ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

Linfocito B

Reconocer antgeno Inmunoglobulinas de superficie

Clulas plasmticas Sintetizar y secretar inmunoglobulinas

Ribosomas de clulas plasmticas Traduccin de RNAm de las cuatro cadenas peptdicas Glicosilacin y secrecin de dichas cadenas

Heterogeneidad de inmunoglobulinas por sus diversas clases Variabilidad estructural de su parte variables

Necesidad de conocer a nivel gnico su regulacin y sntesis

Modelos genticos compatibles con la estructura de la inmunoglobulina, deban tener en cuenta:

La basta diversidad de especificidades de anticuerpo

La presencia en las cadenas pesadas y ligeras de la Ig de una regin variable y una regin constante

Existencia de isotipos con la misma especificidad antignica

 Teora de la lnea germinal: que el genoma contena gran cantidad de genes de Ig, y que el inmenso valor del Sistema Inmune para la supervivencia justificaba la asignacin de un segmento considerable del genoma a la codificacin de anticuerpos.

 Teora de la variacin somtica: el genoma posee una cantidad pequea de genes de Ig, a partir de los cuales se generan especificidades de anticuerpo en las clulas somticas por mutacin o recombinacin.

 Dreyer y Bennette: dos genes separados codificaban una misma cadena pesada o ligera de Ig, un gen para la regin V (variable) y el otro para la regin C (constante). Estos deban reunirse a nivel del DNA para formar un mensaje continuo que pudiera transcribirse y traducirse a una cadena pesada o ligera de Ig nica.

 Tonegawa y N. Hozumi en 1976, aparece un acumulo de conocimientos por los que se sabe que genes separados codifican las regiones V y C de las Ig, y que los genes se reordenaban en el curso de la diferenciacin de la clula B.

 Empleando tcnicas de digestin enzimtica del DNA de clulas B y posterior hibridacin con sondas de DNA complementario (cDNA), mediante la tcnica de Southern Blot.

 Durante diferenciacin de linfocitos desde etapa embrionaria hasta clula plasmtica, los genes V y C experimentan reordenamiento.

En el embrin, genes V y C separados por segmento grande de DNA. Durante diferenciacin, genes V y C se acercan y eliminan secuencia intermedia de DNA.

Organizacin multignica de genes de inmunoglobulina

Familias multignicas separadas en diferentes cromosomas codifican cadenas ligeras y y las pesadas. Cada familia contiene secuencias de codificacin segmentos gnicos, separadas por regiones que no codifican

 Cadenas ligeras y contienen segmentos gnicos V, J y C; segmentos VJ reordenados codifican regin variable de cadenas ligeras. Cadenas pesadas posee segmentos gnicos V, D , J y C; VDJ codifican regin variable. Segmentos gnicos C codifican regiones constantes.

Familia multignica de la cadena L

El segmento V y los 3 segmentos gnicos funcionales J codifican regin variable de cadena ligera, y cada uno de los 3 segmentos gnicos C codifica la regin constante de cada uno de los 3 subtipos de cadena (1, 2 y 3).

Familia multignica de la cadena

5 segmentos gnicos J (un seudogen) y un segmento gnico C nico. Los segmentos gnicos V y J codifican la regin variable de la cadena ligera , y el segmento gnico C codifica la regin constante.

Familia multignica de la cadena pesada

Un segmento gnico adicional codifica parte de la regin variable de la cadena pesada, se design D por diversidad, y su contribucin a la generacin de diversidad de anticuerpos.

REORDENAMIENTOS GNICOS DE REGIN VARIABLE

REORDENAMIENTOS GNICOS
Ocurren en una secuencia ordenada Maduracin de las clulas B Mdula sea Reordenamiento de la cadena pesada (H) cadena ligera (L) Produce clulas B maduras inmunocompetentes

 Las cadenas H y L de las Ig estn codificadas por distintos grupos de genes. En los linfocitos B maduros, los genes que codifican el dominio V de las Ig estn cerca delos que codifican la porcin constante (C).

REORDENAMIENTO VJ EN LA CADENA LIGERA

El dominio V de la cadena Ligera esta codificado por dos genes diferentes: Gen VL Gen JL La asociacin VL- JL, esta separada de la regin CL por un intrn. Esta configuracin es la que se transcribe a mRNA.

ORGANIZACIN DE LOS GENES

Dos clusters para la cadena L
L: ubicado en el cromosoma 2 L: ubicado en el cromosoma 22

Para la cadena L existen 40 genes funcionales V y 5 genes J y un gen C. Para la cadena L, existen 30 genes funcionales V y 4 genes J, de los cuales cada uno esta asociado con un gen C.

