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=
.
cv pi
pi cv
cv
pi
C A
C A
k'
k
K
= =
(ecuacin 1)
ENSAYOS PREVIOS Y OPTIMIZACIN DEL MTODO CROMATOGRFICO
__________________________________________________________________________________
89
Las variaciones entre estos datos, resultado de ambos mtodos de
cuantificacin, se aslan mediante ensayos de comparacin de medias. Se hace para
cada compuesto una prueba de hiptesis de comparacin de medias en la que se
calcula el nivel de significacin (s) que es la probabilidad de que una igualdad
establecida no se cumpla. Es decir, dicho de otro modo, es el riesgo de que los
valores no se encuentren en el intervalo o lmite de confianza fijado (95%).
Proponemos una hiptesis a contrastar o hiptesis nula (H
0
) que establece
que la verdadera diferencia media es cero, es decir que el mtodo de cuantificacin
no ha producido ningn cambio en los resultados obtenidos. Si se rechaza la
hiptesis nula, diremos que estamos en presencia de una diferencia
estadsticamente significativa (S), y el valor de la significacin ser menor de 0.05,
en caso contrario de que s sea mayor de 0.05 diremos que la diferencia es no
significativa (NS):
H
0
= no hay diferencia entre ambos mtodos de cuantificacin
Si s< 0.05 se rechaza la H
0
= la diferencia es significativa (S)
Si s> 0.05 se acepta la H
0
= la diferencia no es significativa (NS)
Se comprueba con ello la homogeneidad de los datos obtenidos. Para el
estudio se utiliza como sofware estadstico SPSS, y se realiza en cada una de las
metodologas en las que se utilizan los dos mtodos de cuantificacin.
4.7 - Clculo de los rendimientos de extraccin
Para su clculo se utilizaron disoluciones de vino sinttico con todos los
compuestos a estudiar en concentraciones conocidas, sometidas al proceso de
extraccin, al extracto se le aade el p.i. y se inyectadan en el cromatgrafo de
gases.
Obtenidos los valores de A
cv
y A
pi
(reas de las seales del compuesto y del
patrn interno, respectivamente) y conocida la concentracin de patrn interno y el
valor de la K correspondiente, calculamos la C
cv
extrada segn la ecuacin 1. A
partir de estos datos y teniendo en cuenta el volumen final de fase orgnica y los
g de compuestos iniciales, se calculan los g extrados y el rendimiento de
extraccin (%) de cada compuesto a partir de las frmulas siguientes:
f.o. final Volumen c.v. C extrado compuesto g =
100
iniciales g
extrados g
extrado compuesto % =
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
90
Como ya se dijo, todos estos estudios se hacen para cada tipo de extraccin,
y se realizan por cuadruplicado, as los valores que aparecen en las tablas de los
rendimientos son la media de los resultados obtenidos en cada ensayo.
CAPTULO 5
Procedimientos de extraccin
empleados
PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIN EMPLEADOS
__________________________________________________________________
93
5.- PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIN EMPLEADOS
Uno de los objetivos planteados en esta memoria es el estudio y
optimizacin de diferentes mtodos de extraccin de los compuestos voltiles a
partir de muestras de vino sinttico y posterior aplicacin a muestras de vino real.
Segn la bibliografa consultada, existen muchos procedimientos para la
extraccin de compuestos voltiles en el vino (captulo 1), hay numerosos trabajos
en este campo y todos encaminados a encontrar un sistema sencillo y prctico para
realizar el estudio de la extraccin.
Los mtodos de extraccin que se han puesto a punto se han seleccionado
adems de por su accesibilidad, por utilizar tanto mtodos clsicos como alguno
ms actual. En la figura 5-1 se muestran los procedimientos utilizados. Para todos
ellos, los extractos obtenidos se analizaron por CG con detector FID y como
estudio particular, tambin los extractos obtenidos con microextraccin por sales se
analizaron por CG con detector de absorcin molecular UV-Visible.
- Figura 5-1: Procedimientos de extraccin empleados
CONTINUO
ULTRASONIDOS
EXTRACCIN
LQUIDO-
LQUIDO
(ELL)
MICRO-
EXTRACCIN
CON SALES
MICRO-
EXTRACCIN
EN FASE
SLIDA
(SPME)
EXTRACCIN
EN FASE
SLIDA
(SPE)
PROCEDIMIENTOS DE
EXTRACCIN UTILIZADOS
DISCONTINUO
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
94
La estructura de exposicin seguida en cada una de las metodologas
utilizadas es la siguiente:
1. Introduccin del procedimiento utilizado, en la que se da una explicacin
de la metodologa que va a usarse, anotando los campos en los que se ha
venido utilizando y realizando un estudio bibliogrfico.
2. Material especfico utilizado, si procede, en dicho procedimiento,
independientemente del material ms comn utilizado para todos ellos y
expuesto en el apartado 3 de instrumentacin general.
3. Procedimiento operativo, donde se expone a modo de receta la forma de
trabajo con las condiciones idneas, las cuales se optimizarn en los
apartados siguientes.
4. Optimizacin de las diferentes variables que afectan a la extraccin.
5. Caractersticas analticas de los compuestos seleccionados en dicho
mtodo de extraccin.
6. Cuantificacin en muestras de vino real.
CAPTULO 6
Extraccin lquido-lquido en
discontinuo (ELLd)
- Introduccin
- Procedimiento operativo
- Optimizacin de variables
- Disolvente
- Volumen de muestra
- Condiciones ptimas
- Caractersticas analticas
- Cuantificacin en muestras de vino real
- Rectas de calibrado
- Patrn interno
EXTRACCIN LQUIDO- LQUIDO EN DISCONTINUO (ELLd)
__________________________________________________________________________________
97
6.- EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN DISCONTINUO
(ELLd)
6.1.- Introduccin
La extraccin lquido-lquido (ELL) es un proceso de transferencia de una o
varias sustancias desde una fase lquida a otra tambin lquida inmiscible con la
primera. El campo de aplicacin es muy amplio, no slo como tcnica de
separacin, sino tambin como mtodo de concentracin de alguna especie previa a
su determinacin, cuando el mtodo analtico utilizado no tiene una sensibilidad
suficiente para detectar y/o cuantificar la baja concentracin de esa especie en la
muestra inicial.
Para conseguir que el proceso sea satisfactorio, adems de la seleccin
adecuada de las condiciones tcnicas de operacin, la composicin de las fases
utilizadas desempea un papel decisivo. Aunque se pueden emplear combinaciones
de dos disolventes orgnicos inmiscibles, generalmente una fase es orgnica (la que
permite la separacin de los compuestos) y otra acuosa (suele ser la que
inicialmente contiene las mezclas de compuestos a separar).
Una vez realizada la extraccin, el extracto, o fase separada que contiene las
sustancias que buscamos, es el que se utiliza en la determinacin.
La ELL en discontinuo (ELLd), consiste en un nico equilibrio entre ambas
fases. Los resultados obtenidos con esta tcnica pueden mejorarse modificando la
relacin de volmenes, ya que esta variable acta como factor multiplicativo de la
relacin de distribucin.
La extraccin est regida por la ley de distribucin, propuesta por Berthelot
y Jungfleisch y desarrollada por Nerst, la cual establece que en el equilibrio, la
relacin de solutos entre dos fases inmiscibles es constante, siempre que dicho
soluto se encuentre en la misma forma en ambas fases
94
.
94
Cela R. et al.,Tcnicas de separacin en Qumica Analtica, (2002)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
98
Considerando el equilibrio:
donde A es el soluto distribuido entre la fase acuosa (a) y la orgnica (o), la
constante que define este equilibrio se denomina constante de particin (o de
reparto), K
d
, y su expresin es:
siendo a
A
la actividad del soluto en cada fase (que se relaciona directamente con la
concentracin, a travs de los coeficientes de actividad). Para disoluciones diluidas,
actividad y concentracin coinciden.
La constante es proporcional a la solubilidad relativa del soluto en ambas
fases. La proporcin de soluto extrado, depende no slo de la constante de
distribucin, sino tambin de la relacin de volmenes de fase orgnica y acuosa y
de la tcnica utilizada.
Para realizar la extraccin en discontinuo se utiliza un embudo de
decantacin, que es un recipiente, generalmente de vidrio, en forma de pera o
cilndrico. Se cierra al exterior con un tapn de vidrio o tefln situado en la parte
superior y con una llave en la parte inferior. Su volumen debe ser dos o tres veces
superior a la suma de los volmenes de ambas fases, para que se pueda agitar
adecuadamente el sistema. En nuestro caso concreto, los embudos utilizados tenan
un volumen de 100 y 250 mL, pero en el mercado hay de diferentes tamaos.
La muestra de vino y los disolventes se introducen por la parte superior del
embudo y, una vez cerrado, se agita vigorosamente para conseguir el mayor
contacto posible entre las fases y favorecer as la transferencia de una fase a otra de
los compuestos a estudiar. El tiempo que debe durar la agitacin, es otro de los
parmetros a optimizar en cada caso concreto, ya que depende del tiempo que tarda
el sistema en alcanzar el equilibrio de distribucin. El tiempo suele oscilar entre 30
segundos y 30 minutos. Si uno de los disolventes es muy voltil es necesario,
durante la agitacin, dejar escapar el exceso de presin invirtiendo el embudo y
abriendo la llave. Cuando se alcanza el equilibrio, el sistema se deja en reposo
hasta que las fases se separan, lo cual a veces puede ser lento debido a que se
forman emulsiones. El modo de recoger las fases una vez separadas depender de
la densidad relativa de los disolventes utilizados.
( ) ( ) o a
A A
( )
( )
a A
o A
d
a
a
K =
EXTRACCIN LQUIDO- LQUIDO EN DISCONTINUO (ELLd)
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Adems de la extraccin simple, tambin se utiliza la extraccin por etapas,
que consiste en realizar de modo secuencial un nmero determinado de
extracciones simples retirando despus de cada equilibrio la fase orgnica y
poniendo en contacto la fase acuosa con un volumen nuevo de fase orgnica.
Cuanto mayor es el valor de la relacin de distribucin menor ser el nmero de
extracciones necesarias para conseguir la transferencia de los compuestos a la fase
orgnica.
6.2.- Procedimiento operativo
La metodologa de trabajo que se sigui se muestra a continuacin (figura 6-
1) y se expone a modo de receta con las condiciones ya optimizadas que sern
estudiadas en el apartado siguiente:
Poner en un embudo de decantacin 25.0 mL de vino real, o vino sinttico, que
contenga los compuestos a estudiar. Extraer con 10.0 mL de diclorometano, con
agitacin manual durante 5 minutos. Separar las fases. Tomar 5.0 mL de la
fraccin orgnica, aadir el patrn interno a concentracin conocida e inyectarla
en el cromatgrafo.
- Figura 6-1: Esquema de trabajo en ELLd
25.0 mL de vino o vino sinttico
Fase acuosa Fase orgnica
10.0 mL de diclorometano
C.G.
desechar
p.i
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__________________________________________________________________
100
Las condiciones cromatogrficas utilizadas son las que se expusieron en el
captulo 4, apartado 4.4.5.
6.3.- Optimizacin de variables
El primer paso fue elegir un mtodo inicial, de entre los propuestos en los
datos bibliogrficos y a partir de ste ir haciendo las modificaciones oportunas en
funcin de las variables optimizadas. El mtodo se eligi adems de por la
informacin bibliogrfica, por la experiencia previa en este tipo de extraccin. Los
disolventes y otras variables se van modificando a lo largo del estudio de
optimizacin.
En primer lugar se comprob que a partir de la primera extraccin no se
obtena cantidad apreciable de ninguno de los compuestos seleccionados en
extractos sucesivos. Por este motivo se realiza la extraccin en una sola etapa. El
volumen de disolvente utilizado fue de 10.0 mL, la agitacin siempre manual y el
tiempo de agitacin elegido fue de cinco minutos, ya que la experiencia previa nos
haba demostrado que tiempos mayores a estos cinco minutos, no cambiaban
apreciablemente los rendimientos.
Las disoluciones con las que trabajamos fueron de vino sinttico con los
compuestos seleccionados, que enunciamos a continuacin, en el rango de
concentraciones comprendido entre 13.3 y 96.2 g mL
-1
.
Los compuestos utilizados fueron:
- 1-Hexanol (1H)
- 2-Feniletanol (2FE)
- 3-Metil-1-butanol (3M1B)
- Acetato de 2-feniletilo (AFE)
- Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B)
- cido decanoico (AD)
- cido hexanoico (AH)
- cido octanoico (AO)
- Hexanoato de etilo (HE)
- Octanoato de etilo (OE)
- Succinato de dietilo (SD)
EXTRACCIN LQUIDO- LQUIDO EN DISCONTINUO (ELLd)
__________________________________________________________________________________
101
6.3.1.- Disolvente
En el primer estudio se realiz una comparacin entre distintos disolventes
de extraccin con diferentes caractersticas extractivas, o bien mezclas de los
mismos
95
, con la finalidad de mejorar los rendimientos de extraccin obtenidos. Se
fijaron el resto de variables, que son las mostradas en la tabla 6-1 y slo se
modific el disolvente.
Respecto a las condiciones cromatogrficas utilizadas fueron las optimizadas
que se muestran en la tabla 4-6 (pgina 82).
VARIABLES CONDICIONES
Volumen de muestra
Volumen de disolvente
Tiempo de agitacin
Modo de agitacin
25.0 mL
10.0 mL
5 minutos
manual
- Tabla 6-1: Condiciones iniciales para la optimizacin en ELLd
La eleccin de los disolventes se hizo en base a las referencias bibliogrficas
encontradas sobre el tema. Los disolventes ensayados se indican a continuacin:
- diclorometano (DM)
- ter de petrleo (EP)
- hexano (HX)
- metilisobutilcetona (MIBC)
- pentano (P)
- pentano/diclorometano (3:2)
- pentano/diclorometano (2:1)
95
Cobb C. et al, J. Agric. Food Chem., 26, 197-199, (1978)
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102
Para realizar el estudio se prepararon disoluciones de vino sinttico cada una
de las cuales se extrajo con el disolvente objeto de estudio, siguiendo el
procedimiento operativo indicado anteriormente. Finalmente, a los extractos
obtenidos se les aadi el p. i. y se analizaron por CG-FID.
A partir de los resultados experimentales obtenidos y siguiendo la
metodologa de clculo expuesta en el apartado 4-7 de este trabajo, se calcularon
los rendimientos de extraccin que se exponen en la tabla 6-2. Los resultados
mostrados son la media de tres determinaciones, cada una de las cuales se inyect
cuatro veces en el cromatgrafo.
COMPUESTO DM EP HX MIBC P P/DM
3/2
P/DM
2/1
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
56.82.5
81.10.9
54.21.5
72.92.0
56.93.4
85.31.7
71.82.6
85.81.9
83.40.4
50.22.9
83.24.0
58.02.3
78.20.7
44.31.3
41.21.9
53.23.2
61.01.5
51.02.6
74.21.6
75.10.8
34.12.6
62.13.9
55.12.6
54.30.9
32.11.6
52.21.8
44.43.6
53.11.4
44.12.5
62.11.5
55.20.9
20.02.8
42.23.7
14.03.5
31.12.9
2.300.7
14.12.9
8.200.5
52.25.5
21.21.6
61.03.6
54.03.6
4.200.6
12.31.5
45.32.3
31.41.3
20.21.9
42.01.9
41.13.6
44.12.1
40.12.5
56.11.8
51.10.9
32.32.7
43.03.6
51.12.4
63.11.6
51.41.8
50.11.9
42.13.9
50.02.5
33.02.6
71.31.9
50.20.8
34.02.6
71.13.9
52.02.6
61.10.7
50.01.5
50.22.1
40.04.1
49.32.6
34.22.9
68.12.0
50.00.9
32.12.9
69.03.6
- Tabla 6-2: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en ELLd
A partir de los resultados se observa que los mejores rendimientos
corresponden en la mayora de los compuestos a las extracciones realizadas con
diclorometano como puede verse en la figura 6-2, por lo que los estudios se harn a
partir de ahora con diclorometano. Estos datos coinciden con los encontrados en la
bibliografa consultada
96
. En el caso de la MIBC se puede observar la gran
irreproducibilidad de los resultados obtenidos.
