Introduccin Objetivo Fundamento Procedimiento Resultados Observaciones

Trabajo Prctico N 3 DETERMINACIN DE LA SENSIBILIDAD DE LAS BACTERIAS A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)

INTRODUCCIN La resistencia de las bacterias es el principal obstculo para la eficacia teraputica de los antibiticos, pues no slo puede anular la accin curativa si se manifiesta en el curso del tratamiento, sino que tiene a la larga consecuencias todava ms graves para el conjunto de la poblacin, ya que provoca la desaparicin de las cepas susceptibles y la propagacin de las resistentes. Ese es el motivo por el cual la determinacin de la sensibilidad de las bacterias a los antibiticos haya adquirido tanta importancia y sea indispensable para hacer de los antibiticos un uso racional y para preservar la eficacia de este grupo tan valioso de agentes teraputicos. El conocimiento de la sensibilidad a los antibiticos, del microorganismo causante de una enfermedad, no es slo importante para hacer la seleccin inicial del agente teraputico correspondiente, sino que adems en aquellos casos en los cuales el paciente presente intolerancia a determinado frmaco, permite seleccionar el ms adecuado para ese paciente en particular.

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Los antibiogramas son mtodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio especficas y estandarizadas. La meta principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clnico algunas recomendaciones sobre la terapia que puede ser ms apropiada en pacientes con una infeccin especfica. No obstante, la correlacin exacta entre los resultados in vitro y la respuesta clnica es muchas veces difcil de predecir, ya que existen numerosos factores que influencian la interaccin de los agentes antimicrobianos y los microorganismos en un determinado paciente. Entre los factores podemos resaltar:

Factores del agente antimicrobiano

o o o o o

Farmacocintica Unin a protenas del plasma Vas de administracin Accin bacteriosttica o bactericida Concentracin en el sitio de la infeccin

Factores del husped

o o o o o o

Enfermedad Estado inmunolgico Formacin de absceso Presencia de cuerpo extrao Funcin renal y heptica Cumplimiento del tratamiento

Factores del microorganismo

o o o o

Virulencia Alta concentracin de microorganismos Infeccin mixta Desarrollo de resistencia durante el tratamiento

La metodologa usada para realizar el antibiograma toma en consideracin algunos de estos factores para determinar ms eficientemente cmo un microorganismo podra responder in vivo a un determinado antibitico. Existen diversos mtodos para determinar la sensibilidad bacteriana a los antibiticos, presentando adems cada uno de estos mtodos, mltiples variantes.

3.2

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Cualquiera que sea el mtodo seleccionado, el medio de cultivo a emplear ha de ser aquel que permita un buen desarrollo del microorganismo cuya sensibilidad se determina y adems no debe ejercer ningn efecto inhibidor sobre la actividad antibacteriana de los antibiticos o quimioterpicos ensayados. Usualmente se utiliza el agar de Mueller-Hinton en las pruebas de sensibilidad de microorganismos aerbicos de rpido crecimiento. Cuando se trata de estreptococos u otros microorganismos exigentes, se le aade al Mueller-Hinton, 5% de sangre desfibrinada. De los mtodos existentes, el ms popular es el del disco de papel. La variante ms utilizada de este mtodo es la de Kirby Bauer, la cual consiste en utilizar una sola concentracin de antibitico y medir el tamao de la zona de inhibicin. OBJETIVO Realizar un ensayo de sensibilidad de un cultivo bacteriano a los antibiticos, usando el mtodo de Kirby Bauer. Interpretar los resultados y hacer el informe correspondiente. FUNDAMENTO En el mtodo de Kirby Bauer, el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre el cual se colocan discos impregnados con una concentracin conocida del antibitico. Las placas se incuban por 16-18 horas a 3537C. Durante la incubacin, el antibitico difunde radialmente desde el disco a travs del agar, por lo que su concentracin va disminuyendo a medida que se aleja del disco. En un punto determinado, la concentracin del antibitico en el medio es incapaz de inhibir al germen en estudio. El dimetro del rea de inhibicin alrededor del disco puede ser convertido a las categoras de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a tablas publicadas por los organismos encargados del control de tales mtodos, por ejemplo el Comit Nacional de Estandar de Laboratorios Clnicos de los Estados Unidos de Norteamrica (National Committee for Clinical Laboratories Standards). PROCEDIMIENTO Para obtener resultados confiables y reproducibles mediante este mtodo, es imprescindible seguir fielmente las instrucciones que daremos a continuacin: 1. 2. Funda el medio de cultivo y djelo enfriar a 45-50C. Vierta aspticamente suficiente cantidad de medio de cultivo en una placa de Petri, para obtener una capa de 4 mm de espesor. Para una placa de 10

