P. 1
11- ADN Recombinante. Animales Transgenicos

11- ADN Recombinante. Animales Transgenicos

|Views: 247|Likes:
CLASE 11 DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
CLASE 11 DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

More info:

Categories:Types, School Work
Published by: Alexander Gabriel Rivero on Oct 31, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPTX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/04/2015

pdf

text

original

Técnicas moleculares para el aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de ADN específico

Esta tecnología se denomina: Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética

Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado

Herramienta básica
Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato. •Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar) •Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes

5´-acgtattccggaacatcgacctGAATCCactttagcgtagctaccgctcgcag- 3´ 3´-tgcataaggccttgtagctggaCTTAGGtgaaatcgcatcgatggcgagcgac- 5´

EcoRI: E. Coli BamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes: •Corte plano: extremos romos •Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos

Las enzimas de restricción tipo II:
Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos

Clonado de ADN
•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
•Vector de clonación (vehículo) •Organismo huésped (E. Coli) •Selección de vectores

Clonado de ADN
TEJIDO VECTORES

mRNA cDNA
(doble cadena metilado)

DNA DNA digerido LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE INTRDUCCION EN CELULA HUESPED

DNA CLONABLE

Biblioteca

(Screening-subclonado)

VECTORES
Construidos a partir de plásmidos y bacteriófagos naturales

Características

1) ORIGEN DE REPLICACION : Posee secuencias que permiten su propagación 2) MCS: (multiple cloning site) sitio para insertar el DNA a clonar- Posee sitios únicos para varias ER 3) MARCADORES DE SELECCIÓN: Confieren propiedades fenotípicas a la célula huésped.

TIPOS DE VECTORES

1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA

2) VECTORES DE EXPRESIÓN- Expresión de genes clonados

3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresión génica

TIPOS DE VECTORES DE CLONADO

 PLASMIDOS: FAGOS:  COSMIDOS:

Límite clonado 0.1- 10 Kb Derivados del bacteriófago Lambda, 8-25 Kb Combinación fago l y plásmido, 35-50 Kb Derivados plásmido F, 75-300 Kb

 BAC (Bacterial Artificial Chromosomes)

 Vectores derivados de Bacteriofago P1 , 100 Kb

 YAC (Yeast artificial Chromosome)

cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb

PLASMIDOS
Molécula DNA doble cadena circular extracromosomal que replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb) FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS  Resistencia a antibióticos  Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas)  Producción de toxinas (ej E.coli  Inducción de tumores (plantas)  Sistemas de Restricción-modificación  Producción de antibióticos (ej Streptomyces)  Resistencia a metales pesados enterotoxinas)

 Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)

CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS
 Nº DE COPIAS: Alto o bajo Nº de copias. El Nº de copias depende del tipo de ori de replicación 30 Replicones diferentes Bajo Nº de copias:1-5 copias Alto Nº de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias) CONJUGATIVOS O NO  GRUPO DE COMPATIBILIDAD

PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO
CARACTERISTICAS 1) ORI (derivados de ColE1) 2) POLILINKER (MCS) 3) MARCADORES DE SELECCIÓN

4) SECUENCIAS PARA SCREENING: b-Galactosidasa

MARCADORES DE SELECCIÓN Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector : - Marcadores de resistencia a antibióticos -Marcadores de auxotrofía (permiten sobrevivir en ausencia de un componente esencial ej aminoácidos)

MARCADORES DE SELECCIÓN
Ampicilina: Interfiere con síntesis de pared bacteriana Resistencia: gen bla (b-lactamasa) Tetraciclina: Inhibe síntesis de proteínas por unión a subunidad ribosomal 30s Resistencia: gen tet (proteína que se une a membrana bacteriana e impide transporte del antibiótico) Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading del mRNA Resistencia: gen kan (aminoglicosido fosfo transferasa modifica el antibiótico)

pUC19

Fago 

Vectores de clonado
•Fago  (2 sitios de corte) < 24 kb

•Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb

Formación de placa de lisis

Vectores de clonado

•Cósmido: extremos cos  + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb
•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas Cósmido

Huésped: E. coli
Introducción del vector recombinante en el huésped: •Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma

•Fago  (transducción, inserción en DNA huésped)
•Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)

Selección de vectores recombinantes
•Plásmido: resistencia a antibióticos

•Fago  : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de  si contiene el inserto foráneo)

ETAPAS DE CLONADO EN PLÁSMIDOS

DIGESTION con ER : Plásmido y ADN a clonar

LIGACION (in vitro, ligasa)
TRANSFORMACION ( bacterias competentes) SELECCIÓN SCREENING

Como mejorar la reacción de ligación
Desfosforilación del vector: fosfatasa alcalina Ligación como una reacción bimolecular en dos etapas 1º reacción intermolecular entre el vector y el fragmento

favorecida por una elevada concentración de extremos

2º reacción intramolecular
favorecida por una baja concentración de extremos

Como mejorar la reacción de ligación

TRANSFORMACION Y SELECCION
TRANSFORMACION Bacterias competentes: Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc Eficiencia:107 cel/ug DNA

Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos )
Ef: 108cel/ug DNA SELECCIÓN Presión de selección : crecimiento en presencia de antibiótico