96
Stan Kung M., Am. J. Enol. Vitic., 3, 187-190, (1980)
EXTRACCIN LQUIDO- LQUIDO EN DISCONTINUO (ELLd)
__________________________________________________________________________________
103
Compuestos
AD
AO
2FE
AH
AFE
SD
OE
1H
HE
3M1B
A3M1B
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
100
80
60
40
20
0
DM
EP
HX
MIBC
P
P/DM (3/2)
P/DM (2/1)
- Figura 6-2: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
con distintos disolventes en ELLd
Los datos anteriores estn obtenidos con los valores de rea de pico. A modo
de ejemplo, en el anexo 6.1 se indican los rendimientos a partir de la altura de pico
obtenidos con diclorometano.
Anexo 6.1. Rendimientos de extraccin (%) para ELLd con DM respecto a las
alturas y reas
Alturas reas
Acetato de 3-metil-1-butilo 56.3 3.0 56.8 2.5
3-Metil-1-butanol 81.0 1.2 81.1 0.9
Hexanoato de etilo 53.4 1.3 54.2 1.5
1-Hexanol 72.6 2.1 72.9 2.0
Octanoato de etilo 56.1 3.6 56.9 3.4
Succinato de dietilo 86.4 2.1 85.3 1.7
Acetato de 2-feniletilo 70.1 2.2 71.8 2.6
cido hexanoico 86.0 2.6 85.8 1.9
2-Feniletanol 83.5 0.7 83.4 0.4
cido octanoico 49.9 3.1 50.2 2.9
cido decanoico 81.7 3.6 83.2 4.0
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
104
Como puede verse, se obtienen resultados similares utilizando las reas o las
alturas del pico, por lo que a lo largo de esta memoria se emplearn los valores de
las reas.
6.3.2.- Volumen de muestra
Se realizaron distintos estudios de extraccin modificando el volumen inicial
de vino sinttico tomado y procediendo a extraer como se expuso anteriormente
(10.0 mL de DM, agitacin manual durante 5 minutos). Los volmenes de muestra
utilizados fueron 25.0, 50.0, 75.0 y 100 mL. A partir de los cromatogramas
obtenidos se calcularon los rendimientos de extraccin (%) (tabla 6-3).
Comprobamos as, como era de esperar, que el volumen de muestra influye
en los rendimientos obtenidos, de manera que van disminuyendo a medida que
aumentamos el volumen de muestra, por lo que en los ensayos posteriores se
trabaj con un volumen de muestra de 25.0 mL.
COMPUESTOS 25.0 mL 50.0 mL 75.0 mL 100 mL
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
56.82.5 39.50.5 31.62.8 24.21.5
81.10.9 67.91.3 59.11.5 52.11.9
54.21.5 36.72.0 29.01.8 23.03.5
72.92.0 58.00.9 46.83.5 39.71.9
56.93.4 40.13.5 31.22.5 25.24.2
85.31.7 73.81.5 66.02.9 58.72.5
71.82.6 55.92.9 46.12.1 37.83.8
85.81.9 74.63.0 67.34.5 61.65.5
83.40.4 70.91.8 61.61.9 56.12.7
50.22.9 34.13.5 24.73.2 20.04.8
83.24.0 70.84.5 62.43.5 54.76.2
- Tabla 6-3: Rendimientos de extraccin (%) con distintos volmenes de muestra en
ELLd
EXTRACCIN LQUIDO- LQUIDO EN DISCONTINUO (ELLd)
__________________________________________________________________________________
105
La figura 6-3 es la representacin grfica de los resultados obtenidos. Se
observa claramente la disminucin en el valor de los rendimientos de extraccin a
medida que se va aumentando el volumen de la muestra.
Volumen de muestra (mL)
100 75.0 50.0 25.0
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
100
80
60
40
20
0
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
- Figura 6-3: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
con distintos volmenes de muestra en ELLd
6.3.3.- Condiciones ptimas
En la tabla 6-4 se muestran las variables de extraccin optimizadas y las
condiciones cromatogrficas utilizadas en este procedimiento de extraccin, y en la
tabla 6-5 los rendimientos obtenidos para cada uno de los compuestos en estas
condiciones.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
106
VARIABLES CONDICIONES
Disolvente
Volumen de muestra
Volumen de disolvente
Tiempo de agitacin
Modo de agitacin
Temperatura detector
Columna
Temperatura inyector
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
Programa de temperatura
Diclorometano
25.0 mL
10.0 mL
5 minutos
Manual
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (0.9 mL min
-1
)
Helio (30 mL min
-1
)
400 mL min
-1
30 mL min
-1
0.2:1
2.0 L
4 C min
-1
60 C 170 C
4 min 12 min
- Tabla 6-4: Condiciones ptimas en ELLd
A3M1B 3M1B HE 1H OE SD AFE AH 2FE AO AD
56.8 81.1 54.2 72.9 56.9 85.3 71.8 85.8 83.4 50.2 83.2
- Tabla 6-5: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (ELLd)
6.4.- Caractersticas analticas
Se obtuvieron las rectas de calibrado para cada uno de los compuestos
seleccionados. Para ello se prepararon diferentes disoluciones de los compuestos a
estudiar en DM con concentraciones entre 0.500 y 200 g mL
-1
, se les aadi el p.i.
y se inyectaron en las condiciones ptimas. A los valores obtenidos de pendiente,
lmite de deteccin y lmite de cuantificacin se les aplic el rendimiento de
EXTRACCIN LQUIDO- LQUIDO EN DISCONTINUO (ELLd)
__________________________________________________________________________________
107
extraccin de cada uno de los compuestos en este mtodo de extraccin (tabla 6-5),
tal y como se expuso en el apartado 4-5.
COMPUESTOS
Pendiente
(mL g
-1
)
1
o.o.
(intervalo de
confianza de 95%)
2
L.D.
(g mL
-1
)
3
L.C.
(g mL
-1
)
4
s
r
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.009670.00017
0.02500.0006
0.006490.00011
0.01910.0002
0.01350.0001
0.04770.0009
0.2100.005
0.01120.0002
0.01010.0001
0.01060.0002
0.02010.0003
-4.91E
-2
0.90E
-2
-4.01E
-2
0.31E
-2
-3.71E
-2
0.21E
-2
-1.01E
-3
0.90E
-3
-2.01E
-3
0.92E
-3
-6.10E
-3
0.10E
-3
-2.01E
-2
0.19E
-2
-7.01E
-2
0.71E
-2
-5.71E
-2
0.33E
-2
-5.40E
-2
0.14E
-2
-8.90E
-2
0.05E
-2
0.0512
0.0207
0.0774
0.0276
0.0368
0.0113
0.0237
0.0338
0.0512
0.0479
0.0253
0.169
0.0685
0.255
0.0919
0.123
0.0370
0.0787
0.113
0.169
0.158
0.0841
5.0
5.1
4.2
1.7
3.1
2.2
3.2
5.1
4.0
2.2
3.1
- Tabla 6-6: Caractersticas analticas ELLd
1
o.o.= Ordenada en el origen
2
L.D.= Lmite de deteccin
3
L.C.= Lmite de cuantificacin
4
s
r
(%) = Desviacin estndar relativa porcentual
6.5.- Cuantificacin en muestras de vino real
Una vez optimizada la ELLd con muestras de vino sinttico, pasamos a
aplicar la metodologa a muestras de vino reales. Para realizar el estudio
seleccionamos cuatro vinos tintos jvenes del 2001 de la DOCa Rioja.
Se sigui el procedimiento operativo indicado en apartados anteriores y SE
analizaron con las condiciones cromatogrficas que se indican en la tabla 6-4. A
partir de los cromatogramas obtenidos, la cuantificacin se hizo tanto por
interpolacin en las rectas de calibrado, como por el mtodo del patrn interno,
como se expuso en el apartado 4.6.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
108
6.5.1.- Rectas de calibrado
Interpolando los valores de rea de pico obtenidos de las muestras de vino,
en las rectas de calibrado, y teniendo en cuenta los rendimientos de extraccin
obtenidos, se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla 6-7.
COMPUESTOS CONCENTRACIONES (g mL
-1
)
muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
5.700.31
2114
5.050.31
31.10.2
4.710.11
1.860.01
nd
3.980.13
15.60.2
15.40.1
2.600.30
4.990.71
2322
5.410.37
30.90.2
4.300.12
1.580.01
nd
3.800.10
16.80.3
12.20.2
2.330.31
5.620.60
2234
5.320.42
29.70.2
4.910.13
1.680.01
nd
3.620.12
10.20.1
13.10.2
2.620.34
5.270.21
2413
5.520.33
30.50.2
4.810.16
1.320.01
nd
3.780.13
17.90.3
13.40.1
2.540.32
- Tabla 6-7: Cuantificacin en vino real mediante ELLd. Rectas de calibrado
(nd: no detectado)
Observamos que las variaciones en los cuatro vinos son pequeas, pues
aunque se trata de vinos elegidos al azar, son vinos de la misma zona geogrfica y
de la misma aada.
6.5.2.- Patrn interno
Empleando el mtodo del patrn interno, tal y como se expuso en el apartado
4-6, en la tabla 6-8 se indica la concentracin obtenida para cada compuesto en las
cuatro muestras de vino analizadas.
EXTRACCIN LQUIDO- LQUIDO EN DISCONTINUO (ELLd)
__________________________________________________________________________________
109
COMPUESTOS
CONCENTRACIONES (g mL
-1
)
muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
5.320.11
2063
4.950.21
29.80.1
4.530.21
1.450.01
nd
4.070.10
14.90.1
15.70.2
2.410.20
4.780.61
2423
5.360.25
29.80.1
3.990.11
1.360.02
nd
3.650.11
15.90.4
12.60.3
2.300.30
5.610.40
2133
5.260.32
29.60.2
5.010.10
1.570.01
nd
4.010.11
15.20.1
12.10.2
2.530.40
5.160.11
2313
5.460.23
30.60.1
4.780.12
1.280.01
nd
3.950.11
17.20.2
13.70.1
2.470.30
- Tabla 6-8: Cuantificacin en vino real mediante ELLd. Patrn interno
(nd: no detectado)
Todos los valores de concentraciones encontrados entran dentro de los
mrgenes habituales para este tipo de vinos.
Tambin observamos a partir de los valores obtenidos, que los resultados son
similares utilizando ambos mtodos de cuantificacin. Con la finalidad de conocer
si la diferencia entre los dos mtodos de cuantificacin era significativa o no, se
realiz para cada compuesto una prueba de hiptesis (tal y como se expuso en el
apartado 4.6.3) en la que se calcul la significacin (s). Tomando como
probabilidad al 95% (nivel de confianza), se vi si el valor de la s era mayor de
0.05 con lo cual se aceptaba la hiptesis nula H
0
, que establece que la verdadera
diferencia media es cero, es decir, no existe diferencia significativa.
En la tabla 6-9 se indican los resultados obtenidos.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
110
5 10 15 20 25 30 35 40
Minutos
-0.3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
mVolts
A3M1B
(5.779)
3M1B
(7.801)
HE (8.627)
1H (12.136)
3O (13.411)
OE (14.689)
SD (21.778)
AFE (25.462)
AH (26.407)
2FE
(27.914)
AO (31.642)
AD (38.781)
COMPUESTOS
s SIGNIFICACIN
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.252
0.836
0.645
0.783
0.867
0.246
*
0.252
0.282
0.131
0.402
NS
NS
NS
NS
NS
NS
*
NS
NS
NS
NS
- Tabla 6-9: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (ELLd)
(NS: no significativa, *: no hay datos)
Como podemos ver, a partir de los resultados obtenidos, para ninguno de los
compuestos analizados existe diferencia significativa entre los valores obtenidos
por ambos mtodos de cuantificacin.
En la figura 6-4 se muestra el cromatograma obtenido en vino sinttico con
la ELLd para los compuestos voltiles seleccionados.
- Figura 6-4: Cromatograma. Vino sinttico, ELLd
CAPTULO 7
Extraccin lquido-lquido en continuo
(ELLc)
- Introduccin
- Material especfico
- Procedimiento operativo
- Optimizacin de variables
- Disolvente
- Tiempo de extraccin
- Condiciones ptimas
- Caractersticas analticas
- Cuantificacin en muestras de vino real
- Rectas de calibrado
- Patrn interno
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO (ELLc)
__________________________________________________________________
113
7.- EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO
(ELLc)
7.1.- Introduccin
Actualmente, aun con la introduccin de nuevos sistemas de extraccin, se
han abierto nuevas lneas de trabajo que reactualizan la ELL en continuo
97
ya que
se han producido profundas transformaciones que automatizan los sistemas y
facilitan su uso, respecto a los utilizados anteriormente
98
.
Estos procesos utilizan flujos de fase acuosa y de disolvente orgnico en
contracorriente, separados a travs de una membrana, por donde se produce el
intercambio de productos. Si el disolvente es voltil puede ser reciclado mediante
destilacin y condensacin. El sistema de preconcentracin, es tal que permite su
adaptacin a sistemas de CG, consiguindose lmites de deteccin espectaculares.
7.2.- Material especfico
El sistema de extraccin es diferente segn la densidad de la fase orgnica
utilizada. Si la fase orgnica es menos densa que la acuosa (figura 7-1a), el
disolvente se introduce gota a gota (1) en la disolucin acuosa mediante un sistema
de inmersin. Cuando el disolvente alcanza un nivel determinado pasa a un matraz
lateral por rebose (2), el cual se encuentra en ebullicin. El disolvente evaporado es
condensado, y se hace pasar nuevamente por la disolucin acuosa. Si el disolvente
es ms denso que la fase acuosa (como es el caso del diclorometano respecto al
vino) (figura 7-1b), se adiciona ste desde la parte superior, tambin mediante
goteo (3), y se va separando al matraz lateral que se encuentra en ebullicin, a
travs de un sistema de vasos comunicantes (4). La ventaja principal de esta tcnica
respecto a la extraccin lquido-lquido en discontinuo es que el disolvente pasa
repetidas veces sobre la disolucin acuosa que contiene los compuestos voltiles.
97
Gutirrez A.R. et al, Vitivinicultura, 9, 44-47, (1990)
98
Dudruet V. et al, Sci. Aliment., 3, 413-426, (1983)
Etivant P.X., Connaiss. Vigne Vin, 4, 247-265, (1987)
Guichard E. et al, Sci. Aliment., 3, 427-438, (1983)
T CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
114
(a) (b)
- Figura 7-1: Extractores en continuo para disolventes menos (a) y ms (b) densos que
la muestra
7.3.- Procedimiento operativo
La metodologa de trabajo que se sigui fue la siguiente:
Poner en el extractor 250 mL de muestra (vino o vino sinttico) y 100 mL de
diclorometano. A las dos horas de tener el sistema en funcionamiento tomar 1.0
mL de extracto aadir el patrn interno y analizarlo por cuadruplicado por CG-
FID.
Las condiciones cromatogrficas utilizadas son las que se expusieron en el
captulo 4, apartado 4.4.5.
7.4.- Optimizacin de variables
Inicialmente, se realizaron una serie de ensayos previos con un extractor
para disolventes menos densos que el vino, probando en este caso como
disolventes isooctano, hexano y pentano, pero operativamente result funcionar
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO (ELLc)
__________________________________________________________________
115
mal, por lo que en ensayos posteriores nicamente se utiliz el extractor para
disolventes ms densos que la muestra a extraer.
Los compuestos a estudiar fueron los mismos que en la ELLd, y los
parmetros optimizados fueron el tipo de disolvente y el tiempo de extraccin.
7.4.1.- Disolvente
El estudio se hizo con diclorometano (DM) y con una mezcla de
diclorometano/hexano (DM/HX 1/1), ya que segn datos bibliogrficos la mezcla
de disolventes est muy difundida en este tipo de extracciones.
El volumen de muestra utilizado fue 250 mL, el volumen de disolvente 100
mL y el tiempo que estuvo funcionando el sistema trabajando antes de sacar el
extracto fue de dos horas. Al extracto se le aadi el patrn interno (3-octanol) a
concentracin conocida y se analiz por cuadruplicado en el CG-FID.
Una vez obtenidos los cromatogramas, calculamos los rendimientos de
extraccin. Los resultados obtenidos a partir del rea del pico, para los dos
disolventes ensayados se indican en la tabla 7-1.
