DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA SOLUBLE

Protocolo:

Adicionar 9.9 mL de una solucin de Lactosa (100 g/L preparada en tampn acetato 0.1 M pH 4.5), en un tubo de ensayo. Incubar aproximadamente por 5 minutos a 40C hasta que el sustrato alcance la temperatura de reaccin. Adicionar 0.1 mL de la muestra enzimtica, previamente diluida con tampn acetato 0.1 M pH 4.5. Agitar suavemente y dejar reaccionar por 2 minutos en un bao a 40C. Cumplido el tiempo de reaccin, tomar 0,5 mL de la solucin y adicionar de 0,5 mL de NaOH 100 mM, para detener la reaccin. (Tubos eppendorf) Repetir el procedimiento variando el tiempo de reaccin (3,6,9,12,15 minutos). Realizar un blanco de reaccin adicionando 0,5 mL de sustrato y 0,5 mL de NaOH. Determinar la concentracin de glucosa mediante el mtodo de glucostat.

Protocolo: Determinacin de la concentracin de glucosa, protocolo.

En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL de la muestra de reaccin enzimtica. Adicionar 1 mL del reactivo de determinacin de glucosa. Incubar durante 10 minutos a 37C. Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm. Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampn y 1 mL del reactivo, y que tambin es incubado.

Interceptar en la curva de calibrado.

A. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE PROTENAS.

Protocolo: Colocar 1 mL del reactivo de Bradford. Adicionar 0.1 mL de la muestra en una dilucin adecuada (Concentracin de protena < 0.2 g/L). Agitar suavemente y esperar 10 min. para leer su absorbancia a 595 nm contra un blanco que reemplaza la muestra con agua.

Protocolo: Elaboracin de la curva de calibrado de protenas.

En un set de 6 tubos de ensayos preparar distintas soluciones de una protena patrn (ovoalbmina, cuya concentracin es de 0,2 g/L). En 6 tubos eppendorf colocar 1 mL del reactivo de Bradford y adicionar 0.1 mL de cada una de las diluciones preparadas anteriormente. Agitar suavemente y esperar 10 min. para leer su absorbancia a 595 nm contra un blanco que reemplaza la muestra con agua.