EXPLICACIN DE TRABAJOS PRCTICOS

COLORACIONES

Microbiologa General Carrera: Lic. en Biologa Molecular 2012

DIFERENCIA ENTRE CLULA PROCARIOTA Y CLULA EUCARIOTA

Morfologa bacteriana

Agrupaciones de cocos segn el plano de divisin

diplococos

estreptococos

sarcinas

estafilococos

Diferentes morfologas en bacterias bacilares

Espirilo: espiral rgida

Espiroqueta: flexible, enrollada como sacacorcho

Observacin de microorganismos
Microscopio ptico

OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
La observacin de los microorganismos se puede realizar: Examen en fresco (vivos sin teir)

Tcnicas de coloracin (teidos con colorantes)

Ventajas que presentan los microorganismos coloreados:

Proporciona el contraste suficiente entre la clula y el medio que la rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfolgicos. Permite el estudio de estructuras propias de la clula. Se pueden obtener mayores amplificaciones con el empleo del objetivo de inmersin del microscopio.

COLORANTES - Son compuestos orgnicos y cada tipo de colorante suele tener afinidad por determinadas estructuras celulares. - Muchos de los colorantes usados en microbiologa estn cargados positivamente (catinicos) y se combinan con compuestos celulares cargados negativamente, como cidos nucleicos y polisacridos cidos. - Colorantes catinicos: azul de metileno, cristal violeta, zafranina. - Son sales que en medio acuoso: CLAM CL- + AM+

Coloraciones
Las coloraciones se pueden clasificar en:
Examen en fresco Coloracin simple Coloraciones diferenciales: Coloracin de Gram Coloracin de Ziehl-Neelsen Coloraciones especiales: Tcnica de Moeller Tcnica de Wirtz-Conklin Impregnacin argntica de flagelos Tcnica de Burri Impregnacin argntica de Fontana Tribondeau

Cultivos bacterianos: 18 - 24 h
1. Preparacin del frotis

2. Secado

3. Fijacin Mtodos fsicos: calor Fijacin: preserva las estructuras

y las hace ms visibles

4.

5. Coloracin (simple o compuesta)

Mtodos qumicos: Calor: coagula las protenas y las alcohol portaobjetos, adhiere sobre elmetlico o etlico Enfriado deforma levemente pero no altera la afinidad

6. Lavado 7. Secado

8. Observacin al microscopio con objetivo de inmersin 100 x

MORDIENTE
Sustancia qumica que unida a los colorantes forma una laca que se adhiere fuertemente a la estructura

Se utiliza para estructuras muy difciles de teir.

Se puede agregar antes o despus de la adicin del colorante con el que formar la laca Ejemplos: lugol cido tnico coloracin de Gram impregnacin argntica

COLORACIN SIMPLE
Permite visualizar forma, tamao y disposicin de los microorganismos

1.- Hacer el frotis

2.- Secar la preparacin en la parte alta del mechero

3.- Fijar tomando el preparado desde un extremo, pasndolo 3 veces por la llama del mechero. 4.- Una vez fro, colorear con un solo colorante. 5.- Lavar, secar y observar.

Estructura del peptidoglicano

Esquema de la pared

Unidad repetitiva

Gram positivas

Gram negativas

PARED CELULAR DE BACTERIAS

GRAM POSITIVAS NEGATIVAS

GRAM

cidos teicoico: polmeros de fosfato de ribitol o fosfatos de glicerol

Esquema de pared celular

Membrana externa

cidos teicoicos c. Teicoicos entrelazados con el peptidoglicano

Capa lipoproteica

Peptidoglicano Membrana citoplasmtica Membrana citoplamtica

Gram (-)

Gram (+)

ETAPAS EN LA TINCIN DE GRAM

____________________________________________________ PASOS METODO GRAM (+) GRAM (-)

Colorante Mordiente

Cristal violeta Lugol

violeta violeta

violeta violeta

Decoloracin

Alcohol 95%
o alcohol-acet.

violeta

se decolora

Contraste

Fuscina o

violeta

rojo

zafranina
____________________________________________________

Coloracin de Gram

Alcohol

disuelve los lpidos de la pared bacteriana deshidratacin del peptidoglicano

Cmo se observan las bacterias y esporas segn la coloracin de Gram?