COMPUESTOS
DM DM/HX (1/1)
Acetato de 3-metil-1-butilo 98.72.5 46.62.0
3-Metil-1-butanol 59.92.8 55.73.2
Hexanoato de etilo 88.42.6 81.72.7
1-Hexanol 85.910.2 60.08.4
Octanoato de etilo 1065 92.75.4
Succinato de dietilo 91.14.1 72.83.3
Acetato de 2-feniletilo 70.54.0 58.95.8
cido hexanoico 48.34.1 36.75.1
2-Feniletanol 80.14.4 73.54.8
cido octanoico 80.92.9 71.42.6
cido decanoico 82.71.7 76.12.0
- Tabla 7-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en ELLc
Como podemos observar los resultados obtenidos con diclorometano son
ms elevados que con la mezcla diclorometano/hexano. Para el diclorometano los
T CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
116
valores resultaron entre 70 y 106% para los steres, entre un 60 y 86% para los
alcoholes y entre un 48 y un 83% para los cidos.
La representacin grfica de los resultados obtenidos se muestra en la figura
7-2.
Compuestos
AD
AO
2FE
AH
AFE
SD
OE
1H
HE
3M1B
A3M1B
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
120
100
80
60
40
20
DM
DM/HX
- Figura 7-2: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
con distintos disolventes en ELLc
Los rendimientos de extraccin obtenidos ya sea a partir de reas o de alturas
de picos son similares. Los valores de los rendimientos respecto a las alturas se
muestran en el anexo 7-1.
En el posterior estudio de optimizacin del tiempo de extraccin se utilizar
DM como disolvente de extraccin.
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO (ELLc)
__________________________________________________________________
117
Anexo 7-1. Rendimientos para ELLc respecto a las alturas.
DM DM/HX
Acetato de 3-metil-1-butilo 95.62.9 45.32.3
3-Metil-1-butanol 60.12.1 50.13.4
Hexanoato de etilo 86.72.5 80.52.7
1-Hexanol 82.012.1 61.311.4
Octanoato de etilo 104.46.8 66.55.1
Succinato de dietilo 90.85.6 91.67.2
Acetato de 2-feniletilo 70.03.6 86.57.2
cido hexanoico 46.73.6 96.516.5
2-Feniletanol 80.55. 7 21.61.9
cido octanoico 81.43.9 20.51.6
cido decanoico 82.12.6 81.23.9
7.4.2.- Tiempo de extraccin
Para ver la influencia del tiempo de extraccin en los rendimientos, se fueron
tomando alcuotas a intervalos de tiempo de una hora durante 12 horas. El volumen
de extracto sacado se repon cada vez, con la finalidad de referir siempre los
clculos al mismo volumen inicial. Los extractos, una vez aadido el patrn
interno, se analizaron por CG. A partir de los resultados obtenidos (tabla 7-2) se
observ que con dos horas de extraccin era suficiente, ya que pasado este tiempo
se obtenan rendimientos de extraccin prcticamente iguales o menores.
Compuestos
1 hora 2 horas 3 horas 4 horas
A3M1B 89.42.9 98.72.5 98.93.0 87.61.9
3M1B 46.42.1 59.92.8 59.43.0 58.72.3
HE 76.32.9 88.42.6 88.62.1 76.81.2
1H 62.711.9 85.910.2 85.99.7 65.89.3
OE 89.54.7 1065.4 1065 84.85.4
SD 71.03.2 91.14.1 91.84.4 79.41.8
AFE 63.25.1 70.54.0 71.23.7 67.54.4
AH 38.23.0 48.34.1 48.73.6 37.52.6
2FE 68.35.7 80.14.4 80.85.7 71.43.3
AO 74.52.9 80.92.9 81.32.4 77.21.6
AD 69.61.4 82.71.7 82.81.3 72.40.5
- Tabla 7-2: Rendimientos de extraccin (%) a diferentes tiempos en ELLc
T CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
118
En la figura 7-3 se representan las 7 primeras tomas de muestras, una por
hora, observndose la clara disminucin en los rendimientos a partir de las tres
horas.
Tiempo
7h 6h 5h 4h 3h 2h 1h
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
120
100
80
60
40
20
0
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
- Figura 7-3: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
a diferentes tiempos en ELLc
Si comparamos los rendimientos obtenidos con la ELLc a las dos horas
(tabla 7-2) con los obtenidos utilizando ELLd con DM (tabla 6-5) se observa que:
para el acetato de 3-metil-1-butilo, hexanoato de etilo, 1-hexanol, octanoato de
etilo, succinato de dietilo y el cido octanoico los valores son ms altos (entre 81 y
106%) en el caso de la extraccin en continuo. Sin embargo para el 3-metil-1-
butanol, cido hexanoico y 2-feniletanol los rendimientos se ven favorecidos en el
caso de la extraccin en discontinuo, con valores entre 72 y 86%, siendo el valor de
los rendimientos muy similar en el caso del acetato de 2-feniletilo y el cido
decanoico por ambos mtodos (72 y 83% respectivamente en discontinuo y 71 y
83% en el continuo).
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO (ELLc)
__________________________________________________________________
119
7.4.3.- Condiciones ptimas
Una vez optimizadas las variables seleccionadas en el estudio, en la tabla 7-3
se muestran las condiciones ptimas tanto cromatogrficas como del
procedimiento, y en la tabla 7-4 los rendimientos obtenidos en estas condiciones.
VARIABLES
CONDICIONES
Disolvente
Volumen muestra
Volumen de disolvente
Tiempo de extraccin
Temperatura detector
Columna
Temperatura inyector
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
Programa de temperatura
Diclorometano
250 mL
100 mL
2 horas
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (0.9 mL min
-1
)
Helio (30 mL min
-1
)
400 mL min
-1
30 mL min
-1
0.2:1
2.0 L
4 C min
-1
60 C 170 C
4 min 12 min
- Tabla 7-3:Condiciones ptimas en ELLc
A3M1B 3M1B HE 1H OE SD AFE AH 2FE AO AD
98.7 59.9 88.4 85.9 106 91.1 70.5 48.3 80.1 80.9 82.7
- Tabla 7-4: Rendimientos en las condiciones ptimas (ELLc)
T CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
120
7.5.- Caractersticas analticas
Tambin con este procedimiento de extraccin se obtuvieron las
caractersticas analticas. Para ello se prepararon disoluciones en DM de los
compuestos a estudiar y se analizaron en las condiciones cromatogrficas que se
indican en la tabla 7-3. Teniendo en cuenta el rendimiento de cada uno de los
compuestos de la tabla 7-4, se calcularon: la pendiente, el lmite de deteccin y el
lmite de cuantificacin, como se indica en el apartado 4-5. Tambin se muestra la
ordenada en el origen, y la desviacin estandar relativa porcentual en la tabla 7-5.
COMPUESTOS
Pendiente
(mL g
-1
)
1
o.o.
(intervalo de confianza
de 95%)
2
L.D.
(g mL
-1
)
3
L.C.
(g mL
-1
)
4
s
r
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.01630.0003
0.01850.0005
0.01050.0002
0.02260.0003
0.02570.0002
0.05090.0003
0.2060.007
0.006220.00064
0.009700.00016
0.01760.0003
0.02000.0002
-3.91E
-2
2.9E
-3
-3.02E
-2
1.3E
-3
-3.54E
-2
2.2E
-3
-1.23E
-3
1.9E
-4
-1.36E
-3
1.9E
-4
-4.21E
-3
1.0E
-4
-2.34E
-2
4.9E
-3
-6.52E
-2
2.7E
-3
-6.73E
-2
0.3E
-3
-6.42E
-2
2.1E
-3
-6.95E
-2
2.0E
-3
0.0306
0.0275
0.0476
0.0236
0.0198
0.0105
0.0244
0.0601
0.0538
0.0298
0.0255
0.103
0.0915
0.157
0.0785
0.0661
0.0349
0.0812
0.201
0.179
0.0996
0.0847
5.6
5.4
4.6
2.8
3.2
3.6
5.6
4.5
2.2
3.1
1.6
- Tabla 7-5: Caractersticas analticas en ELLc
1
o.o.= Ordenada en el origen,
2
L.D.= Lmite de deteccin,
3
L.C.= Lmite de cuantificacin,
4
s
r
(%) = Desviacin estndar relativa porcentual
7.6.- Cuantificacin en muestras de vino real
Una vez optimizado el procedimiento de extraccin, igual que se hizo en la
ELLd, se aplic a muestras de vino reales, utilizando como mtodo de
cuantificacin el patrn interno y las rectas de calibrado.
Para llevar a cabo el estudio se utilizaron cuatro vinos blancos jvenes de la
DOCa Rioja, los cuales se sometieron al proceso de extraccin tal y como se ha
indicado en el apartado 7-3 y con las condiciones ptimas expuestas en la tabla 7-3.
A los extractos se les aadi el patrn interno y se analizaron mediante CG por
triplicado. La cuantificacin se llev a cabo tanto por rectas de calibrado como por
patrn interno. A las concentraciones obtenidas se les aplicaron los rendimientos de
extraccin indicados en la tabla 7-4.
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO (ELLc)
__________________________________________________________________
121
7.6.1.- Rectas de calibrado
Se realizaron las cuantificaciones como se expuso en el apartado 4-7. Los
resultados en g mL
-1
obtenidos para cada compuesto se indican en la tabla 7-6.
Compuestos CONCENTRACION
muestra 1
(g mL
-1
)
muestra 2
muestra 3 muestra 4
A3M1B 1.060.02 0.9710.01 0.9810.03 1.010.01
3M1B 96.31.2 94.80.4 93.30.4 95.52.4
HE 0.4840.017 0.4770.009 0.4480.041 0.500.01
1H 10.11.0 9.100.2 9.351.70 10.11.3
OE 0.5030.112 0.3220.124 0.7910.108 0.4710.116
SD 1.010.04 1.110.09 0.9320.04 1.060.05
AFE nd nd nd nd
AH 1.750.14 1.450.12 1.490.20 1.390.12
2FE 5.050.04 5.460.13 5.210.18 5.210.01
AO 2.120.21 2.220.20 2.140.15 2.010.10
AD 0.3960.053 0.3930.078 0.4010.045 0.4250.056
- Tabla 7-6: Cuantificacin en vino real mediante ELLc. Rectas de calibrado
(nd: no detectado)
7.6.2.- Patrn interno
Los resultados obtenidos se indican en la tabla 7-7.
Compuestos CONCENTRACION
muestra 1
(g mL
-1
)
muestra 2
muestra 3 muestra 4
A3M1B 1.270.01 1.090.02 0.9800.03 1.020.02
3M1B 98.51.4 96.50.6 96.40.6 97.52.5
HE 0.5320.027 0.4890.019 0.4680.031 0.510.02
1H 10.41.5 10.10.4 9.781.80 10.21.4
OE 0.4930.122 0.3620.104 0.5210.128 0.4810.119
SD 1.090.08 1.030.10 0.9610.06 1.070.07
AFE nd nd nd nd
AH 1.870.26 1.650.24 1.560.26 1.470.22
2FE 5.690.08 5.520.16 5.230.19 5.320.04
AO 2.400.23 2.300.23 2.150.18 2.120.18
AD 0.4200.083 0.4530.089 0.3980.065 0.4450.086
- Tabla 7-7: Cuantificacin en vino real mediante ELLc. Patrn interno
(nd= no detectado)
T CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
122
Todos los valores obtenidos entran dentro de los mrgenes habituales para este
tipo de vinos. El acetato de 3-metil-1-butanol es con diferencia el compuesto que
aparece a concentracin ms alta en los cuatro vinos (98.5, 96.5, 96.4, 97.5
respectivamente). Sin embargo, el acetato de 2-feniletilo no se detect en ninguna
de las muestras analizadas, igual que ocurri en la ELLd.
Si comparamos los resultados obtenidos por ambos mtodos, observamos
que los valores obtenidos son similares. Para conocer si la diferencia entre los
resultados obtenidos para cada compuesto por ambos mtodos de cuantificacin era
significativa o no, se realiz un estudio estadstico de comparacin de medias para
cada compuesto (tal y como se expuso en el apartado 4.6.3). Calculamos la s
(significacin), considerando un nivel de significacin del 95%, se compara el
valor de s obtenido con el 0.05 para ver si es mayor o no. Si s es mayor que
0.05 no existe diferencia significativa entre los valores obtenidos por ambos
mtodos de cuantificacin. Los resultados se indican en la tabla 7-8.
COMPUESTOS
s SIGNIFICACIN
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.073
0.389
0.070
0.161
0.107
0.150
*
0.240
0.253
0.144
0.269
NS
NS
NS
NS
NS
NS
*
NS
NS
NS
NS
- Tabla 7-8: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (ELLc)
(NS: no significativa, *: no hay datos)
Como podemos observar, no existe diferencia significativa entre los
resultados obtenidos por ambos mtodos de cuantificacin para ninguno de los
compuestos estudiados.
Finalmente, en la figura 7-4 se muestra un cromatograma obtenido para una
muestra de vino sinttico con la ELLc utilizando las condiciones optimizadas de la
tabla 7-3.
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO (ELLc)
__________________________________________________________________
123
- Figura 7-4: Cromatograma. Vino sinttico, ELLc
5 10 15 20 25 30 35 40
Minutos
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
mVolts
A3M1B
(5.779)
3M1B (7.801)
HE (8.627)
1H (12.136)
3O (13.411)
OE (14.689)
SD (21.778)
AFE (25.462)
AH (26.407)
2FE (27.914)
AO (31.642)
AD (38.781)
CAPTULO 8
Extraccin lquido-lquido con
ultrasonidos (ELLus)
- Introduccin
- Procedimiento operativo
- Optimizacin de variables
- Disolvente
- Sales
- Otras variables
- Condiciones ptimas
- Caractersticas analticas
- Cuantificacin en muestras de vino real
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON ULTRASONIDOS (ELLus) 127
__________________________________________________________________
8.- EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON
ULTRASONIDOS (ELLus)
8.1.- Introduccin
El espectro acstico o snico es muy amplio y dentro de l, se puede hacer
una clasificacin de distintos tipos de ondas en funcin de su frecuencia. As se
denominan subsnicas aquellas ondas cuya frecuencia est por debajo de los 20
Hz, snicas son las que presentan frecuencias comprendidas entre 20 Hz y 16 kHz,
y que representan aproximadamente los lmites de audicin, y por ltimo, ondas
ultrasnicas son las que tienen frecuencias superiores a los 16 kHz, y son las que
vamos a tratar en este apartado.
Es a partir de la segunda mitad del siglo XIX cuando comienzan a utilizarse
los ultrasonidos (us) y a conocerse sus aplicaciones.
Las ondas snicas son oscilaciones mecnicas en el tiempo y en el espacio
que tienen lugar en el seno del material en el que se propagan. A diferencia de las
ondas electromagnticas, los sonidos slo pueden propagarse en medios materiales.
Dichos medios influyen en la velocidad de propagacin y en la atenuacin
99
. Los
ultrasonidos causan diferentes cambios en el medio que atraviesan que se explican
mediante distintos mecanismos como son: calentamiento, cavitacin, efectos
estructurales, compresiones y descompresiones, turbulencias y otros.
Las aplicaciones de los ultrasonidos tienen efecto en un amplio nmero de
campos. De hecho, ha nacido una nueva rama de la qumica que intenta descubrir
las ventajas de los efectos de los ultrasonidos que se llama sonoqumica. Los
efectos mecnicos y fsicos de los ultrasonidos se utilizan para mejorar la limpieza
de superficies, mejorar los procesos de deshidratacin, secado y filtracin, inactivar
microorganismos y enzimas, romper clulas, desgasificar lquidos, mejorar los
procesos de transferencia de calor, acelerar los procesos de extraccin, ayudar en
procesos en los que la difusin de sustancias est presente, etc.
Existen tambin numerosos estudios referentes a la utilizacin de
ultrasonidos en el vino, tanto como mtodo de extraccin lquido-lquido asistida
99
Benson, C., Ultrasnica, (1972)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
128
por ultrasonidos
100
, como en otros campos como son distintas tcnicas de
aceleracin de la maduracin o envejecimiento de diferentes vinos
101
.
8.2.- Procedimiento operativo
El procedimiento de extraccin consisti en:
Poner en un vaso de precipitados de 100 mL, 25.0 mL de disolucin matriz (vino
sinttico con los compuestos a estudiar o muestras de vino real). Aadir 10.0 mL
de disolvente (diclorometano) y 4 g de NaCl. Cerrar el vaso con parafilm dejando
una pequea salida de aire mediante una aguja pinchada sobre ste, y sonicar
durante 15 minutos (procurando mantener el agua del bao a temperatura
ambiente mediante renovacin peridica de la misma). Posteriormente dejar en
reposo unos minutos para separar adecuadamente las fases. Tomar 5.0 mL del
extracto orgnico, aadir el p.i. e inyectar en el cromatgrafo de gases.