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cm. de dimetro se requieren 30 mL de medio y para una de 15 cm se requieren 70 mL. 3. Deje solidificar el medio de cultivo y luego seque las placas durante 30 minutos antes de usarlas para la inoculacin. Inocule la placa mediante un hisopo estril utilizando una suspensin del germen de 18 a 24 horas de incubacin con una turbidez equivalente a 1,5 x 106 bacterias (Equivale al tubo No. 5 de la escala de Mc Farland). Para la inoculacin sumerja un hisopo estril en el cultivo y elimine el exceso rotndolo firmemente contra la pared interna del tubo. Frote el hisopo sobre la superficie del medio de cultivo. Repita esta operacin por tres veces sucesivas, rotando la placa para obtener una dispersin uniforme del inculo en toda la superficie. Coloque la tapa a la placa y deje secar el inculo por 3 a 5 minutos. Coloque los discos con los antibiticos sobre el agar mediante pinzas estriles o usando un aplicador de discos. Oprima los discos suavemente con una pinza para asegurar un buen contacto con el medio de cultivo. Los discos deben estar espaciados de manera que su distancia a la pared de la placa sea de 15 mm y entre ellos de 30 mm.

4.

5.

6. 7.

8.

Incube a 35 37C hasta el siguiente da (aproximadamente 18-19 horas). Si se requieren los resultados con rapidez se pueden leer las zonas de inhibicin despus de 6-8 horas de incubacin, pero estos resultados deben ser confirmados mediante una nueva lectura despus de la incubacin por las 18 -19 horas. La medida del dimetro de la zona de inhibicin se hace preferentemente desde el exterior de la placa, sin quitar la tapa, esto puede hacerse con una regla milimetrada, un vernier o cualquier otro Instrumento similar.

9.

10. Los resultados se interpretan de acuerdo con la tabla 1.

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11. Ensayos de control con microorganismos cuya sensibilidad se conoce, tales como el Staphyloccccus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922, deben ser efectuados simultneamente con el de los grmenes en estudio y las zonas de inhibicin obtenidas con ellos deben estar comprendidas entre los valores indicados en la tabla 2.

3.5

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TABLA 1. INTERPRETACIN DEL MTODO DE KIRBY BAUER

Agente antimicrobiano Dimetro de Contenido del en mm disco Resistente <o= BETALACTMICOS, PENICILINAS Ampicilina Enterobacteriaceae Ampicilina Estafilococos Ampicilina Enterococos Ampicilina Estreptococos hemolticos Mezlocilina Pseudomonas aeruginosa Mezlocilina Enterobacteriaceae Oxacilina Estafilococos Oxacilina Neumococos para evaluar sensibilidad a penicilina Penicilina G Estafilococos Penicilina Enterococos Penicilina Estreptococos hemolticos Piperacilina Pseudomonas aeruginosa Piperacilina Enterobacteriaceae 10 g 10 g 10 g 10 g 75 g 75 g 1 g 1 g 10 U 10 U 10 U 100 g 100 g 13 28 16 18 15 17 10 --28 14 19 17 17 14-16 ----19-25 --18-20 11-12 ------20-27 --18-20 17 29 17 26 16 21 13 20 29 15 28 18 21 la zona de inhibicin Sensible >o=