Los genes y reordenados contienen:

Exn lder intrn

Segmento VJ

2 intrn

Regin constante

 los intrones en el transcrito primario son eliminados por enzimas de procesamiento del RNA Los mRNA de cadena ligera se une a ribosomas y se traduce en la protena de cadena ligera. La secuencia lder en el extremo amino terminal dirige la cadena polipeptidica creciente hacia la luz del retculo y se escinde, de modo que NO existe en el producto protenico de cadena ligera terminado.

REORDENAMIENTO VDJ EN LA CADENA PESADA

El dominio V de la cadena H esta codificada por tres genes:
VH, DH y JH

El proceso de recombinacin somtica involucra dos etapas:

Asociacin del gen DH con el JH Porcin DH -JH rearreglada se asociar con el gen VH para generar el exn completo (VH DH JH) que codifica el dominio VH.

La asociacin de la regin VH con la regin CH se produce por corte y empalme del mRNA.

El reordenamiento de la regin variable produce un gen reordenado que consta de las siguientes secuencias:

Exn lder

intrn

Segmento VDJ

2 intrn

Segmentos gnicos C

 Una vez terminado el reordenamiento, la polimerasa de RNA puede unirse a la secuencia promotora y transcribir la totalidad del gen de cadena pesada incluidos los intrones. La poliadenilacin diferencial y el empalme de RNA eliminan los intrones y procesa el transcrito C y C. Se traducen estos dos mRNA y permite que la clula B madura exprese IgM e IgD.

MECANISMO DE LOS REORDENAMIENTOS DE DNA DE REGIN VARIABLE

SECUENCIAS SEAL DE RECOMBINACIN (RSS)

La recombinacin solo ocurre entre fragmentos gnicos que se encuentran en el mismo cromosoma y esta guiada por un RSS. Un RSS:
Se ubica en el lado 3 de cada segmento gnico V En el lado 5 de cada segmento gnico J Ambos lados de cada segmento gnico D

 Un bloque heptmero palindrmico, contiguo a la secuencia codificante Secuencia espaciadora de 12 0 23 nucletidos de longitud
Corresponden a los giros de la hlice del DNA Un giro o dos giros respectivamente

Seguida por otro bloque nonmero

 La recombinacin somtica suele seguir la regla 12/23 Esta regla asegura la asociacin correcta de fragmentos VH-DH-JH ya que los genes VH-JH pueden asociarse con los fragmentos DH, pero no pueden asociarse entre si.

RECOMBINASAS
La recombinacion V(D)J, que se lleva a cabo en las uniones entre RSS y secuencias de codificacion, son catalizadas por enzimas que se denominan RECOMBINASAS V(D)J.

 En 1990 David Schatz identific dos genes activadores de la recombinacin

RAG-1 RAG-2

Son necesarias para medir la unin V(D)J. Forman parte de esas recombinasas. Actividad de endonucleasa Se expresan en linfocitos en desarrollo.

RECOMBINACIN DE SEGMENTOS GNICOS

1. Reconocimiento de secuencias seal de recombinacin (RSS) por enzimas recombinasa seguida de sinapsis 2. Escisin de una cadena de DNA por RAG-1 Yrag-2 3. El grupo OH 3 libre en la cadena de DNA, ataca el enlace fosfodiester que une la cadena opuesta a la RSS formando una horquilla

4. Corte de la horquilla con objeto de generar sitios para la adicin de nucletidos de regin P. 5. Adicin de nucletidos de regin N, en los extremos cortados de las secuencias de codificacin por la transferasa de desoxinucleotidilo terminal 6. Reparacin y ligadura para unir secuencias de codificacin, catalizadas por enzimas reparadoras de rotura de doble cadena normal (DSBR)

 La recombinacin tiene como consecuencia la formacin de una UNION CODIFICADORA, situada entre las secuencias de codificacin, y una unin seal entre las RSS. Cuando los dos segmentos gnicos se encuentran en la misma orientacin transcripcional, la unin da lugar a la eliminacin de la unin seal.

REORDENAMIENTOS PRODUCTIVOS E IMPRODUCTIVOS

PRODUCTIVO: la unidad VJ o VDJ resultante puede traducirse en su totalidad y producir un anticuerpo completo IMPRODUCTIVO: la unidad resultante contenga mltiples codones de detencin, que interrumpen la traduccin. Si no se producen un gen de cadena pesada y uno de cadena ligera reordenados en fase, la clula B muere por apoptosis.