Todas las extracciones se realizaron por triplicado y cada extracto se inyect
por triplicado en el cromatgrafo, tomando como resultado de cada experimento
los valores medios de las nueve inyecciones realizadas. Como parmetro de
cuantificacin se emple la relacin de reas.
Las condiciones cromatogrficas utilizadas son las que se muestran en el
captulo 4, apartado 4.4.5.
8.3.- Optimizacin de variables
Cuando se estudia un procedimiento de extraccin, existen una serie de
variables que deben optimizarse. En esta tcnica se optimizaron las variables que
se consideraron ms relevantes. No se incluye la temperatura del bao de
100
Cocito C. et al, Food Chem., 2, 311-320, (1995)
Bru E.R. et al, Jornadas de vitivinicultura y enologa de Tierra de Barros 19 ed.,
Almendralejo, (1997)
Hernanz D. et al, Talanta, 50, 413-421, (1999)
101
Chingzu Chang A., Food Chem., 86, 61-68, (2004)
Chingzu Chang A. et al, Food Chem., 79, 501-506, (2002)
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON ULTRASONIDOS (ELLus) 129
__________________________________________________________________
ultrasonidos ya que segn la bibliografa
102
el cambio de esta variable no mejoraba
apreciablemente los rendimientos y adems complicaba la metodologa de trabajo.
As las variables de trabajo a optimizar fueron:
- Tipo de disolvente
- Adicin o no de sales (tipo y concentracin)
- Volumen de muestra
- Volumen de disolvente
- Tiempo de extraccin o sonicacin
Para optimizar el mtodo, las disoluciones con las que trabajamos fueron de
vino sinttico, con los compuestos seleccionados, que enunciamos a continuacin:
- o-Terpineol (T)
- 1-Hexanol (1H)
- 1-Pentanol (1P)
- 2-Feniletanol (2FE)
- 3-Metil-1-butanol (3M1B)
- Acetato de 2-feniletilo (AFE)
- Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B)
- cido decanoico (AD)
- cido hexanoico (AH)
- cido octanoico (AO)
- Hexanoato de etilo (HE)
- Linalol (L)
- Octanoato de etilo (OE)
- Succinato de dietilo (SD)
8.3.1.- Disolvente
Inicialmente, se optimiz el disolvente a utilizar en la extraccin, para ello se
fijaron los valores del resto de variables (volumen de muestra = 25.0 mL, volumen
de disolvente = 10.0 mL, tiempo de extraccin = 20 minutos y sin sal).
102
Br E.R. et al, Jornadas de vitivinicultura y enologa de Tierra de Barros 19 ed.,
Almendralejo, (1997)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
130
Los disolventes que se ensayaron fueron:
- Hexano (HX)
- Metilisobutilcetona (MIBC)
- ter de petrleo (EP)
- Pentano (P)
- Diclorometano (DM)
- ter etlico (EE)
Una vez llevado a cabo el proceso de extraccin y acondicionado el extracto,
se inyect en el cromatgrafo de gases. A partir de los resultados experimentales
obtenidos y siguiendo la metodologa de clculo expuesta en el apartado 4.7 de este
trabajo, se calcularon los rendimientos de extraccin y los valores obtenidos (%) se
indican en la tabla 8-1.
COMPUESTOS
HX MIBC EP P DM EE
A3M1B
3M1B
HE
31.20.5
nd
nd
40.44.0
20.13.1
13.11.3
31.10.1
23.10.4
11.10.6
30.11.5
21.19.0
15.31.7
26.20.3
41.91.2
9.200.91
31.11.0
29.11.1
nd
1P
1H
OE
nd
nd
nd
31.23.1
16.22.9
nd
23.10.3
25.10.1
14.20.3
21.11.3
12.11.9
nd
31.40.1
27.10.6
30.20.6
20.11.1
15.00.9
nd
L
SD
T
nd
6.130.11
21.10.2
nd
12.01.1
41.12.1
20.10.2
8.120.11
27.10.1
nd
12.11.1
31.21.5
32.40.2
17.10.3
70.00.1
nd
11.01.4
50.11.0
AFE
AH
2FE
24.10.1
7.100.13
16.10.4
18.01.6
19.21.0
nd
13.10.5
26.10.1
22.11.2
15.16.1
52.11.6
15.01.6
29.70.5
38.50.1
22.30.9
25.06.0
23.41.4
25.11.8
AO
AD
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
6.120.9
11.40.1
nd
nd
- Tabla 8-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en ELLus
(nd= no detectado)
La representacin grfica de estos resultados se muestra en la figura 8-1, en
la que cada una de las barras corresponde a uno de los compuestos, en orden de
salida en el cromatograma.
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON ULTRASONIDOS (ELLus) 131
__________________________________________________________________
Disolvente
EE DM P EP MIBC HX
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
80
60
40
20
0
A3M1B
M1B
HE
P
H
OE
L
SD
T
AFE
AH
FE
AO
AD
- Figura 8-1: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
con distintos disolventes en ELLus
Como podemos observar, con hexano se extraen pocos compuestos.
Utilizando metilisobutilcetona, pentano o ter etlico no se extraen en ningn caso
octanoato de etilo, linalol, cido octanoico ni cido decanoico, siendo el
diclorometano con el que se obtienen ms compuestos y con mejores rendimientos
de extraccin. Por ello, es ste el disolvente que se utilizar a lo largo del resto del
estudio.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
132
8.3.2.- Sales
Es importante que la separacin completa de las fases sea en el menor
tiempo posible, para ello hay que evitar la formacin de emulsiones estables,
utilizando por ejemplo un agente salino
103
.
Para comprobar la influencia de sales sobre los rendimientos de extraccin,
inicialmente y a partir de las referencias bibliogrficas se realizaron una serie de
ensayos previos.
Partiendo de muestras de 25.0 mL de vino sinttico, que contenan todos los
compuestos en estudio, se realiz la extraccin con 10.0 mL de diclorometano. Se
hicieron diferentes ensayos variando la cantidad de sal, en este caso NaCl entre 1 y
5 g. Se sigui el procedimiento de extraccin indicado anteriormente y los
extractos, una vez acondicionados, se analizaron por CG.
A partir de los resultados obtenidos se observ que los mejores resultados se
obtenan utilizando 4 g de NaCl. Los rendimientos estuvieron entre el 9% (para el
cido octanoico) y el 81% (para el o-terpineol), sin embargo para cantidades ms
pequeas de sal no suban del 55% para ninguno de los compuestos, y para 5 g de
NaCl los rendimientos no mejoraban, con el problema aadido de disolver esa
cantidad de sal. Una vez que comprobamos que con 4 g de cloruro sdico se
obtenan los mejores rendimientos de extraccin, repetimos los ensayos utilizando
distintas sales en diferentes proporciones.
Las sales a estudiar para completar el estudio fueron:
- Sulfato amnico anhidro (SA)
- Fosfato sdico dihidratado (FS)
Tambin se estudi la mezcla SA/FS ya que segn nuestra experiencia
104
, la
combinacin de estas sales poda favorecer la extraccin. A partir de los
cromatogramas obtenidos se calcularon los rendimientos de extraccin que se
indican en la tabla 8-2.
103
Bru E.R. et al, Jornadas de vitivinicultura y enologa de Tierra de Barros 19 ed.,
Almendralejo, (1997)
104
Senz C. et al, Chromatographia, 51, 221-225, (2000)
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON ULTRASONIDOS (ELLus) 133
__________________________________________________________________
COMPUESTOS NaCl (4 g)
SA (4 g) SA/FS (2 g/2 g) Sin sal
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
38.40.3
55.20.1
20.20.1
42.50.1
38.70.1
41.40.1
43.20.1
28.10.5
81.20.5
39.91.1
49.81.6
32.50.2
9.160.21
23.50.1
12.10.6
23.60.9
2.310.11
25.40.1
23.40.8
22.30.0
23.70.6
13.50.1
54.20.5
24.50.1
25.20.3
18.30.2
2.410.02
4.220.11
13.20.1
22.20.1
3.140.10
25.60.1
24.50.2
22.10.1
26.20.2
14.50.1
57.00.1
24.80.6
26.40.1
14.70.2
3.110.12
6.310.19
26.21.3
41.91.2
9.200.91
31.40.1
27.10.6
30.20.6
32.40.2
17.11.3
70.06.1
29.71.5
38.58.1
22.31.9
6.120.91
11.40.1
- Tabla 8-2: Rendimientos de extraccin (%) con distintas sales en ELLus
La representacin grfica de estos resultados se muestra en la figura 8-2.
Sal
sin sal SA/FS SA NaCl
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
100
80
60
40
20
0
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
- Figura 8-2: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin
(%) con distintas sales en ELLus
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
134
En todos los casos se extraen todos los compuestos, y a partir de los
resultados vemos que con cloruro sdico se obtienen los mayores rendimientos de
extraccin. Por otro lado, los rendimientos en la disolucin que no llevaba sal son
mayores que cuando se utiliza sulfato amnico o la mezcla. Por todo esto, para el
resto de los estudios consideramos la sal ptima el cloruro sdico (4 g).
8.3.3.- Otras variables
Una vez optimizado el disolvente y el tipo y cantidad de sales, para
optimizar las otras variables (volumen de muestra, volumen de disolvente y tiempo
de extraccin), se realiz un diseo factorial considerando para cada variable o
factor dos niveles (tabla 8-3), siendo stas las variables independientes y la relacin
entre las reas de compuesto y p.i. la variable dependiente.
x
i
: VARIABLES Nivel + Nivel -
x
1 :
Volumen de muestra (mL)
x
2 :
Volumen de disolvente (mL)
x
3 :
Tiempo de extraccin (min)
50.0 25.0
10.0 5.0
30 15
- Tabla 8-3: Variables y niveles considerados para el diseo factorial
Este diseo fue un 2
3
con dos puntos centrales, todos los experimentos se
realizaron por duplicado y fueron aleatorizados para evitar errores de sistema,
obteniendo as 20 experimentos a realizar.
La ecuacin del modelo es:
y = |
0
+ |
1
x
1
+ |
2
x
2
+ |
3
x
3
+ |
12
x
1
x
2
+ |
23
x
2
x
3
El programa estadstico utilizado para realizar el diseo fue Statgraphics, en
la tabla 8-4 se muestra la matriz de experimentos.
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON ULTRASONIDOS (ELLus) 135
__________________________________________________________________
EXPERIMENTOS VARIABLES CODIFICADAS
x
1
x
2
x
3
VARIABLES SIN CODIFICAR
x
1
x
2
x
3
1 -12
2 -18
3 -19
4 -13
5 -16
6 -20
7 -14
8 -15
9 -11
10 -17
0
+
-
+
-
-
+
-
+
0
0
-
+
+
-
+
-
-
+
0
0
-
+
-
-
-
+
+
+
0
37.5
50
25
50
25
25
50
25
50
37.5
7.5
5
10
10
5
10
5
5
10
7.5
22.5
15
30
15
15
15
30
30
30
22.5
- Tabla 8-4: Matriz experimental del 2
3
+2
Donde: x
1=
Volumen de muestra (mL), x
2=
Volumen de disolvente (mL), x
3=
Tiempo de
extraccin (min)
El estudio del tiempo de extraccin se decidi no alargarlo ms all de los 30
minutos, para evitar problemas de degradacin de los compuestos ms lbiles. Una
vez procesados los datos obtenidos de los experimentos realizados, los valores de
los coeficientes obtenidos se muestran en la tabla 8-5.
|
0
|
1
|
2
|
3
|
12
|
23
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
-15766.0
-15480.7
-19997.3
-14963.7
-19076
-16673
-23510
17003
28281
-1194.83
-456.68
13618.5
-730.05
2946.75
322.15
395.92
324.72
425.08
485.76
116.78
631.15
-81.45
-66.96
159.93
255.96
-282.05
12.94
-51.04
3139.65
3219.1
4016.8
5608.4
4287.07
4107.2
4646.23
-419.43
-867.6
2564.72
2002.2
2455.02
371.08
215.4
285.15
145.26
359.53
-123.26
149.79
376.03
264.61
-433.84
-944.87
-172.06
-250.83
-540.03
-3.78
68.63
-48.93
-63.46
-61.37
-106.09
-80.19
-49.06
-99.57
-11.47
-27.09
-46.16
-44.60
-31.79
-4.97
-5.97
-72.98
-43.04
-94.89
-81.21
-62.95
-112.66
-38.90
20.83
88.33
-45.27
-13.53
-34.25
-9.82
6.21
- Tabla 8-5: Valor de los coeficientes de ajuste en el diseo 2
3
+ 2
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
136
Se hace un estudio del anlisis de la varianza (ANOVA) para ver la
significacin de los efectos o coeficientes de ajuste.
La influencia de un factor viene indicada por la magnitud "F". Las variables
con el valor de "F" por encima de 5.318 tienen influencia significativa a un nivel de
significacin del 5% (o bien por la magnitud "s", donde los efectos con valores de
"s" menores de 0.05 tienen una significacin a un nivel de confianza del 95%).
La tabla 8-6 muestra estas significaciones y las direcciones de los
parmetros.
V muestra
(x
1
)
V dte
(x
2
)
Tiempo
extraccin
(x
3
)
Interaccin
(x
1
x
2
)
Interaccin
(x
2
x
3
)
Interaccin
(x
1
x
3
)
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
NS
NS
S(+)
S(-)
NS
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(+)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(+)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
NS
S(-)
S(-)
NS
NS
S(+)
S(+)
S(-)
S(-)
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
S(+)
NS
NS
- Tabla 8-6: Resultados de significacin y direccin de los parmetros obtenidos en el
diseo factorial. S= significativo, NS= no significativo
Se observa que para todos los compuestos las variables significativas son el
volumen de disolvente, el tiempo de extraccin y la interaccin entre el volumen de
muestra y el volumen de disolvente, el volumen de muestra y la interaccin entre el
volumen de disolvente y el tiempo de extraccin fue significativa en la mayora de
los casos, resultando no significativa (a excepcin del 2FE) la interaccin entre el
volumen de muestra y el tiempo de extraccin.
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON ULTRASONIDOS (ELLus) 137
__________________________________________________________________
La direccin de la significacin viene marcada por el signo del efecto
(positivo para el nivel ms alto y negativo para el nivel ms bajo), como puede
verse tambin en la tabla 8-6, la significacin en el volumen de muestra est
afectada por un signo negativo en todas las variables significativas excepto para el
hexanoato de etilo, el volumen de disolvente significativo en todos los casos tiene
signo positivo, el tiempo de extraccin es negativo excepto para el linalol y el
cido decanoico, y el signo de las interacciones que son significativas tienen signo
negativo para la interaccin x
1
x
2
y mayoritariamente negativo para la interaccin
x
2
x
3.
Tambin en este estudio se observ que no haba diferencia significativa
entre los distintos grupos en las rplicas.
8.3.4.- Condiciones ptimas
Una vez optimizadas todas las variables, las condiciones ptimas de trabajo
se muestran en la tabla 8-7.
PARMETROS CONDICIONES
Disolvente
Sal
Volumen de muestra
Volumen de disolvente
Tiempo de extraccin
Temperatura detector
Columna
Temperatura inyector
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
Programa de temperatura
Diclorometano
NaCl 4 g
25.0 mL
10.0 mL
15 min
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (0.9 mL min
-1
)
Helio (30 mL min
-1
)
400 mL min
-1
30 mL min
-1
0.2:1
2.0 L
4 C min
-1
60 C 170 C
4 min 12 min
- Tabla 8-7: Condiciones ptimas en ELLus
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
138
Los valores de los rendimientos obtenidos en estas condiciones se muestran
en la tabla 8-8.
A3M1B 3M1B HE 1P 1H OE L SD T AFE AH 2FE AO AD
38.4 55.2 20.2 42.5 38.7 41.4 43.2 28.1 81.2 39.9 49.8 32.5 9.16 23.5
- Tabla 8-8: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (ELLus)
8.4.- Caractersticas analticas
Se procedi a calcular las caractersticas analticas con esta metodologa de
trabajo para cada uno de los compuestos utilizados. Para ello se prepararon
diferentes disoluciones en DM con los compuestos a estudiar ms el p.i. y se
inyectaron en el cromatgrafo en las condiciones cromatogrficas optimizadas. A
los valores obtenidos en el extracto orgnico se les aplic los rendimientos tal y
como se expuso en el apartado 4.5. Los datos se muestran en la tabla 8-9.