Intermedio

COMBIN. CON INHIBIDORES B-LACTAMASA Amoxicilina / Acido Clavulnico Estafilococos Amoxicilina / Enterobacteriaceae Ampicilina / Sulbactama Piperacilina / Tazobactama Enterobacterias Piperacilina / Pseudomonas aeruginosa Piperacilina / Esfafilococos meticilina S 20/10 g 20/10 g 10/10 g 100/10 g 100/10 g 100/10 g CEFALOSPORINAS Cefaclor Cefazolina Cefepima Cefixima Cefoperazona Cefotaxima Cefoxitina Ceftazidima Ceftixozima Ceftriaxona Cefuroxima sdica parenteral Cefalotina 30 g 30 g 30 g 5 g 75 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 14 14 14 15 15 14 14 14 14 13 14 14 15-17 15-17 15-17 16-18 16-20 15-22 15-17 15-17 15-19 14-20 15-17 15-17 18 18 18 19 21 23 18 18 20 21 18 18 19 13 11 17 17 17 --14-17 12-14 18-20 ----20 18 15 21 18 18

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CARBAPENEMS Imipenem Meropenem 10 g 10 g MONOBACTAMAS Aztreonam 30 g GLICOPPTIDOS Teicoplanina Vancomicina Enterococos Vancomicina Estafilococos 30 g 30 g 30 g AMINOGLUCSIDOS Amicacina Gentamicina Kanamicina Netilmicina 30 g 10 g 30 g 30 g MACRLIDOS Azitromicina Claritromicina Eritromicina 15 g 15 g 15 g TETRACICLINAS Minociclina Tetraciclina 30 g 30 g QUINOLONAS Ciprofloxacina Fleroxacina Nalidxico cido Norfloxacina Ofloxacina Trovafloxacina 5 g 5 g 30 g 10 g 5 g 10 g 15 15 13 12 12 13 16-20 16-18 14-18 13-16 13-15 14-16 21 19 19 17 16 17 14 14 15-18 15-18 19 19 13 13 13 14-17 14-17 14-22 18 18 23 14 12 13 12 15-16 13-14 14-17 13-14 17 15 18 15 10 14 --11-13 15-16 --14 17 15 15 16-21 22 13 13 14-15 14-15 16 16

OTROS ANTIMICROBIANOS Cloranfenicol Clindamicina Nitrofurantona Polimixina B Rifampicina Sulfonamidas Trimetoprima - Sulfametoxazol 30 g 2 g 300 g 300 U 5 g 300 g 1.25/23.75 g 12 14 14 8 16 12 10 13-17 15-20 15-16 9 - 11 17-19 13-16 11-15 18 21 17 12 20 17 16

3.7

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Tabla 2 CONTROLES DEL MTODO DE KIRBY BAUER

ANTIBITICO Ampicilina Bacitracina Cefalotina Cloramfenicol Colistina Eritromicina Gentamicina Kanamicina Meticilina Neomicina Novobiocina Oleandomicina Penicilina G Polimixina B Estreptomicina Tetraciclina Vancomicina

CONCENTRACIN DEL DISCO 10 g 10 U 30 g 30 g 10 g 15 g 10 g 30 g 5 g 30 g 30 g 15 g 10 U 300 U 10 g 30 g 30 g

DIMETRO DE LA ZONA DE INHIBICIN (en mm) CON S. aureus CON E. coli ATCC 25923 ATCC 25922 24-35 15-20 17-22 --25-37 18-23 19-26 21-27 11-15 22-30 8-14 19-27 19-26 19-26 17-25 17-22 18-26 17-23 22-31 19-28 26-37 7-13 12-16 14-22 12-20 19-28 18-25 15-19 -

RESULTADOS Antibiograma Germen ___________________________________

Antibitico

Concentracin

Dimetro de la zona de inhibicin

Interpretacin

3.8

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OBSERVACIONES Compare los resultados obtenidos por Ud. con los de algunos de sus compaeros. Anote sus conclusiones.

BIBLIOGRAFA Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales. Segunda edicin. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. Palavecino Rosales E. 1997. Boletn Escuela de Medicina. Pontificia Universidad Catlica de Chile.1997;26:156-160. URL: http://www.britanialab.com.ar/k07_04.html

Prof. Magaly Pedrique de Aulacio Febrero 2002

3.9