Gram (+)

Gram (-)

Levaduras

Esporas: Bacillus subtilis

Pared de bacterias cido alcohol resistentes (BAAR)

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN (BAAR)

Hacer el frotis-Secarlo-Fijarlo Cubrir con Fucsina Ziehl concentrada, calentar con hisopo encendido hasta emisin de vapores durante 10 min. El fenol y el calor facilitan la penetracin del colorante Decolorar con alcohol-cido Lavar-cubrir con Azul de metileno Lavar-Secar Observar

Cpsula bacteriana
Composicin qumica -Polisacridos -Protenas

Cpsula: estructura rgida Capa mucosa: se deforma con facilidad y no excluye partculas

ETAPAS EN LA COLORACIN DE CAPSULA (TECNICA DE BURRI)

1.- Preparar extendido (colocar en el extremo de un portaobjeto una gota de tinta china comercial) 2.- Emulsionar sobre esa gota una suspensin de grmenes cpsulados

3.- Con otro portaobjeto, efectuar un extendido fino. Secar y fijar a la llama.
4.-Cubrir con solucin de cristal violeta 2 min. 5.- Lavar cuidadosamente con agua corriente. Secar y observar.
CAPSULAS: REFRINGENTES SOBRE FONDO OSCURO Y EL CUERPO BACTERIANO TEIDO DE VIOLETA.

DIFERENTES ASPECTOS DE LA CAPSULA BACTERIANA

Klebsiella pneuminiae

Bacillus antrhacis

Streptococcus pneumoniae

ESPORAS Y ENDOSPORAS BACTERIANAS

ENDOSPORAS:

No es un mtodo de multiplicacin bacteriana sino una forma de reposo latente dentro del ciclo vital. Permanecen latentes por largos periodos de tiempo. La formacin de la endospora se da por la falta de los nutrientes esenciales No se presenta en la etapa exponencial del crecimiento bacteriano

ESPORAS Y ENDOSPORAS BACTERIANAS

rganos refringentes, esfricos u ovales, constituyen la forma de resistencia bacteriana ante deficiencia nutricional, radiacin, calor, cidos, altas temperaturas, etc. Son muy impermeables a los colorantes

ESPORAS Y ENDOSPORAS BACTERIANAS

TIPOS DE ENDOSPORAS: A. Central C. Subterminal D. Terminal

TIEMPO DE VIDA DE UNA ESPORA: Indefinido, hasta que las condiciones del medio sean favorables (Clostridium aceticum --- 30 aos)

COLORACION PARA ENDOSPORA: Moeller Wirtz Conklin

ETAPAS EN LA COLORACIN DE ESPORAS (TECNICA DE MOELLER) 1.- Frotis. Secar 2.- Fijar con alcohol absoluto, escurrir el alcohol y arder el resto. 3.- Lavar. Tratar con c. Crmico 5 min. Lavar. 4.- Cubrir con fuscina fenicada de Ziehl. Calentar 10 min. 5.- Decolorar con c. Sulfrico 5%. Descartar reactivo. Completar con alcohol. 6.- Lavar. Colorear con azul de metileno dil. 1 min. 7.- Lavar. Secar y observar. ESPORAS: ROJAS OTRAS ESTRUCTURAS: AZULES.

COLORACIN DE ESPORAS

Tincin de Moeller

Tincin de Wirtz Conklin

Estructura de un flagelo bacteriano

Diferentes disposiciones de flagelos bacterianos

Monotrica

Lofotrica

Anfitrica

Peritrica

IMPREGNACIN ARGENTICA PARA FLAGELOS

MORDIENTE: cido tnico REACTIVO PRECIPITANTE: Ag2O LAVAR: agua destilada

FLAGELOS SE VEN DE COLOR MARRN CLARO

Impregnacin argntica de Fontana Tribondeau: espiroquetas y espirilos MORDIENTE: cido tnico REACTIVO PRECIPITANTE: Ag2O

LAVAR: agua destilada

ESPIROQUETAS Y ESPIRILOS SE VEN DE COLOR MARRN OSCURO SOBRE FONDO PARDO CLARO.