Para el estudio de la reproducibilidad o precisin del mtodo expresado
como s
r
(%) (desviacin estndar relativa porcentual) se realizaron tres
extracciones de una disolucin en las condiciones optimizadas y se inyectaron por
triplicado.
COMPUESTOS
Pendiente
(mL g
-1
)
1
o.o.
(intervalo de
confianza de 95%)
2
L.D.
(g mL
-1
)
3
L.C.
(g mL
-1
)
4
s
r
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.006510.00012
0.01710.0004
0.002420.00004
0.007820.00017
0.01020.0001
0.01000.0001
0.01680.0003
0.01570.0001
0.01950.0031
0.1170.001
0.006470.00009
0.003900.00006
0.001940.00004
0.005670.00007
-0.2080.013
-0.2260.014
-0.06810.51E
-2
-0.08720.0031
-0.3720.094
-0.1770.010
-0.2450.033
4.02E
-3
1.49E
-4
0.03100.41E
-2
0.7310.024
0.9950.078
1.090.02
0.4410.052
0.1960.054
0.0781
0.0295
0.207
0.0238
0.0517
0.0508
0.0255
0.0343
0.0246
0.0431
0.0581
0.130
0.261
0.0897
0.261
0.0980
0.691
0.0791
0.173
0.168
0.0847
0.110
0.0820
0.141
0.190
0.431
0.867
0.297
5.4
5.7
4.5
2.8
4.2
2.1
2.6
6.2
2.9
5.3
3.6
5.1
4.1
3.4
- Tabla 8-9: Caractersticas analticas ELL-us
1
o.o.= Ordenada en el origen,
2
L.D.= Lmite de deteccin
3
L.C.= Lmite de cuantificacin,
4
s
r
(%) = Desviacin estndar relativa porcentual
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON ULTRASONIDOS (ELLus) 139
__________________________________________________________________
8.5.- Cuantificacin en muestras de vino real
Optimizado el mtodo de extraccin y calculadas las caractersticas
analticas, pasamos a cuantificar muestras de vino real. Para este procedimiento
nicamente se utilizaron las rectas de calibrado como mtodo de cuantificacin. El
mtodo se aplic a muestras de cuatro vinos tintos jvenes de la DOCa Rioja.
Una vez sometidas las muestras al proceso de extraccin y separadas las
fases a los extractos se les aadi el p.i. y se analizaron por triplicado en el
cromatgrafo. Los resultados obtenidos se indican en la tabla 8-10.
COMPUESTOS
CONCENTRACIONES (g/mL)
muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
3.68 1.10
168 26
0.821 0.010
0.422 0.001
12.0 1.1
3.71 0.02
nd
1.610.21
nd
5.10 1.31
1.22 0.60
9.420.22
1.41 0.12
0.601 0.010
3.08 1.00
152 22
0.754 0.001
0.502 0.011
11.2 1.1
2.81 0.12
nd
1.520.12
nd
5.01 1.11
1.71 0.12
8.910.23
1.14 0.12
0.611 0.010
3.52 1.14
176 18
1.181 0.101
0.431 0.012
11.9 1.1
3.34 0.01
nd
1.660.11
nd
4.91 1.21
1.32 0.11
9.120.01
1.21 0.13
0.632 0.022
4.01 1.11
143 23
0.9810.121
0.512 0.022
10.2 1.0
2.91 0.11
nd
1.45 0.21
nd
4.63 1.02
1.53 0.10
9.320.12
1.02 0.33
0.622 0.022
- Tabla 8-10: Cuantificacin en vino real mediante ELLus. Rectas de calibrado
(nd: no detectado)
Finalmente, en la figura 8-3 se muestra un cromatograma obtenido a partir
de una disolucin de vino sinttico sometida al proceso de extraccin lquido-
lquido con ultrasonidos.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
140
5 10 15 20 25 30 35
Minutes
-0
0
1
2
3
4
5
6
mVolts
A3M1B (5.648)
3M1B (7.738)
EH (8.494)
1P(8.965)
1H (12.084)
3O (13.347)
EO (14.578)
L (18.027)
SD (21.719)
T (22.215)
FEA (25.407)
AH (26.331)
FE (27.911)
AO (31.583)
AD (38.673)
- Figura 8-3: Cromatograma. Vino sinttico, ELLus
CAPTULO 9
Microextraccin por desmezcla
I: Detector FID
- Introduccin
- Procedimiento operativo
- Optimizacin de variables
- Tipo y volumen de disolvente
- Tipo y cantidad de sal
- Tiempo de agitacin
- Condiciones ptimas
- Caractersticas analticas
- Cuantificacin en vino
- Rectas de calibrado
- Patrn interno
- Efecto de la matriz en los rendimientos de
extraccin
- Aplicacin a otros compuestos
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
143
9.- MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA
I: DETECTOR FID
9.1.- Introduccin
La aplicacin de la microextraccin por desmezcla es un procedimiento que
se desarroll con posterioridad a la ELL en el estudio de voltiles en matrices
lquidas y homogneas como pueden ser el mosto y el vino.
La microextraccin por desmezcla se basa en utilizar un disolvente orgnico
muy inmiscible en agua y adicionar sobre la fase acuosa una elevada concentracin
de sales, disminuyendo as la capacidad solvatante del agua, favoreciendo la
desmezcla de las dos fases, as como la solubilidad en la fase orgnica de los
compuestos a extraer.
La adicin de sales es un fenmeno fsico-qumico bien conocido desde hace
tiempo. Se fundamenta en el tipo de interacciones que existen en una disolucin
acuosa que contiene una cierta cantidad de un soluto orgnico. La solubilidad de un
soluto orgnico en un medio acuoso es funcin de la capacidad de sus molculas de
unirse a la estructura de puentes de hidrgeno del agua. Por supuesto, estas
molculas orgnicas no tendrn la misma capacidad que las del agua para formar
parte de la red, pero s se adherirn lo suficiente como para solubilizarse.
La introduccin de una especie inica fuertemente disociada en el medio
acuoso, requiere que las molculas del agua se orienten en torno a los iones de la
disolucin. En esta situacin, la estructura de la red de puentes de hidrgeno de la
disolucin acuosa se ve alterada, y este hecho provoca que las molculas orgnicas,
presentes en esa disolucin, integradas en la estructura de los puentes de hidrgeno,
encuentren ahora, una mayor dificultad para participar de la red, de forma que su
solubilidad disminuye.
Esta prdida de solubilidad puede originar la separacin de la disolucin
original en dos fases, una principalmente acuosa que contiene casi toda la sal
disuelta y otra principalmente orgnica, aunque conteniendo una pequea
proporcin de sal y agua, hasta llegar a un punto de saturacin en el que el sistema
no admite ms sal.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
144
El equilibrio depende sobre todo de la temperatura, de las sales y del
disolvente orgnico. Tambin es importante valorar en la eleccin de la sal la
tendencia que tenga a formar o no emulsiones y el pH que origina.
En un comienzo, este tipo de extraccin se utiliz tan solo en muestras cuya
composicin en voltiles no era muy elevada. Sin embargo, actualmente se aplica a
diversas matrices agroalimentarias, utilizando un tratamiento previo de la muestra,
de forma que est lo ms homognea y limpia posible.
Ya en 1959 Fouassin
105
emple la microextraccin para determinar alcoholes
superiores en aguardientes y licores utilizando como sal K
2
CO
3
. Ms adelante se
utiliz tambin esta tcnica para los compuestos del vino
106
, y Ribereau-Gayon y
colaboradores
107
la ha utilizado para el estudio de los terpenos en uvas. En este
captulo se muestran los resultados obtenidos empleando dicho procedimiento para
el anlisis de compuestos voltiles en vino
108
.
La microextraccin por desmezcla es otra alternativa a ELL convencional.
Con ella se consiguen altos grados de preconcentracin, y una de las caractersticas
ms importantes es que no requiere ningn material especial, emplendose como
recipientes de extraccin tubos de ensayo de fondo cnico, con el objeto de
favorecer la separacin de las fases.
9.2.- Procedimiento operativo
El procedimiento operativo utilizado en la microextraccin se indica a
continuacin:
- En un tubo de microextraccin se ponen las diferentes proporciones de sales
optimizadas (1.5 g de sulfato amnico anhidro y 0.6 g de fosfato sdico
dihidratato), que son las responsables de la desmezcla.
- Se aaden 10.0 mL de vino o vino sinttico que contiene los compuestos a
estudiar y se agita (mecnicamente), hasta completa disolucin de las sales.
105
Fouassin A. et al, Ferment. Ind. Alim., 14, 206-216, (1959)
106
Ortega C. et al, J. Chromatogr. A., 923, 205-214, (2001)
Mesas J.L. et al, Rev. Agroquim. Tecnol. Aliment, 21, 114-129, (1981)
Dubois P. et al, Ann. Technol. Agri.,18, 241-247, (1969)
Singleton V.L. et al, Am. J. Enol. Vitic, 12, 7-8, (1961)
107
Ribereau-Gayon et al, J. Agric. Food Chem., 23, 1042-1047, (1975)
108
Sanz C. et al, Chromatographia, 51, 221-225, (2000)
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
145
- Se adicionan 2.0 mL de diclorometano, como agente de extraccin.
- Se somete a agitacin mecnica durante 30 minutos.
- Se centrfuga durante 10 minutos a 3000 rpm y se recoge la fraccin de
disolvente o fase orgnica.
- El extracto recogido, una vez acondicionado, se analiza por cromatografa de
gases con detector FID.
Las condiciones cromatogrficas generales utilizadas son las que se
muestran en al captulo 4, apartado 4.4.5, exceptuando el programa de temperatura
que el utilizado en este caso fue:
6 C min
-1
10 C min
-1
90 C 170 C 220 C tiempo empleado= 43.33 min
4 min 1 min 20 min
9.3.- Optimizacin de variables
Las variables optimizadas en este procedimiento fueron:
- Tipo y volumen de disolvente
- Tipo y cantidad de sal
- Tiempo de agitacin
Y los compuestos utilizados:
- 1-Hexanol (1H)
- 3-Metil-1-butanol (3M1B)
- Acetato de 2-feniletilo (AFE)
- Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B)
- cido butanoico (AB)
- cido decanoico (AD)
- cido hexanoico (AH)
- cido octanoico (AO)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
146
- Decanoato de etilo (DE)
- Hexanoato de etilo (HE)
- Octanoato de etilo (OE)
- Succinato de dietilo (SD)
9.3.1.-Tipo y volumen de disolvente
Para optimizar el disolvente partimos de unas condiciones que consideramos
oportunas, ya que nuestro grupo de trabajo haba investigado en ello
109
, las cuales
se muestran en la tabla 9-1.
VARIABLES CONDICIONES
Volumen de disolvente
Sal (tipo y cantidad)
Tiempo de agitacin
1.0 mL
(NH
4
)
2
SO
4
/ Na
3
PO
4
.
2H
2
O (1 g/1 g)
30 minutos
- Tabla 9-1: Condiciones iniciales de trabajo
En cuanto al tipo de disolvente, segn la bibliografa consultada, la
extraccin con Freon 11 es considerada a menudo como la ms interesante, pero su
bajo punto de ebullicin plantea un gran nmero de dificultades tcnicas, que
requieren un costoso aparataje, como equipos refrigerados, cmaras
termostatizadas a bajas temperaturas, etc.
En nuestro caso los disolventes utilizados fueron:
- Kaltron (1,1,2- triclorotrifluoroetano) (K)
- Diclorometano (DM)
- Kaltron/ diclorometano (1/1) (K/DM)
- Hexano (HX)
- Isooctano (IO)
- Metilisobutilcetona (MIBC)
109
Sanz C. et al, Mikrochim. Acta, 122, 267-277, (1996)
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
147
El estudio de optimizacin se realiz con muestras de vino sinttico en las
que los compuestos a extraer estaban en un rango de concentraciones de 0.500 a
200 g mL
-1.
Siguiendo el procedimiento operativo indicado en el apartado 9-2 se
obtuvieron los cromatogramas correspondientes para cada disolvente estudiado.
Cada experimento se realiz por duplicado y el extracto, una vez acondicionado,
se inyecto tres veces en el cromatgrafo.
A partir de los resultados obtenidos se observ que los rendimientos de
extraccin con kaltron fueron los ms altos, pero no eran reproducibles, por lo que
se desech tanto ste como la mezcla kaltron/diclorometano. La causa de la baja
reproducibilidad del kaltron y de sus mezclas parece ser debida a la columna polar
que se utiliza, ya que tiene muchos grupos polares tipo cidos y aldehdos.
Con la MIBC se observ que no se extraan todos los compuestos,
obtenindose cromatogramas con menos picos y ms pequeos. Los resultados
obtenidos con los otros tres disolventes ensayados se muestran en la tabla 9-2. Los
rendimientos se calcularon tanto por rectas de calibrado como por patrn interno,
pero los resultados fueron muy similares, por lo que slo se muestran los obtenidos
con las rectas de calibrado.
COMPUESTOS Diclorometano Hexano Isooctano
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
72.02.1
39.13.2
68.43.3
51.25.0
65.24.0
12.42.2
57.13.4
55.44.3
35.31.2
39.12.2
56.02.1
42.13.1
38.22.1
22.33.1
71.42.3
40.14.2
54.23.4
10.42.3
46.23.7
36.24.1
31.11.1
41.42.1
35.42.2
23.51.1
24.13.3
19.14.4
78.13.5
31.54.3
52.52.2
12.43.4
37.14.2
23.43.2
29.12.0
40.01.0
22.13.2
12.11.1
- Tabla 9-2: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en
microextraccin por desmezcla y detector FID
Como podemos ver a partir de los resultados y en la representacin grfica
correspondiente (figura 9-1) es con el diclorometano con el disolvente que, en
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
148
general, se obtienen mayores rendimientos de extraccin, a excepcin del
hexanoato de etilo (HE) que se extrae en mayor cantidad utilizando isooctano.
IO HX DM
100
80
60
40
20
0
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
Disolvente
- Figura 9-1: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
con distintos disolventes en microextraccin por desmezcla y detector FID
Para estudiar la influencia del volumen del disolvente en los rendimientos de
extraccin se realiz este estudio utilizando diferentes volmenes de diclorometano
(2.0, 1.0 y 0.50 mL).
El procedimiento operativo utilizado fue el indicado anteriormente.
En la tabla 9-3 se muestran los resultados obtenidos y la representacin
grfica en la figura 9-2. Como puede verse, no se aprecian grandes diferencias
entre los tres volmenes ensayados, pero puesto que era ms cmodo trabajar con
los 2.0 mL de disolvente fue ste el volumen empleado en sucesivos estudios.
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
149
COMPUESTOS
Volumen DM
0.50 mL
(mL)
1.0 mL 2.0 mL
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
73.22.0
38.32.1
69.43.1
50.25.1
65.24.0
11.02.1
57.13.2
56.44.4
35.21.0
40.22.1
57.32.3
42.03.0
72.33.0
39.21.0
68.34.1
51.31.6
65.42.6
12.53.1
57.04.1
55.21.0
35.62.6
39.32.6
56.23.2
42.01.2
73.32.2
39.22.4
69.13.0
51.04.1
66.34.3
12.12.1
57.42.4
56.34.2
35.22.0
41.02.5
57.11.3
43.41.1
- Tabla 9-3: Rendimientos de extraccin (%) con distintos volmenes
de diclorometano en microextraccin por desmezcla y detector FID
2.0 1.0 0.50
80
60
40
20
0
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
Volumen de dte (mL)
- Figura 9-2: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
con distintos volmenes de diclorometano en microextraccin por desmezcla
y detector FID
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
150
9.3.2.-Tipo y cantidad de sal
Otro parmetro importante para conseguir un buen rendimiento de
extraccin es la cantidad de sales que se debe aadir. As, una vez optimizado el
volumen y tipo de disolvente pasamos a optimizar la sal en cuanto a tipo y cantidad
utilizada.
El grupo de investigacin tena experiencia con esta tcnica aplicada a la
extraccin de pesticidas en disoluciones acuosas
110
, por ello las sales con las que se
inici este estudio fueron:
- Sulfato amnico anhidro (SA).
- Fosfato sdico dihidratado (FS).
- Cloruro sdico (CS).