Generacin de diversidad de anticuerpos

Existen siete medios de diversificacin de anticuerpos Mltiples segmentos gnicos de la lnea germinal Unin combinatoria V(D)J Flexibilidad de Unin Adicin de nucletido de la regin P (adicin P) Adicin de nucletido de regin N (adicin N) Hipermutacin Somtica Asociacin combinatoria de cadenas ligeras y pesadas

Segmentos gnicos V, D y J y su combinacin

48 VH, 23 D y 6 JH de cadena pesada 41 V, 5 J, de cadena ligera 34 V, 5 J de cadena ligera K

Combinacin VJ y VDJ
La contribucin de mltiples segmentos gnicos de la lnea germinal a la diversidad de anticuerpos es amplificada por el reordenamiento aleatorio de estos segmentos Los segmentos gnicos de cadena pesada VDJ pueden formar 6624 combinaciones Los segmentos gnicos de cadena ligera generan 205 combinaciones Los segmentos gnicos de cadena ligera forman 170 combinaciones

Flexibilidad de unin
Se lleva durante la unin seal y unin codificadora La unin seal es solida pero en la unin codificadora muchas veces es imprecisa La flexibilidad de unin produce muchos reordenamientos improductivos pero tambin productivos Los reordenamientos productivos codifican aminocidos alternativos lo que incrementa la diversidad Las variaciones estn dentro de la tercera regin hipervariable (CDR3) CDR3 contribuye a la unin antgeno por la molcula de anticuerpo

Adicin P
Se da en el rompimiento de la horquilla en el reordenamiento Puede ocurrir cuando se rompe en una posicin que deja corta una cadena al final de la secuencia codificadora Cuando se aaden nucletidos por las enzimas reparadoras (adicin P) se crea una secuencia palindrmica en la unin de codificacin (nucletidos P) La variacin en que se corta la horquilla da la variacin de la secuencia de la unin codificadora.

Adicin N
Solo ocurre en la cadena pesada Se da por la adicin de nucletidos durante la unin D-J y A-DJ Es catalizada por una transferasa de desoxinucleotidilo terminal Se pueden aadir asta 15 nucletidos Son completamente aleatorias Al final un regin variable se da por VhNDhNJh Ocurre en la CDR3

Hipermutacin somtica
Se da en la regiones V ya reordenadas Son nucletidos individuales en unidades VJ o VDJ que sustituyen a otros nucletidos Altera potencialmente la especificidad Ocurre normalmente en centros germinales tras una semana de inmunizacin con un antgeno en una reaccin de la clula B dependiente de clula T Se dirige a regiones VJ o VDJ con secuencias de DNA de alrededor de 1500 nucletidos

Su frecuencia es de 10 a la menos 3 por par de bases por generacin 100000 mas frecuente que la mutacin espontanea La longitud combinada de la cadena pesada y la cadena ligera es de alrededor de 600 pb por lo que se puede dar al menos una mutacin por cada dos divisiones celulares en el par de genes Vh y Vl. La mayora de las mutaciones son sustituciones En gran medida es aleatoria Los puntos calientes son secuencias de nucletidos y ciertas secuencias palindrmica dentro de las regiones Vh y Vl que son susceptibles a la hipermutacin somtica

Las hipermutaciones ocurren a lo largo de los segmentos VDJ y VJ, pero en clulas B maduras estn agrupadas dentro de las CDR de las secuencias de Vh y Vl en donde es mas probable que modifiquen la afinidad total para antgenos El resultado es el incremento de la afinidad por antgeno Se seleccionan de manera preferencial las clulas B con los receptores mas afines Este proceso se llama maduracin de afinidad.

Combinacin de cadenas pesadas y ligeras

Se pueden generar 6624 genes de cadena pesada y 375 de cadena ligera de la regin variable Si todos esto se combinan podran dar 2 484 000 combinaciones No es probable que todas se combinen La combinacin no es del toda aleatoria No todos los segmentos gnicos se utilizan con la misma frecuencia

No se puede calcular con precisin el numero de combinaciones totales de inmunoglobulinas aunadas a este ultimo evento estn las combinaciones que podran darse con la unin flexible, la adicin P y la N y la hipermutabilidad.