Métodos de selección de clones recombinantes

para detectar la mólecula de plásmido que posee inserto b-galactosidasa (no es concluyente)

Mapeo de restricción
PCR (colony PCR)  Hibridización in situ en la colonia con sonda específica

Operón Lactosa

Selección de clones recombinantes mediante alfa complementación

Métodos de selección
 Resistencia a antibióticos

La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina
El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina

Plásmido pBR322

Métodos de selección
 Resistencia a antibióticos

La resistencia la confieren genes que porta el vector
Sin plásmido Sin inserto Con plásmido Con inserto Con plásmido Sin inserto

Con tetraciclina

Con ampicilina y tetraciclina

Vectores de expresión
Proteínas expresadas en E. coli
1) Proteínas de fusión:
Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target. Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión purificación protege de proteólisis a la proteína de interés mejora la solubilidad de la proteína estabiliza a la proteína de interés

Esquema genérico del vector
A

Promotor
ATG A B MCS

Secuencia “tag”: *Dominio con función enzimática *Señales topogénicas

B

Secuencias consenso para Corte con una proteasa

ori

Ampr

MCS

Sitio múltiple de clonado

Optimización de la expresión de proteínas en E. coli 1) Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNA Se requiere optimizar la traducción.

Secuencia de Shine Dalgarno: Secuencia complementaria a región en 16S rRNA (subunidad pequeña del ribosoma)

Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG mRNA 5’

UAAGGAGG AUUCCUCC

AUG

3’

3’

16S rRNA

5’

small ribosomal subunit

Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas: Inestables. Sin actividad biológica. Contaminantes procarióticos.

Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas • Esp. importantes para proteínas terapéuticas. • Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y funcionales a la proteína natural.
Modificaciones post-traduccionales – Formación de uniones disulfuro correctas. – Clivaje proteolítico del precursor inactivo. – Glicosilación- agregado de residuos de azúcar – Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación, agregado de grupos sulfato, agregado de ácidos grasos

Vectores de expresión eucariotas
Elementos para clonado en bacterias ori de replicación Marcador de selección bacteriano Sitios múltiples de clonado

Elementos específicos de vectores eucariontes
Promotor eucariota Señal de poliadenilación Secuencias Kozak y codón ATG Intrón Tags-proteínas de fusión ori de replicación eucarionte como el de SV40 (opcional) Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables) Segmentos de DNA para recombinación homóloga

Vector de expresión eucariota

Vector de fusión a EGFP

Expresión de proteínas fluorescentes
Proteína fluorescente verde

Hay dos tipos básicos de bibliotecas de ADN Genómicas cDNA
Bibliotecas de ADN o genotecas Es una colección de moléculas de DNA consistiendo de fragmentos del genoma entero (Librería genómica) o copias de todos los RNAm producidos por una célula o tipo celular (Librería de cDNA) insertado en un vector de clonación e introducido en una célula hospedera. Fuentes de RNA???.

Para que se construyen librerías: - Identificar genes. - Identificar secuencias regulatorias. - Identificar genes expresados diferencialmente. - Secuenciar genomas - Conocer secuencias de aminoácidos, en librerías de cDNA.

Clonado de gDNA y cDNA

Caminar sobre DNA

Construcción Biblioteca de ADNc
1. Purificación de ARNm 2. Síntesis de la primera ADNc. 3. Síntesis de la segunda cadena del ADNc. 4. Clonado en el vector

Purificación ARN

Purificación ARN

Purificación de mRNA
Oligo (dt) Celulosa
TTTTT TTTTT
AAAAAA AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

Poly A, hibridiza con Oligo (dt) T T T T TT
A AAA T TT T

A AAA T TT T A AAA T TT T A AAA T TT T

100 Mm NaCl

10 Mm Tris 1mM EDTA

AAAA AAAA AAAA

Poly mRNA eluido

Síntesis de la primera cadena de cDNA
• Primer método

Síntesis de la primera cadena de cDNA
• Segundo método

Ligación al vector

Adaptadores

Ligación

Cómo obtener un animal genéticamente modificado
Ratón transgénico: microinyección del ADN de interés en el pronúcleo.

Ratón knockout: inyección de células embrionarias modificadas con el gen de interés en el blastocisto.

Microinyección pronuclear para hacer un ratón transgénico

Los que desarrollan se llaman fundadores y son hemicigotas para el transgen.

Diferencias entre transgénico y knockout
target

gene

microinjection

targeting vector

neo

r

TK

homologous recombination

gene

neo

r

“transgenic”

“knockout”

Embryonic Stem Cells

• totipotent/pluripotent in vivo/in vitro • extraordinary proliferation potential in vitro • homologous recombination

Positive and Negative Selection of Targeted ES Cells target ES Cells neo
Recombinants with random insertion

r

TK

Selection for neor positive Con antibiótico G418

Selection for TK negative

ES cells with homologous recombination

Generation of Chimeras
X

Targeted ES cells

Goal: obtain germline transmission

Cómo “construir el transgen”
ADNc Promotor UTR

Intrón

Vector

Peces fluorescentes para todos!

You're Reading a Free Preview

Descarga
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->