Estas sales tienen la propiedad de disolverse rpidamente, y no tienen
tendencia a formar emulsiones.
El estudio se realiz con sales puras (FS, SA y CS) en diferentes cantidades
y con mezclas de SA/FS, FS/CS en distintas proporciones (ver tabla 9-4).
Se prepararon disoluciones de vino sinttico que contenan los compuestos a
estudiar y siguiendo el procedimiento operativo indicado en el apartado 9.2 se
estudi la influencia de la proporcin de sales. Los extractos una vez
acondicionados se analizaron por CG.
A partir de los cromatogramas obtenidos se calcularon los rendimientos de
extraccin. Los porcentajes obtenidos se indican en la tabla 9-4 y la representacin
grfica correspondiente en la figura 9-3.
110
Sanz C. et al, Microchim. Acta, 122, 267-277, (1996)
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
151
COMPUESTOS FS
0.6 g
SA/FS
0.5/0.6 g
SA/FS
1.0/0.6 g
SA/FS
1.5/0.6 g
SA/FS
2.0/0.6 g
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
58.13.0
21.31.0
53.44.1
36.12.1
56.33.3
4.010.10
45.02.4
45.11.3
19.53.1
27.42.1
42.43.1
37.62.0
61.22.0
26.32.1
55.43.2
41.55.0
59.04.4
6.420.61
47.13.3
47.04.4
24.31.2
31.42.1
46.12.0
40.03.5
80.15.0
41.13.1
73.31.2
57.33.5
77.22.5
12.20.2
63.42.3
63.73.4
40.21.6
44.14.8
62.01.2
53.12.0
77.13.0
54.03.1
70.14.4
60.04.2
78.33.3
41.23.4
62.03.1
62.41.0
43.23.2
47.12.0
62.14.1
54.31.0
57.01.1
36.44.0
52.33.2
43.21.0
56.41.1
18.31.0
45.04.2
44.12.3
30.23.5
34.45.4
44.23.1
39.14.1
COMPUESTOS SA
0.5 g
FS/CS
1.0/1.5 g
FS/CS
2.0/0.6 g
CS
2.0 g
CS
3.0 g
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
58.13.0
23.02.0
52.03.1
38.12.3
56.03.2
4.040.03
45.13.3
45.22.4
20.43.3
28.34.2
44.03.1
40.01.1
66.02.2
40.13.0
60.01.2
49.13.0
64.34.3
21.00.2
52.15.4
53.23.2
35.41.0
38.12.0
51.04.0
44.24.1
56.12.1
33.05.0
51.42.3
42.04.0
55.25.2
15.10.4
45.01.5
47.16.0
29.04.1
33.43.2
44.03.3
41.13.1
56.04.0
34.13.1
51.14.2
42.32.2
55.22.3
20.30.3
44.13.0
45.15.1
30.12.5
34.13.2
44.11.1
37.04.0
48.11.2
35.24.3
43.33.6
37.31.5
46.51.3
27.11.2
38.02.2
37.11.0
27.43.1
29.04.1
37.42.0
31.44.0
- Tabla 9-4: Rendimientos de extraccin (%) obtenidos con las sales estudiadas en
microextraccin por desmezcla y detector FID
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
152
- Figura 9-3: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%) obtenidos
con las sales estudiadas en microextraccin por desmezcla y detector FID
Como podemos observar, los mejores resultados se obtienen con la mezcla
SA/FS en las cantidades 1.0/0.6 y 1.5/0.6, no habiendo en general mucha diferencia
entre ambos, aunque se obtienen rendimientos ligeramente mayores con la mezcla
1.5/0.6. Con sta los cidos se extraen entre 41 y 62%; los alcoholes entre 54 y
60% y los steres entre 47 y 78%. Utilizando CS se obtienen los rendimientos ms
bajos.
CS
3.0
CS
2.0
FS/CS
2.0/0.6
FS/CS
1.0/1.5
SA
0.5
SA/FS
2.0/0.6
SA/FS
1.5/0.6
SA/FS
1.0/0.6
SA/FS
0.5/0.6
FS
0.6
100
80
60
40
20
0
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
(
%
)
Sal
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
153
9.3.3.- Tiempo de agitacin
Ya optimizado el disolvente y las sales se repiti el estudio variando el
tiempo de agitacin. A partir de las referencias bibliogrficas
111
, se probaron 30
minutos y una hora de agitacin. Para ello se utiliz un sistema de agitacin
mecnica (agitador orbital SBS de Afora). Se prepararon disoluciones de vino
sinttico se procedi a la extraccin y, una vez acondicionados los extractos, se
analizaron por CG-FID.
Por los resultados obtenidos (tabla 9-5), los cuales se representan
grficamente en la figura 9-4, vemos que no existe diferencia entre utilizar 30 o 60
minutos de agitacin, as que por comodidad se toman los 30 minutos como tiempo
ptimo de agitacin.
COMPUESTOS TIEMPO
30 min 60 min
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
77.03.1 78.13.2
54.11.1 53.52.6
70.24.0 69.33.3
60.02.4 61.51.1
78.41.0 77.91.4
41.32.9 40.63.2
62.62.1 63.12.0
62.22.1 61.82.1
43.71.0 44.31.3
47.23.3 45.43.2
62.12.4 63.12.1
54.04.2 53.83.9
- Tabla 9-5: Rendimientos de extraccin (%) segn el tiempo de agitacin
empleado en microextraccin con sales y detector FID
111
Ortega C. et al, J. Chromatogr. A., 923, 205-214, (2001)
Bertand A., Ann.Technol. Agric., 27, 231-233, (1978)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
154
Tiempo de agitacin (minutos)
60 30 R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
%
90
80
70
60
50
40
30
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
- Figura 9-4: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%) segn
el tiempo de agitacin empleado en microextraccin con sales y detector FID
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
155
9.3.4.- Condiciones ptimas
Una vez estudiadas todas las variables, las condiciones ptimas de trabajo se
muestran en la tabla 9-6.
PARMETROS CONDICIONES
Disolvente
Sal (tipo y cantidad)
Tiempo de agitacin
Volumen de muestra
Volumen de disolvente
Temperatura del detector
Columna
Temperatura del inyector
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
Programa de temperatura
Diclorometano
SA/FS
(1)
(1.5 g/0.6 g)
30 minutos
10.0 mL
2.0 mL
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (0.9 mL min
-1
)
Helio (30 mL min
-1
)
400 mL min
-1
30 mL min
-1
0.2:1
2.0 L
6 C min
-1
10 C min
-1
90 C 170 C 220 C
4 min 1 min 20 min
- Tabla 9-6: Condiciones ptimas de trabajo en microextraccin por desmezcla
(1)
SA/FS: sulfato amnico anhidro/fosfato sdico dihidratado
Los valores de los rendimientos en estas condiciones se muestran en la tabla
9-7.
A3M1B 3M1B HE 1H OE AB DE SD AH AFE AO AD
77.0 54.1 70.2 60.0 78.4 41.3 62.6 62.2 43.7 47.2 62.1 54.0
- Tabla 9-7: Rendimientos en las condiciones ptimas en microextraccin por
desmezcla
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
156
9.4.- Caractersticas analticas
Para obtener las caractersticas analticas se prepararon diferentes
disoluciones en DM con los compuestos en estudio y se inyectaron en las
condiciones cromatogrficas optimizadas. Una vez aplicados los valores de los
rendimientos de los compuestos en este mtodo de extraccin, tal y como se
expuso en el apartado 4-5, los resultados se muestran en la tabla 9-8.
Para el estudio de la reproducibilidad o precisin del mtodo expresado
como s
r
(%) (desviacin estndar relativa porcentual) se realizaron, como en casos
anteriores, tres extracciones de una disolucin en las condiciones optimizadas y se
inyectaron por triplicado.
COMPUESTOS
Pendiente
(mL g
-1
)
1
o.o.
(intervalo de
confianza de 95%)
2
L.D.
(g mL
-1
)
3
L.C.
(g mL
-1
)
4
sr
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
0.01320.0002
0.01650.0004
0.01010.0001
0.01690.0001
0.01880.0002
0.008020.00008
0.03270.0004
0.03500.0006
0.006210.00009
0.1380.001
0.01320.0002
0.01310.0002
-0.02700.0020
-0.06310.0010
-0.02410.0011
1.330.01
-0.07010.0031
-0.02320.0022
-4.850.01
0.06100.0011
-0.007010.00010
-0.1210.012
-0.2210.031
-0.02130.0091
0.0390
0.0307
0.0598
0.0335
0.0266
0.0680
0.0161
0.0155
0.0674
0.0365
0.0389
0.0387
0.129
0.104
0.198
0.113
0.0885
0.224
0.0533
0.0511
0.226
0.124
0.128
0.120
6.1
7.5
5.9
2.4
4.8
4.2
1.1
5.0
4.3
5.8
5.3
2.3
- Tabla 9-8: Caractersticas analticas en microextraccin por desmezcla
1
o.o.= Ordenada en el origen
2
L.D.= Lmite de deteccin
3
L.C.= Lmite de cuantificacin
4
s
r
(%) = Desviacin estndar relativa porcentual
9.5.- Cuantificacin de muestras de vino real
Optimizado el procedimiento de extraccin se pas a aplicarlo a muestras de
vino real. Se tomaron diferentes vinos de la DOCa Rioja (tinto, rosado y blanco).
Siguiendo el procedimiento de extraccin indicado en el apartado 9.2 y con las
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
157
condiciones optimizadas se aplic a las muestras de vino. Los extractos una vez
acondicionados se analizaron por CG con detector FID.
La cuantificacin se realiz mediante rectas de calibrado y por patrn
interno.
9.5.1.- Rectas de calibrado.
Interpolando los valores de rea de pico de los cromatogramas obtenidos en
las rectas de calibrado, y aplicando para cada compuesto el valor del rendimiento
en las condiciones ptimas se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla
9-9.
COMPUESTOS
CONCENTRACIONES (g mL
-1
)
muestra 1 muestra 2 muestra 3
(blanco) (rosado) (tinto)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
6.010.2
4696
1.300.11
34.30.3
2.020.42
3.510.22
0.1710.021
4.810.31
3.930.52
28.90.4
13.80.7
0.960.12
5.610.62
4574
1.460.21
34.60.6
1.630.11
3.620.13
0.1960.023
4.620.66
4.120.72
25.80.3
11.30.6
1.150.52
6.620.32
4733
2.300.12
35.90.7
2.560.33
3.850.32
0.2110.012
3.110.41
2.920.81
16.60.6
3.910.41
1.610.31
- Tabla 9-9: Cuantificacin en el vino real mediante microextraccin por desmezcla.
Rectas de calibrado
9.5.2.- Patrn interno
Para utilizar el mtodo del patrn interno, previamente se calcularon los
valores de las constantes en el disolvente a utilizar como se expuso en el apartado
4-6. Una vez aplicados, como en el caso anterior, a los valores obtenidos los
rendimientos en las condiciones ptimas, los resultados se indican en la tabla 9-10.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
158
COMPUESTOS
CONCENTRACIONES (g mL
-1
)
muestra 1 muestra 2 muestra 3
(blanco) (rosado) (tinto)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
6.120.21
4876
1.420.12
34.60.3
2.130.42
3.640.21
0.1680.011
4.930.31
4.020.53
28.30.3
12.60.7
1.850.42
5.930.61
4554
1.420.01
34.20.2
1.920.63
3.410.92
0.2010.001
4.920.42
3.920.72
27.90.2
11.80.8
1.310.24
7.120.31
4707
2.220.12
35.20.4
2.420.81
3.710.62
0.2100.012
3.200.73
2.810.91
16.10.1
3.620.6
1.600.12
- Tabla 9-10: Cuantificacin en el vino real mediante microextraccin por desmezcla.
Patrn interno
Como podemos ver, se obtienen resultados similares utilizando ambos
mtodos de cuantificacin.
Para conocer si la diferencia entre los resultados obtenidos por ambos
mtodos de cuantificacin era significativa o no, se realiz para cada compuesto un
test de significacin de comparacin de medias, calculando para ello el valor del
estadstico s y comparndolo con el valor de 0.05 trabajando con un 95% de
significacin. Para que la diferencia sea significativa el valor de s calculado debe
ser menor que 0.05. En la tabla 9-11 se muestran los resultados obtenidos para cada
una de las muestras.
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
159
COMPUESTOS
s
(blanco)
s
(rosado)
s
(tinto)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
0.111
0.038
1.000
0.463
0.559
0.553
0.380
0.122
0.482
0.742
0.571
0.029
NS
S
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
S
0.101
0.143
0.975
0.485
0.497
0.621
0.402
0.201
0.385
0.693
0.465
0.136
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
0.212
0.145
0.896
0.356
0.603
0.621
0.296
0.121
0.502
0.805
0.498
0.148
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
- Tabla 9-11: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (microextraccin por
desmezcla). (NS: no significativa, S: significativa)
Como podemos observar nicamente se observ diferencia significativa en
dos compuestos (3M1B y AD) en la muestra de vino blanco, para las muestras de
vino rosado y tinto la diferencia result ser no significativa para todos los
compuestos.
9.5.3.- Efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin
Para comprobar si exista efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin
se realiz un estudio adicionando a nuestras muestras de vino blanco cantidades
conocidas de cada uno de los compuestos a dos niveles. Se realiz la extraccin en
las condiciones optimizadas y los resultados obtenidos se muestran en la tabla 9-
12. En estos resultados estn corregidas las cantidades de cada compuesto que
contena el vino.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
160
COMPUESTOS
Concentracin (g mL
-1
)
aadida
Rendimientos
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
2.0
3.5
150
300
0.5
1.0
12.0
25.0
0.7
1.5
1.0
2.0
0.05
0.10
1.5
2.5
1.5
3.0
9.0
18
4.0
8.0
0.6
1.2
80.02.8
82.83.4
55.32.0
56.61.8
70.03.1
67.02.9
60.04.1
61.23.6
77.14.2
80.04.3
35.02.3
37.52.1
60.03.0
60.01.9
63.34.2
64.03.7
46.62.0
48.32.1
52.22.5
51.13.1
62.51.6
63.71.4
51.61.4
52.52.1
- Tabla 9-12: Rendimientos de extraccin (%) obtenidos por adicin estndar en
muestras de vino
Si comparamos estos rendimientos con los obtenidos con muestras de vino
sinttico (tabla 9-7) vemos que son similares, por lo que deducimos que no existe
efecto matriz.
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID
__________________________________________________________________
161
Un cromatograma obtenido para una muestra de vino tinto utilizando la
microextraccin con sales en las condiciones ptimas se muestra en la figura 9-5.
- Figura 9-5: Cromatograma. Vino tinto, microextraccin por desmezcla
Los compuestos en orden progresivo son: 3M1B; 3M1B; HE; 1H; 3O (p.i.);
OE; AB; DE; SD; AH; AFE; AO; AD
Como conclusin de este estudio, podemos decir que la microextraccin
aplicada a compuestos voltiles en muestras de vino es un mtodo eficaz y rpido y
que consume poco volumen de disolvente.
CAPTULO 10
Microextraccin por desmezcla
II: Detector de Absorcin Molecular
UV-Visible
- Introduccin
- Procedimiento operativo
- Optimizacin de variables
- Caractersticas analticas
- Clculo de rendimientos
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
__________________________________________________________________________________
165
10.- MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA
II: DETECTOR DE ABSORCIN MOLECULAR
ULTRAVIOLETA-VISIBLE
10.1.- Introduccin
Como ya vimos en los objetivos de esta primera parte del trabajo (captulo
2), una de las finalidades era la bsqueda y evaluacin de nuevos mtodos de
anlisis de los compuestos voltiles en el vino. Se pens en la utilizacin de un
detector de absorcin molecular ultravioleta visible (AM UV-Vis) para el
cromatgrafo de gases, por considerarlo novedoso, ya que no se conoca nada en
este campo y nuestro grupo de investigacin tena gran experiencia al respecto.
Una contribucin importante a la espectrometra de absorcin molecular
(EAM) surgi con la llegada de los detectores de red de diodos. Hasta entonces, la
obtencin de un espectro fiable de un gas generado era muy complicado. La
incorporacin de estos detectores al espectrofotmetro permite obtener un espectro
de absorcin molecular desde 190 hasta 820 nm en 0.1 segundos.