Cambio de genes de la regin constante

Despus de la estimulacin antignica de la clula B, el DNA de cadena pesada puede experimentar un reordenamiento adicional en el que la unidad VDJ suele combinarse con cualquier segmento Ch Se le llama cambio de clase o de isotipo Se da debido al cambio de secuencias laterales de DNA conocidas como regiones de cambio ubicadas a 2 a 3 Kb hacia 5 de cada segmento Ch En estas regiones de cambio de 2 a 10 Kb se integran mltiples copias de repeticiones cortas GAGCT y TGGGG. Una hiptesis sostiene que una protena recombinasa reconoce estas secuencias y llevan a cabo la recombinacin Las citosinas actan como factores de cambio hacia una clase particular de inmunoglobulina

Por ejemplo la interleucina 4 induce el cambio de clase C a C o C En el cambio de clase se crea un producto de escisin circular que contiene C con el extremo 5 de la regin de cambio 1 (S1) y el extremo 3de la regin de cambio (S) En el cambio de C1 a C los productos de escisin contienen porcienes de cambio , y junto. El cambio de clase depende de 3 elementos Regiones de cambio Una recombinasa de cambio Las seales de la citocina que determinan el isotipo al cual cambia la clula B y una enzima llamada desaminasa de citidina inducida pro activacin (AID)

Es la mediadora clave de la hipermutacin y la recombinacin por cambio de clase Pertenece a una familia de enzimas llamada editoras de RNA La AID desamina citosinas selectas en determinados mRNA al cambiar las citosinas por uracilos modificando las instrucciones de codificacin Puede modificar el DNA directamente por medio de la desaminacin de citosinas, cuyo resultado es la formacin de uracilo, el sitio de desaminacin puede ser reparado por un par A-T en vez de G-C o el uracilo puede eliminarse y sustituirse por cualquier base

Desaminasa de citidina inducida por activacin (AID)

Expresin de genes de inmunoglobulina

Los transcritos primarios de genes de cadena pesada y reordenados contienen secuencias de DNA intermedias que incluyen intrones que no codifican y segmentos J que se pierden durante el reordenamiento de V(D)J El transcrito primario debe procesarse para eliminar la secuencias de DNA intermedias y los exones restantes conectarse por un proceso llamado empalme de RNA, los sitios de empalme se encuentran en los limites de intrones y exones y sealan donde ocurrir el empalme El transcrito primario en el ncleo elimina cada una de esta secuencias intermedias para formar el producto final el mRNA El mRNA sale del ncleo y es traducido por ribosomas en cadenas H o L completas

Transcrito primario diferencial de la cadena pesada

El transcrito primario de la cadena pesada de inmunoglobulina puede generar diferentes mRNA Puede crear formas secretadas o unidas a membrana Puede expresar de manera simultanea la IgM e IgD

Expresin de la inmunoglobulina de membrana o secretada

Una inmunoglobulina puede existir en forma unida a membrana o secretada Difieren en la secuencia de aminocidos de los dominios carboxilo terminales de la cadena pesada (CH3/ CH3 en IgA, IgD e IgG y CH4/CH4 en IgE e IgM La forma secretada tiene un secuencia hidrfoba de unos 20 aminocidos en el dominio carboxilo terminal En la forma unida a membrana la reemplaza una secuencia de 40 aminocidos que contiene un segmento hidrfilo que se extiende fuera de la clula, un segmento hidrfobo transmembranal y un segmento hidrfilo corto en extremo carboxilo terminal que se extiende hacia el interior del citoplasma

La secuenciacin del DNA del segmento gnico C posee cuatro exones (C 1, 2, 3 y 4) que corresponden a los dominios de la IgM El exn C4 contiene una secuencia nucletido (S) en su extremo 3 que codifica la secuencia hidrfila en el dominio CH4 de la IgM secretada Dos exones adicionales M1 y m2 se localizan hacia 3del exn C4 El exn M1 codifica el segmento transmembrana y el M2 el citoplasmtico del dominio CH4 de la IgM unido a membrana Los elementos gnicos CH tiene dos exones M1 y M2 adicionales El transcrito primario de cadena pesada tiene dos secuencia de poliadenilacion (poli-A) El sitio uno esta en el segmento C en el extremo 3del exon C4 El sitio dos en el extremo 3del exn M2

Si ocurre la escisin del transcrito primario y la adicin de la cola de poli-A en el sitio uno, se pierden los exones M1 y M2. La escisin de los entrones y el empalme de los exones restantes crean entonces mRNA que codifica la forma secretada de la cadena H Si la segmentacin y poliadenilacion del transcrito primario suceden en el sitio dos, entonces resulta un patrn de superposicin. La superposicin elimina la secuencia S en el extremo 3del exn C4 y une el resto del exn C4 con los exones M1 y M2 lo que produce mRNA para la forma membranal de cadena pesada. Las clulas B vrgenes maduras slo liberan anticuerpo unido a membrana y las clulas plasmticas anticuerpos secretados

