de solucin nutritiva de BLICK-
FELDT. Tincin negativa ( 575 aumentos ).
VI.- Lactobacillus casei.- Tincin negativa ( 960 aumentos ).
VII.- Lactobacillus plantarum.- Obtenido a partir de solucin negativa de BLICK-
FELDT. Tincin negativa ( 960 aumentos ).
VIII.- pentosaceum.- De queso Emmenthal ( 960 aumetos ).
IX.- Tetracoccus (Pediococcus ).- Tincin negativa ( 960 aumentos ).
MICROFLORA DE BEBIDAS FERMENTADAS.
1
_[ '-(0\/
, "
1 l' - t"d
, ",
Lactobacillus pavarii: a) Colonia superfi-
cial; b) Profunda en agar del lquido For-
ti (S, 45); c) Colonia superficial de micro-
organismos y de estria sobre agar en d -
( X 450 ) ( S. Pavari ).
Seccin de un granulo de
ginger-beer (X . 500) (S.
Ward).
Bacterium Vermiforme: L y M
formacin progresiva de un fi-
lamento encapsulado, N fila-
mento con capsula unilateral;
P masa mucosa (S. Ward).
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Estas observaciones se consideran nuevas y difciles de interpretar, pero se -
resalta el paralelismo que existe entre la forma de clulas y ciertas funciones de fer-
mentacin, aunque con algunas excepciones.
La visible relacin de la fermentacin de las pentosas ( P ) con la morfo-
loga de las bacterias, da a este caracter importancia. Respecto al ataque del cido -
ctrico, es corriente que sea por los cocos que actuan de la siguiente forma ( P - ) y
( A +) y por el contrario por los bacilos que actuan en la siguiente ( X + ) y ( P + ) -
con lo que se confirma claramente las diferencias de actuacin de las dos formas bac-
terianas, como tambin sucede con la configuracin ptima del cido lctico formado.
PROPORCION EN LA QUE APARECEN GENERALMENTE LAS
DIFERENTES FORMAS DE BACTERIAS LACTICAS
Generalmente los cocos son ms frecuentes que los bacilos en la fermenta-
cin malolctica. La proporcin t:n que se presentan ambas formas puede depender
del clima de la acidez del mosto que el mismo clima condicione Peynaud expone -
los % en que aparecen cocos y bacilos, horno y heterofermentativos, no habiendo -
acuerdo entre lo que se en climas diversos, como Francia y Sur Africa, pero
en expone lo siguiente:
Todos los grupos de bacterias se encuentran en los vinos alterados, lo mis-
mo que en los vinos con fermentacin malolctica. Sin embargo, los bacilos se ais-
lan especialmente en vinos enfermos, y los cocos sobre todo en vinos con la fermenta-
cin malolctica en actividad.
En un vino enfermo Peynaud dice no haber encontrado ms que bacterias -
lcticas pertenecientes a un solo grupo. Por el contrario la fermentacin malolctica
de un vino joven se efectua bajo la influencia de una mezcla de especies de bacterias.
Habiendo aislado en un mismo vino cocos y bacilos, cocos ( A + ) y ( P - ), cepas -
que atacan que no atacan al cido ctrico, otras que atacan no al cido trtrico, -
y cepas que presentan pH- umbrl de crecimiento, diferente.
De aqu que la fermentacin malolctica no es forzosamente realizada por
una sola especie.
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CLAVES DE CLASIFICACION
Bacilos homofermentativos.
Fermentan las pentosas y el cido ctrico ..
No fermentan (no fermentan el . ctrico ..
las pentosas P- ( fermentan el . ctrico ..
Bacilos heterofermentativos.
P + C+
P - C-
P - C +
4 cepas.
9 cepas.
10 cepas.
No fermentan las ( atacan al . mlico .
pentosas ( P -) (no atacan al . mlico ..
Fermentan la arabinosa ( A + ) ..
Fermentan la xilosa ( X + ) .
Fermentan la arabinosa y la xilosa ( P + ) .
Lactobacillus fructvoras
Lactobacillus trichoides.