La primera vez que se mencion en la bibliografa el acoplamiento de este
detector para cromatografa de gases fue en 1962
112
, se usaba un tubo caliente para
transportar las muestras desde el cromatgrafo hasta una clula de absorcin en el
espectrofotmetro. Posteriormente otros estudios han sido publicados
113
, y ya en
1998 apareci un detector comercial (Inscan AB, Suecia) basado en un sistema
descrito por Lagesson y colaboradores
114
. Dichos autores han seguido trabajando
en este tema
115
.
La alternativa de utilizar un espectrofotmetro de absorcin molecular como
detector en CG se desarroll en el departamento de Qumica (rea de Qumica
Analtica) de la UR, ya que desde 1986 se vena desarrollando una lnea de
112
Kaye W. et al, Anal. Chem., 34, 287-282, (1962)
113
Van Engelen D. L. et al, J. Chromatogr. A, 441, 191-198, (1987)
Driscoll J.N. et al, J. Chromatogr. A, 63, 441-447, (1988)
Bornhop D.J. et al, Rev Sci. Instrum.,63, 191-196, (1992)
Bornhop D.L. et al, J. Chromatogr. A, 684, 259-262, (1994)
Hackett M. et al, J. Chromatogr. A, 243, 695-699, (1995)
114
Lagesson V. et al, Anal. Chem., 61, 1249-1254, (1989)
115
Lagesson V. et al, J. Chromatogr. B, 672, 1-6, (1995)
Lagesson V. et al, Chromatographia, 867, 187-206, (2000)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
166
investigacin encaminada a la sistematizacin y obtencin de procedimientos
analticos para la determinacin de diferentes compuestos. Estos procedimientos se
basaban en la generacin de una fase voltil a temperatura ambiente y posterior
medida de la absorcin molecular de dicho gas.
En la primera etapa de la investigacin, el objetivo era la determinacin de
especies capaces de formar hidruros covalentes voltiles utilizando procedimientos
discontinuos de generacin, para ello se dise un sistema de generacin de
voltiles en el laboratorio. Durante esta etapa se estudi
116
la generacin de los
hidruros ms frecuentes, As, Sb, Se, Sn, Bi, Te, Ge y se realizaron estudios de
interferencias sobre estas especies, tambin se utiliz este sistema para determinar
el in NH
4
+
por formacin de amoniaco
117
, S
=
y SO
3
=
por generacin de sulfuro de
hidrgeno
118
y dixido de azufre
119
. Asimismo, se abord la determinacin de
mezclas binarias de As-Sb, As-Se, Sb-Se y de Se-Bi. Aprovechando la diferente
cintica de generacin de los hidruros desde los diferentes estados de oxidacin, se
realiz tambin un estudio de determinacin simultnea de As(III) y As (V) en una
muestra de vidrio
120
.
En una segunda etapa, se buscaron procedimientos para incrementar la
sensibilidad de las determinaciones e incorporar nuevas especies que pudieran ser
determinadas. Para ello se dise un sistema que se utiliz para la determinacin
simultnea de As(III), Sb(III), Se (IV) y Sn (II)
121
, mezclas de sulfuro y sulfito
122
,
as como de mezclas de tiocianato, sulfuro y sulfito (el tiocianato se volatiliz a
sulfuro de carbonilo
123
).
En todos los estudios anteriores se consegua la generacin de la fase voltil
a temperatura ambiente. Con el fin de ampliar el nmero de compuestos que
pueden ser determinados por EAM UV-Vis se pens en la posibilidad de obtener
los voltiles calentando. Para ello se plante el acoplar un cromatgrafo de gases a
un espectrmetro de absorcin molecular ultravioleta visible. De esta forma se
consegua volatilizar los compuestos y a la vez se poda obtener una separacin
116
Sanz J. et al, Fresen. Z Anal. Chem., 330, 510-515, (1988)
Sanz J. et al, Analyst, 113, 1387-1391, (1988)
Sanz J. et al, Analusis., 21, 27-32, (1993)
117
Sanz J. et al, Mikrochim. Acta, 110, 193-199, (1993)
118
Sanz J. et al, Anal. Letters, 25, 2095-2105, (1992)
119
Cabredo S. et al, Mikrochim. Acta, 127, 239-242, (1997)
120
Sanz J. et al, Anal. Chim. Acta, 225, 113-120, (1991)
121
Cabredo S. et al, Anal. Chim. Acta, 300, 321-327, (1995)
Cabredo S. et al, Talanta, 46, 631-638, (1998)
122
Cabredo S. et al, Talanta , 42, 937-943, (1995)
123
Cabredo S. et al, Anal. Chim. Acta, 318, 377-383, (1996)
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
__________________________________________________________________________________
167
cromatogrfica. El desarrollo de este acoplamiento supuso el trabajo de una Tesis
Doctoral defendida en la Universidad de La Rioja en 1997
124
. En ella, adems del
desarrollo instrumental que supone
125
, se lleva a cabo la determinacin de
derivados del benceno
126
y de hidrocarburos aromticos policclicos
127
entre otros
compuestos.
El trabajo que se plantea en este captulo es la utilizacin de dicho
acoplamiento para la determinacin de un grupo de compuestos voltiles presentes
en el vino
128
.
Dichos compuestos son:
- 3-Metilo-1-butanol (3M1B)
- 1-Hexanol (1H)
- 1-Pentanol (1P)
- 2-Feniletanol (2FE)
- Alcohol benclico (AB)
- Etanol (E)
- Fenol (F)
- Geraniol (G)
10.2.- Procedimiento operativo
El procedimiento de extraccin consisti en:
- En un tubo de microextraccin se ponen 1.5 g de sulfato amnico anhidro ms
0.6 g de fosfato sdico dihidratado, que son las sales responsables de la
desmezcla.
- Se aaden 10.0 mL de la disolucin de vino sinttico que contiene los
compuestos a estudiar y se agita (mecnicamente), hasta completa disolucin.
- Se adiciona 2.0 mL de ter de petrleo, como agente de extraccin.
124
Sanz-Vicente. I., Tesis Doctoral, Universidad de La Rioja, (1997)
125
Galbn J. et al, Fresen. J. Anal. Chem., 355, 406-412, (1996)
Sanz-Vicente I. et al, Chromatographia, 48, 535-541, (1998)
Sanz-Vicente I. et al, Chromatographia, 48, 542-547, (1998)
Sanz-Vicente I. et al, J. Chrom. Sci., 37, 126-132, (1999)
126
Sanz-Vicente I. et al, Chromatographia, 42, 435-542, (1996)
127
Sanz-Vicente I. et al, Chromatographia, 50, 202-208, (1999)
128
Cedrn T. et al, Talanta, 57, 555-563, (2002)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
168
- Se somete a agitacin durante 30 minutos.
- Se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm y se recoge la fraccin de
disolvente o fase orgnica.
- El extracto recogido, una vez acondicionado, se analiza por triplicado en el
cromatgrafo de gases con el acoplamiento (ver descripcin del aparato en el
apartado 3.1.3).
Las condiciones de trabajo se muestran en la tabla 10-1.
PARMETROS CONDICIONES
Volumen y tipo de disolvente
Tipo y cantidad de sal
Tiempo de agitacin
Volumen de muestra
Columna
Temperatura inyector
Temperatura cubeta
Tiempo de integracin
Gas portador
Volumen de inyeccin
Programa de temperatura
2.0 mL de ter de petrleo
sulfato amnico a./fosfato sdico d. (1.5 /0.6 g)
30 minutos
10.0 mL
Chromosorb WHP 80/100 (empaquetada)
265 C
70 C
MEASURE 3,6,0,600
Nitrgeno 25 mL min
-1
50.0 L
20 C min
-1
90 C 170 C
1 min 1 min
- Tabla 10-1: Condiciones de trabajo en microextraccin por desmezcla en CG- EAM
UV-Vis
10.3.- Optimizacin de variables
Se han estudiado distintos parmetros que afectan a la separacin y
determinacin de los compuestos voltiles. Nuestro grupo ya tena experiencia en
esta tcnica y haba estudios previos hechos, tal y como se coment tambin en el
apartado 10.1. La cubeta de cuarzo de flujo de 1 cm de paso ptico ya se haba
usado al igual que el ter de petrleo como disolvente, el nitrgeno como gas
portador y la T de cubeta (se eligi 70 C para que los compuestos no
condensaran). Con la finalidad de encontrar los parmetros idneos para la
separacin de nuestros compuestos se hicieron varios diseos de experimentos.
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
__________________________________________________________________________________
169
Para preparar las disoluciones estndar se disolvieron los patrones de los
compuestos en el disolvente a utilizar y posteriormente se realizaron las diluciones
necesarias. El ter de petrleo fue el disolvente elegido para esta tcnica, ya que no
absorba en ese rango de longitudes de onda, dando mejores resultados que el
diclorometano
El primer diseo usado fue un Plackett-Burman. Se trata de un diseo
especial para determinar la significacin de los parmetros. El nmero de factores
es n-1, y el nmero de experimentos n, donde n es un mltiplo de cuatro. En este
caso concreto n=8 y se realizaron los experimentos por duplicado.
Siete factores o variables se consideraron inicialmente:
- Temperatura del inyector
- Flujo de nitrgeno
- Programa de temperatura del horno
- Volumen de inyeccin
- Saludo (es una variable duma)
- Temperatura de la cubeta
- Tiempo de integracin
Este ltimo factor se refiere al modo de hacer la medida. Para ello es
necesario incorporar al espectrofotmetro programas BASIC adecuados, los
utilizados podemos verlos en el apndice F. Los programas a utilizar dependern
de la informacin que queramos obtener. Estos programas utilizados fueron
diseados en trabajos anteriores. Para que el instrumento realice las medidas es
necesario indicrselo con una sentencia que tiene la siguiente estructura
MEASURE a, b, c, d, donde a, b, c, y d son nmeros que indican segundos. El
primero, "a" es el tiempo que realmente est midiendo en cada ciclo, "b" es el
tiempo que transcurre desde que empieza a tomar un dato hasta que empieza a
adquirir el siguiente (lo llamado duracin del ciclo), "c" es el tiempo de retardo
(tiempo que transcurre desde que se le da la orden de medir hasta que realmente
empieza, que en nuestro caso es cero) y el ltimo "d", indica el tiempo total que
estar adquiriendo datos.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
170
Para poner a punto el procedimiento para determinar una serie de
compuestos mediante esta tcnica, los pasos a seguir fueron los siguientes:
1. Realizar sus espectros de absorcin molecular UV-Visible en fase gas.
Para estos estudios no es necesario un programa especial. Este estudio es
primordial, primero porque nos permite elegir la longitud de onda idnea,
y segundo porque obtenerlos en fase lquida puede dar informacin falsa
ya que los espectros tienden a desplazarse. Los espectros obtenidos al
inyectar las disoluciones individuales de cada uno de los compuestos en el
cromatgrafo, se muestran en la figura 10-1.
2. Elegir una longitud de onda de medida en la que absorban todos los
compuestos y realizar los estudios de optimizacin que sean necesarios, ya
que cuando el solapamiento espectral es grande, los mejores resultados se
obtienen con mtodos multilongitud de onda, mientras que si es pequeo es
conveniente utilizar el mtodo clsico de medida a una nica longitud de
onda. En este caso, la longitud de onda utilizada es la misma en todo el
programa, de manera que la medida resulta ms rpida y cmoda. En este
caso concreto se eligi 190 nm para hacer la optimizacin.
3. Seleccionar la longitud de onda de medida ms adecuada para cada
compuesto y realizar los estudios de caracterizacin analtica trabajando a
diferentes longitudes de onda. En este caso, la longitud de onda de medida
se puede ir cambiando a lo largo del cromatograma.
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
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171
- Figura 10-1: Espectros de absorcin molecular en fase gas de los compuestos
Etanol Fenol
1-Pentanol Alcohol benclico
3-Metil-1-butanol 2-Feniletanol
Hexanol
Geraniol
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Long. Onda (nm) Long. Onda (nm)
Long. Onda (nm) Long. Onda (nm)
Long. Onda (nm) Long. Onda (nm)
Long. Onda (nm)
Long. Onda (nm)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
172
Para realizar el diseo de Plackett-Burman se eligieron siete variables
(factores) con dos niveles cada uno, los cuales se indican en la tabla 10-2. Estos
niveles se seleccionaron basndonos en trabajos anteriores y en ensayos previos.
x
i
: VARIABLES Nivel - Nivel +
x
1 :
Temperatura del inyector (C)
x
2 :
Flujo de nitrgeno (mL min
-1
)
x
3 :
Temperatura del horno (C)
x
4 :
Volumen de inyeccin (L)
x
5 :
Saludo
x
6 :
Temperatura de la cubeta (C)
x
7 :
Tiempo de integracin (s)
265 300
25 40
(1) (2)
30 50
SI NO
70 140
MEASURE 3,6,0,600 MEASURE 2,5,0,600
- Tabla 10-2: Factores y niveles considerados en el diseo de Plackett-Burman
(1): 120 C (1 minuto) a 20 C min
-1
hasta 200 C (1 min)
(2): 90 C (1 minuto) a 20 C min
-1
hasta 170 C (1 min)
El nmero de experimentos totales fueron 16 ya que se hizo una rplica de
los ocho. Adems, stos fueron aleatorizados. Se utiliz el programa Unscrambler
donde se obtuvo la matriz experimental, la cul se muestra en la tabla 10-3.
Si consideramos el error experimental por distribuciones estadsticas
conocidas, pueden hacerse distintas consideraciones:
a) Los errores experimentales deberan ser independientes en cada uno de los
experimentos.
b) La varianza del error experimental debera ser constante en todo el
dominio experimental.
Sin embargo, el sistema puede estar influenciado por situaciones que no
estn aleatorizadas y producir errores sistemticos. Por ello, se procura corregir
esto aleatorizando la metodologa de trabajo. Esta precaucin transforma los
errores del sistema en aleatorios.
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
__________________________________________________________________________________
173
FACTORES EXPERIMENTOS
x
1
x
2
x
3
x
4
x
5
x
6
x
7
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
+
+
-
+
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
+
-
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
+
+
+
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
-
+
+
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
-
-
-
+
+
-
+
+
+
-
+
-
-
- Tabla 10-3: Matriz experimental con el diseo de Plackett-Burman, x
1=
T del inyector
,
x
2
= flujo de nitrgeno
,
x
3
=T del horno, x
4
=volumen de inyeccin, x
5
=saludo, x
6
=T
de la cubeta, x
7
= tiempo de integracin
En nuestro caso, con la finalidad de simplificar el programa de medida, el
espectrofotmetro se program como ya comentamos a 190 nm, longitud de onda a
la que absorben todos los compuestos a estudiar. Las respuestas o variables
dependientes son la resolucin entre los picos. Trabajamos con ocho compuestos,
por lo que el nmero de respuestas que obtenemos son siete:
- R
12
(etanol y 1-pentanol)
- R
23
(pentanol y 3-metil-1-butanol)
- R
34
(3-metil-1- butanol y hexanol)
- R
45
(hexanol y fenol)
- R
56
(fenol y bencilalcohol)
- R
67
(bencil alcohol y 2-feniletanol)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
174
- R
78
(2-feniletanol y geraniol)
El clculo de la resolucin (R) se hizo siguiendo la frmula:
donde: t
1
es el tiempo al que sale el primer pico en el cromatograma,
t
2
el tiempo al que sale el segundo pico,
1
la anchura del primer pico a mitad de altura y
2
la anchura del segundo pico a mitad de altura.
Una vez introducidos los valores de resolucin obtenidos en cada uno de los
experimentos, se tratan estos datos con el programa SPSS y se obtienen con un
estudio de ANOVA los valores de los efectos de las variables (95%), lo que
muestra si las variables son significativas o no lo son, en funcin del valor de p
(valor de significacin). Estos resultados se muestran en la tabla 10-4.
Variables R
12
R
23
R
34
R
45
R
56
R
67
R
78
Temperatura del inyector
Flujo de nitrgeno
Temperatura del horno
Volumen de inyeccin
Saludo
Temperatura de la cubeta
Tiempo de integracin
NS
S
S
NS
NS
NS
S
NS
S
S
NS
NS
NS
S
NS
S
S
NS
NS
NS
S
NS
S
S
NS
NS
NS
S
NS
S
S
NS
NS
NS
S
NS
S
S
NS
NS
NS
S
NS
S
S
NS
NS
NS
S
- Tabla 10-4: Resultados obtenidos en el diseo de Plackett- Burman,
(S= significativo, NS= no significativo)
) ( 2 / 1
2 1
1 2
e e
=
t t
R
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
__________________________________________________________________________________
175
A la vista de esta tabla, queda de manifiesto que las variables significativas
son tres, las dos continuas (flujo de nitrgeno y tiempo de integracin) y otra
discontinua (T del horno).