Expresin simultanea de IgM e IgD

El proceso diferencial del RNA tambin sustenta la expresin simultanea de IgM e IgD unidas a membrana por clulas B maduras Segmentos gnicos C y C estan cerca entre si en el gen reordenado y debido ala ausenca de un sitio de cambio entre ellos posibilita que se transcriba toda la regin VDJC Este transcrito contiene cuatro sitios de Poli-A Los sitios uno y dos se relacionan con C y el tres y cuatro con C

 Si se escinde el sitio dos el mRNa codifica la cadena pesada Si es en el sitio cuatro despues de los exones C la superposicin anula los exones C y produce mRNa que codifica la cadena pesada de IgM Si la escisin y la poliadenilacion es en el sitio uno o tres en celulas plasmaticas y la superposicin ulterior dan lugar a la forma secretada de las cadenas pesadas de y

Sntesis, ensamblaje y secrecin de inmunoglobulinas

Se presentan varios problemas para esta fase Los mecanismos de reordenamiento gnicos, unin imprecisa V(D)J y la adicin de nucletidos generan codones de detencin prematuros o producen inmunoglobulinas que no se pliegan o ensamblan Las clulas plasmticas producen 1000 molculas de anticuerpo por segundo que tiene que desplazar hasta la membrana plasmtica Se necesita mucho control y coordinacin del trafico intracelular

Los poliptidos se sintetizan en el RER Los mRNA de cadenas pesadas y ligeras se trasladan a los polirribosomas del RER separados Las cadenas recin sintetizadas contienen una secuencia lder amino terminal que gua las cadenas hacia la luz del RER donde se escinde El ensamblaje vara ente las clases de inmunoglobulina En IgM las cadenas H y L se ensamblan dentro del RER y la resultante se ensambla ocn otra igual para formar una completa En la IgG se une H2L y luego se configura a H2L2 Las enzimas catalizan los enlaces disulfuro intercadena par ensamblar los polipptidos y los enlaces SS intracadena para el plegamiento

 La glucosilacin tambin son por enzimas en el RR Los anticuerpos son enviados a su destino dependiendo de su domino carboxilo terminal (hidrfobo o hidrfilo) La hidrfoba se ancla en la membrana y toma residencia aqu La hidrfila se secreta como molcula libre pro medio de vesculas El RE tiene mecanismos de control La protena de unin a cadenas pesadas BiP se une molculas de anticuerpo que no se ensamblaron pro completo y las retiene en el RE Estas protenas son marcadas con ubicuitina y se sometidas a protelisis

Regulacin de la transcripcin de genes de inmunoglobulina

Los genes de inmunoglobulina slo se expresan en la clulas del linaje B y dentro de este se expresan en diferentes proporciones durante distintas etapas del desarrollo Promotores: secuencia de nucletidos que promueven el comienzo de la transcripcin de ENA en un sentido especifico Intensificadores: secuencias nucletidos que activan la transcripcin de la secuencia promotora en una forma independiente de la orientacin Cada segmento gnico VH y VL tiene un promotor localizado hacia 5 de la secuencia lder Una secuencia rica en AT ( caja o vagn) TATA sirve para el inicio de la transcripcin de RNA El proceso se lleva mediante la RNA polimerasa II

Los promotores contienen un octmero que confiere especificidad El cot-1 se encuentran en muchas clulas peor el Oct-2 solo en clulas B Los intensificadores, constituyen sitios de unin para varias protenas las cuales muchas son factores de transcripcin. El gen E2A codifica dos protenas que pueden experimentar un empalme alternado para generar dos protenas, que se unen a intensificadores de y esenciales para el desarrollo de la clula B

El reordenamiento del DNA acelera en gran medida la transcripcin La lnea germinal estn muy distantes de los promotores, el reordenamiento coloca un promotor y un intensificador lo bastante cerca para que el intensificador modifique la transcripcin del promotor cercano

Inhibicin de expresin de genes de inmunoglobulina en las clulas T

A pesar de la similitud de los procesos, el reordenamiento completo de las cadenas H y L de los genes solo ocurre en clulas B y el reordenamiento completo del gen de TCR se limita a clulas T La unin de una protena expresada por clulas T al intensificador de la cadena que se unen a intensificadores de la cadena no mutada previene en condiciones normales de la unin V -J en condiciones normales