PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR ESCUELA DE BIOANALISIS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA 2 Lcda. Elena Granda M.

TEMA 7: Escala McFarland Objetivo: El estudiante aprenda a:  Preparar estándares para su utilización a nivel del laboratorio  Realizar comparaciones con cultivos inoculados con microorganismos Introducción El patrón o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos herméticamente cerrados, previamente calibrados y con una densidad óptica diferente originada por la aparición de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reacción entre el cloruro de bario (Cl2Ba) al 1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H2SO4) al 1% (0,36N). Esta turbidez puede interpretarse ópticamente o por métodos espectrofotométricos y cada una de ellas se corresponde a una concentración conocida de bacterias/ml. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (cél/ml) que genera una turbidez similar. Para asegurar la densidad del estándar de McFarland así preparado puede ser chequeado usando un espectrofotómetro con una celda de cuarzo de 1cm; para el estándar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede estar entre 0,08 a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estándar de McFarland puede ser verificado por ajuste de una suspensión de una cepa control (por ejemplo, E. coli ATCC 25922) a la misma turbidez, preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en placa. La suspensión así ajustada puede tener un conteo de 1,5x108 ufc/ml. Materiales:  Agar Plate count fundido  Tubos con 5 ml de BHI  Cajas petri estériles  Caja petri con cepa ATCC pura E.coli  Asas  Puntas azules estériles  Cloruro de Bario al 1%  Ácido sulfúrico al 1%  Perillas de seguridad  Pipetas serológicas de 1ml Equipos  Pipetas automáticas (1ml)  Incubadora 35-37°C  Turbidímetro  Espectrofotómetro  Mecheros  Baño María

5 x 108 Segunda Parte:  Leer en el turbidímetro la escala de McFarland realizada y copiar las DO obtenidas de acuerdo a cada tubo de la escala  Leer en el espectrofotómetro en el filtro 546nm la escala de McFarland realizada y copiar las DO obtenidas de acuerdo a cada tubo de la escala  Comparar las DO obtenidas en los dos equipos Tercera Parte:  A partir del tubo que contiene caldo BHI realice una escala McFarland 0.5 Cl2Ba 1% 0. aumente caldo BHI estéril al tubo inoculado y vuelva a realizar las mediciones de DO.5.95 UFC/ml 1. si al contrario está por debajo del valor esperado aumente colonias.  Al obtener la DO esperada ésta preparación con una pipeta automática colocar el 1 ml de caldo BHI inoculado a la caja petri estéril y añadir 15 ml de medio de cultivo TSA fundido. de arriba hacia abajo. realizar los movimientos respectivos (sentido de las manecillas de reloj. proceda de la siguiente manera: Tubo 0.  Espere a que se solidifique el agar e incube a 37°C por 48 horas .Procedimiento: Preparación: Se adicionan cantidades crecientes (o decrecientes según corresponda) de BaCl2*2H2O al 1 % (p/v) en H2SO4 al 1% (v/v) de acuerdo a la siguiente tabla para obtener la equivalencia deseada: Primera parte: Para preparar la escala de McFarland 05. con la cepa pura que se encuentra en la caja  Lea en el turbidímetro la DO de su siembra y compare con la DO obtenida en la escala McFarland  Si el resultado no es el esperado y está sobre el valor.05 H2SO4 1% 9. en L y en contra de las manecillas del reloj)para homogenizar la muestra.

Casos en los que se puede utilizar esta escala de turbidez. Anexo: Conservación: El estándar de McFarland puede ser almacenado hasta por 6 meses en la oscuridad y a temperatura ambiente entre 22º a 25ºC. Realice un recuento y compare si los resultados obtenidos concuerdan con lo esperado es decir 1. Sin embargo. Cuidados Descartar después de 6 meses o antes si su volumen es menor.5 x 108 UFC/ml. hasta que el precipitado blanco de sulfato de bario se haya disuelto en todo el medio. debe agitarse muy bien usando un shaker. Antes de cada uso. se recomienda almacenarse a ser posibles en refrigeración. Fundaméntelos Bibliografía correspondiente . Consulta: 1.

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