Betabacterium caucasicum.
Lactobacillus hilgardii.
Lactobacillus brevis.
COCOS HETEROFERMENTATIVOS
Se considera que los cocos heterofermentativos pertenecen al gnero Leuco-
nostoc, pero la dificultad de una base segura de clasificacin ha dado lugar a frecuen-
tes dudas y contradiciones Peynaud expone como la ms recomendable la siguiente -
fundada en la fermentacin de las pentosas:
1 - no fermentan
las pentosas
11 - fermentan -
las pentosas
A - no forman (Leuconostoc cremosis - Grupo I
dextrana ( Leuconostoc lactis - Grupo 11
B - forma la - (Leuconostoc dextrnicum - Grupo IV
dextrana
A - no forman (Leuconostoc mescnteroides - Grupo III
dextrana
B - forman la - (a - no fermentan la arabinosa = Leuconos-
dextrana toc mesenteroides - Grupo V
( b - fermenta la arabinosa = Leuconostoc -
mesenteroides - Grupo VI
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Segn Garvie, tampoco es completamente satisfactorio esta clasificacin con
base en la fermentacin de las pentosas, y del estudio de cepas aisladas de vino, consi-
dera un sptimo grupo" los cocos gram-positivos que forman gas a partir de la gluco-
sa, y se multiplican a pH 25, Y perteneciente al gnero Leuconostoc, la denomina -
Leuconostoc oenos.
Finalmente expone Peynaud una clave de clasificacin de Leuconostoc ais-
lados de vino.
1 - No crecen a pH inferior a pH = 5
II - Crecen a pH in-
ferior a 5
( no fermentan la pentosa ( P - ) Leuconostoc gr-
( cile.
( fermentan las pentosas ( X + ) Leuconostoc oenos.
Destaca variedade de inters enolgico:
a) Fermentan la arabinosa ( A + )
b) Fermenta xilosa ( X + )
c) Fermenta arabinosa la xilosa ( P + )
CONCLUSIONES ENOLOGICAS
Se ha podido comprobar en regiones como Burdeos, el gran nmero de ce-
pas aisladas y la diversidad de especies presentes entre ellas una docena de especies -
ha sido considerada como bien definida y numerosas no clasificadas.
Aislamientos de cepas que han podido ser realizadas en el fruto, mosto y -
vino joven, presentando Peynaud las siguientes proporciones:
- Jugo de prensado ( en laboratorio) de racimos vendimiados lo ms asp-
ticamente posible, y sin corregir despus el pH 25 %
- Jugos de prensado ( en laboratorio ) de racimos vendimiados a lo ms -
aspticamente posible pero corregido pH a 3,8 y no sembrados con leva-
duras .. oooo oo oooooo oo oo oooo oooo........ 600/0
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- Jugos a su pH y sembrados con levadura 5 %
- Agua de lavado de racimos 31 %
Del pH = 3,1 a 3,5 que considera natural en la regin hay una 'gran perdi-
da de bacterias malolcticas de la uva la mosto.
Ensayos de vinos jvenes embotellados y conservados a 25
Q
de temperatura,
pudo comprobar que al cabo de varias semanas que solo 3 vinos de 33 conservaron -
su acidez inicial, acusando actuacin de bacterias malolcticas, que comprob en la -
proporcin de un 90% de las existentes. Considerando que de enfermedad haba un
0,9 %'
BACTERIAS UTILES y BACTERIAS PERJUDICIALES
Se puede afirmar que, no existe la bacteria lctica ideal, que de lugar a la -
fermentacin ms o menos perjudicial para las cualidades del vino.
En numerosos factores, especialmente el pH Y presencia no de azcares, -
pueden influir limitando la actuacin de las bacterias en uno u otro sentido, y poder
con algunas especies tener fermentaciones malolcticas prcticamente puras, degene-
rar en una enfermedad.
BACTERIAS MALOLACTICAS DE LOS VINOS

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Mic. Acidovorax Mic. Variococcus
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Mic. Malolacticus Flora de un vino con -
formo de c. lctico.
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