Una vez estudiados los resultados y con la finalidad de realizar un sencillo
diseo, se tomaron en consideracin las dos variables continuas significativas y se
realizo un diseo factorial, eligiendo como rampa de temperatura (variable
discontinua) la siguiente:
20 C min
-1
90 C 170 C
1 min 1 min
El diseo factorial propuesto es un 2
2
con dos factores y dos niveles cada
factor y con dos puntos centrales. Se hizo una rplica por cada experimento,
resultando un total de 12, todos ellos aleatorizados. La inclusin de dos puntos
centrales se hizo con la finalidad de observar si exista curvatura, adems de que
tambin ayudan junto con las rplicas a calcular los coeficientes de varianza. Esta
tcnica de optimizacin (2
2
+2 puntos centrales) tiene la ventaja de dar informacin
sobre los efectos y las interacciones entre los factores. La variable dependiente es
la resolucin entre los picos cromatogrficos (obtenidos a 190 nm), las variables
independientes son el flujo de nitrgeno (x
1
) y el tiempo de integracin (x
2
). La
matriz experimental y el modelo se obtuvieron utilizando Statgraphics. Los valores
de las respuestas y la matriz experimental se muestran en la tabla 10-5.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
176
Experim. Puntos normalizados Variables
x
1
x
2
flujo tiempo int.
Resolucin
R
12
R
23
R
34
R
45
R
56
R
67
R
78
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
-
0
0
+
+
-
-
0
0
+
+
-
-
0
0
+
-
+
-
0
0
+
-
+
25
36
36
40
40
25
25
36
36
40
40
25
2,5,0,600
3,7,0,600
3,7,0,600
3,6,0,600
2,5,0,600
3,6,0,600
2,5,0,600
3,7,0,600
3,7,0,600
3,6,0,600
2,5,0,600
3,6,0,600
4.2 1.6 4.4 5.0 1.6 3.1 3.1
3.7 1.0 4.3 5.0 1.7 2.3 4.3
3.6 1.1 3.9 4.5 1.6 2.2 3.9
3.3 1.4 4.0 3.7 2.0 2.0 2.2
2.2 1.0 2.5 3.1 1.7 1.4 2.3
4.8 1.7 4.7 5.1 3.0 1.7 3.5
4.2 1.5 4.1 4.9 1.7 2.9 3.1
3.6 1.1 4.0 4.6 2.0 2.2 4.0
3.7 1.1 4.1 4.9 1.7 2.2 4.2
3.3 1.4 4.1 3.7 2.1 2.1 2.3
2.2 1.0 2.6 3.2 1.8 1.5 2.4
4.9 1.5 4.6 4.9 2.8 1.9 3.4
- Tabla 10-5: Matriz experimental y resultados del diseo 2
2
+2
La ecuacin general del modelo es:
y = |
0
+ |
1
x
1
+ |
2
x
2
+ |
3
x
1
x
2
donde y es la variable respuesta, x
i
son los factores y |
i
son los coeficientes de
ajuste de las diferentes variables, siendo |
0
una constante de la variable respuesta.
En nuestro caso, y es la resolucin, x
1
es el flujo de nitrgeno y x
2
el tiempo
de integracin. Para ver que variables influyen con ms fuerza incluyendo el signo
o direccin, si haba interaccin entre ellas y si los bloques de las rplicas eran o no
significativas (al 95%) se hizo un clculo de los efectos donde el valor dep nos
hizo ver que, en todos los casos, la interaccin entre los dos efectos era
estadsticamente no significativa (p mayor de 0.05), por tanto |
3
es prcticamente
cero. Adems no haba diferencias significativas entre los distintos grupos de
rplicas, ya que el efecto del bloque tambin tena un valor menor a 0.05.
Una vez observados los valores de significacin de las variables en estudio,
se calcularon los valores de los coeficientes de ajuste, los cuales se muestran en la
tabla 10-6.
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
__________________________________________________________________________________
177
y
|
0
|
1
|
2
R
12
R
23
R
34
R
45
R
56
R
67
R
78
3.15 -0.108 0.0153
1.45 -0.0268 0.00272
1.70 -0.0676 0.0166
5.13 -0.0877 0.00820
0.178 -0.0276 0.0113
4.37 -0.0353 0.00380
2.62 -0.0390 0.00705
- Tabla 10-6: Valor de los coeficientes de ajuste en el
diseo 2
2
+2 en CG-EAM UV-Vis
Podemos, por tanto, concluir que el flujo de nitrgeno es el factor que
influye ms (ya que el valor absoluto de sus coeficientes es mayor que los valores
de los coeficientes del tiempo de integracin), pero al nivel ms bajo (25 mL min
-
1
), ya que en todos los casos los coeficientes tienen valor negativo. El tiempo de
integracin, es para todas las respuestas estadsticamente significativo y positivo
Una vez finalizado el estudio estadstico y teniendo en cuenta los ensayos
previos y los estudios anteriores, se puede concluir que las condiciones ptimas son
las que se muestran en la tabla 10-7.
PARMETROS CONDICIONES
Disolvente
Sal (tipo y cantidad)
Tiempo de agitacin
Volumen de muestra
Volumen de disolvente
Temperatura del inyector
Flujo de nitrgeno
Volumen de inyeccin
Temperatura de la cubeta
Tiempo de integracin
Temperatura del horno
ter de petrleo
SA/FS
(1)
(1.5 g /0.6 g)
30 minutos
10.0 mL
2.0 mL
265 C
25 mL min
-1
50 L
70 C
MEASURE 3,6,0,600
20 C min
-1
90 C 170 C
1 min 1 min
- Tabla 10-7: Condiciones ptimas para la microextraccin por desmezcla en CG- EAM
UV-Vis.
(1)
SA/FS: sulfato amnico anhidro/fosfato sdico dihidratado
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
178
Optimizadas las condiciones, el cromatograma obtenido con esta tcnica
para la mezcla de los compuestos voltiles en ter de petrleo se muestra en la
figura 10-2.
- Figura 10-2: Cromatograma. Voltiles en ter de petrleo, microextraccin por
desmezcla en CG- EAM UV-Vis
10.4.- Caractersticas analticas
Una vez optimizadas las condiciones qumicas e instrumentales, se procedi
a realizar los estudios de calibracin de cada uno de los compuestos.
Se inyectaron las disoluciones preparadas con los ocho compuestos en ter
de petrleo y los valores de las absorbancias para cada pico se consideraron como
parmetros de cuantificacin.
La composicin de dichas mezclas se estableci preparando cinco
disoluciones en ter de petrleo con concentraciones diferentes de los distintos
compuestos, la forma de aleatorizar las concentraciones en las disoluciones se hizo
etanol 1-pentanol
3-metil-1-butanol
hexanol
fenol
alcohol benclico
2-feniletanol
geraniol
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
TIEMPO (S)
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
__________________________________________________________________________________
179
de la siguiente forma: en ocho cajas (una por compuesto) se colocaron cinco piezas
de papel, una por cada valor de concentracin, para la mezcla primera se toma un
papelito de cada caja de manera que la concentracin final de la mezcla en cada
uno de los compuestos es totalmente aleatoria. Se procede del mismo modo para
las cinco mezclas. Las disoluciones quedan establecidas segn la tabla 10-8:
COMPUESTOS disoluciones
1
(g mL
-1
)
2
3 4 5
Etanol
1-Pentanol
3-Metil-1-butanol
1-Hexanol
Fenol
Alcohol benclico
2-Feniletanol
Geraniol
966
3720
3230
1987
91.2
147
252
336
1490
3968
2842
2484
114
128
101
252
1876
3472
3617
1490
45.6
202
151
302
2208
4213
3876
993
148
73.6
63.2
151
2484
2976
4134
1738
34.2
55.5
202
201
- Tabla 10-8: Concentraciones de las disoluciones para el estudio de calibracin en
CG-EAM UV-Vis
La tabla 10-9 muestra las caractersticas analticas de los compuestos:
valores de las pendientes de las rectas de calibrado, lmites de deteccin (LD) y
desviacin estandar relativa porcentual s
r
(%). Los valores de R
2
en las rectas
fueron en todos los casos mayores de 0.99.
COMPUESTOS Pendiente
(mL g
-1
)
LD
(g mL
-1
)
s
r
(%)
Etanol
1-Pentanol
3-Metil-1-butanol
1-Hexanol
Fenol
Alcohol benclico
2-Feniletanol
Geraniol
1.08 E
-4
1.02 E
-4
9.03 E
-5
9.51 E
-5
2.85 E
-3
5.95 E
-4
8.31 E
-4
4.21 E
-4
62.0
66.0
74.1
71.0
2.30
11.1
8.11
16.0
3.0
8.1
6.0
4.2
2.1
5.0
4.0
6.1
- Tabla 10-9: Caractersticas analticas en microextraccin por desmezcla en
CG-EAM UV-Vis
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
180
10.5.- Clculo de rendimientos
Una vez optimizadas las variables que afectan a la separacin de los
compuestos se realiz la aplicacin de la metodologa a muestras de vino sinttico.
Se prepararon tres muestras de vino sinttico con los 8 compuestos en un
rango de concentraciones entre 50.0 y 2000 g mL
-1
, se sometieron al
procedimiento de extraccin y la fase orgnica separada se inyect en el
cromatgrafo de gases (50.0 L). Tal y como se indic en el apartado 4.7 se
calcularon los rendimientos de extraccin a partir de los valores de las K que
aparecen en el apndice A. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 10-10.
Como observamos, en el vino sinttico los rendimientos obtenidos estn
entre 30 y 48%, excepto para el 3 metil-1-butanol- cuyo valor fue del 17% y para el
alcohol benclico que se extrae por encima del 100%.
Este sistema de acoplamiento tiene el problema de la sensibilidad, por ello
no se hizo un estudio cuantitativo en muestras reales de vino (tabla 10-10), aunque
consideramos que puede ser una importante y novedosa lnea de actuacin. Lo que
se hizo fue calcular los rendimientos en vinos reales por el mtodo de la adicin
estndar, aadiendo diferentes concentraciones de los ocho compuestos en tres
vinos blancos de Rioja. En todos los casos, los rendimientos obtenidos por este
mtodo fueron similares a los de los vinos sintticos, exceptuando el caso del
hexanol cuyo valor fue del 68% para el vino real, frente al 48% en el caso de
muestras sintticas.
COMPUESTOS Rendimiento (%)
en vino sinttico
Rendimiento (%)
en vino real
Etanol
1-Pentanol
3-Metil-1-butanol
1-Hexanol
Fenol
Alcohol benclico
2-Feniletanol
Geraniol
32.6
35.0
17.1
48.5
34.5
108
31.9
30.3
31.9
29.9
18.1
68.0
32.2
101
30.1
28.9
- Tabla 10-10: Rendimientos de extraccin(%) en microextraccin por desmezcla en
CG-EAM UV-Vis
CAPTULO 11
Extraccin en fase slida (SPE)
- Introduccin
- Procedimiento operativo
- Optimizacin de variables
- Volumen de muestra
- Volumen de elucin
- Condiciones ptimas
- Caractersticas analticas
- Cuantificacin en muestras de vino real
- Rectas de calibrado
- Patrn interno
- Efecto de la matriz en los rendimientos de
extraccin
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
__________________________________________________________________
183
11.- EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
11.1.- Introduccin
Con el fin de conseguir mejores rendimientos de extraccin en la
preconcentracin de voltiles, se hicieron ensayos con otra metodologa de trabajo:
la extraccin en fase slida o Solid Phase Extraction (SPE). Con ella se ha
reducido el uso de disolventes orgnicos y se han evitado problemas como la
incompleta separacin de fases y la utilizacin de material ms frgil y caro, como
en el caso de la ELL que est siendo desplazada, en la mayora de los casos, por
nuevas tcnicas.
La forma de operar con esta tcnica consiste en hacer pasar la disolucin que
contiene los analitos a estudiar sobre una fase slida que los adsorbe de manera
especfica. Tras la adsorcin, los analitos son extrados con una pequea cantidad
de disolvente que tiene ms afinidad por ellos que la fase slida.
Son numerosas las fases slidas que existen en el mercado al igual que sus
aplicaciones. La fase slida puede ser un disco de papel de filtro de pocos
centmetros de dimetro qumicamente modificado, hasta una pequea columna
empaquetada, un cartucho tubular en forma de jeringa hipodrmica o un pequeo
embudo empacado parcialmente con pequeas partculas adsorbentes.
Se requiere mayor superficie para retener cantidades mayores de analito, de
manera que la cantidad de fase slida que se emplea depende del volumen de
muestra y de la concentracin de analitos presentes.
Las superficies de las fases slidas se clasifican por un conjunto de atributos
qumicos en polares o no polares; cidas, neutras o bsicas; hidroflicas o
hidrofbicas y catinicas o aninicas. As, los diferentes tipos de fases permiten
aislar distintas clases de compuestos.
Ya en 1982 Williams et al
129
utilizaron C18 como fase slida para extraer
compuestos voltiles en vino y en 1985 Gunata et al
130
utilizaron resina XAD-2
129
Williams P.J. et al, J. Chromatogr. A, 235, 471-480, (1982)
130
Gunata Y.Z. et al, J. Chromatogr. A, 331, 83-90, (1985)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
184
con el mismo fin, y a partir de entonces son numerosos los trabajos encontrados
con stas y con otras fases slidas
131
.
Tambin se han producido avances respecto a la posibilidad de automatizar
esta metodologa y se han descrito sistemas que permiten realizar todos los pasos
del pretratamiento de forma automtica
132
.
Segn se describe en la bibliografa consultada
133
, adems de la experiencia
que se tena sobre este tema en nuestro grupo de trabajo
134
, la fase slida ms
utilizada para la preconcentracin y separacin de los voltiles en alimentos es la
C18, por lo que fue sta la que se utiliz (Zorbax C18).
Se trata de un cartucho de jeringa tradicional de 3 mL, empaquetado con 200
mg de relleno. El relleno es una estructura de octadecil silano (ODS) (ver figura
11-1), enlazado covalentemente a la superficie de una partcula de slice, con un
tamao promedio de poro de 80 .
- Figura 11-1: Estructura qumica del relleno del cartucho (ODS)
Los compuestos se retienen en fase reversa, que consiste en separaciones,
donde la matriz (fase polar o moderadamente polar) se separa en una fase
estacionaria no polar. La retencin de los analitos orgnicos en los materiales de
131
Wadat K. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 4362-4366, (1997)
Wertens D.R. et al, Am. J. Enol. Vitic., 44, 275-284, (1993)
Edwards C.G. et al, J. Agric. Food Chem., 38, 311-320, (1990)
Gelsomini N. et al, J. High Resolut. Chromatogr., 13, 352-355, (1990)
132
Marvin C.H. et al, Anal. Chem., 62, 1495-1498, (1990)
133
Arrhenius S.P. et al, J. Agric. Food Chem., 44, 1085-1090, (1996)
Gianotti S. et al, L`Enotecnico, 32, 61-64, (1991)
134
Senz C. et al, Mikrochim. Acta, 122, 267-277, (1996)
Senz C. et al, Analusis., 23, 255-257, (1995)
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
__________________________________________________________________
185
SPE es debida, principalmente, a fuerzas de atraccin de van der Waals o fuerzas
de dispersin.
El proceso de separacin de los compuestos se representa en la figura 11-2.
Al pasar la muestra se adsorben tanto los compuestos de inters como impurezas.
La eleccin del disolvente adecuado hace que en la elucin, obtengamos los
compuestos en estudio.
(a)
(b)
- Figura 11-2: Fase slida (a) y elucin selectiva en SPE y smbolos (b)
dte
matriz
impureza
compuesto
disolvente
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
186
La extraccin en fase slida es un proceso en etapas que se muestra
grficamente en la figura 11-3.
1. El primer paso es la seleccin del tubo o cartucho.
2. Acondicionamiento o activacin de la fase slida con un volumen de
disolvente.
3. Adicin de la muestra. El volumen mximo que se puede adicionar
viene marcado para cada aplicacin y condiciones de uso. El paso de la
muestra se hace lentamente utilizando en nuestro caso un mbolo que
provoca una presin y la hace pasar. El flujo de paso de la muestra,
puede afectar la retencin de los compuestos. Generalmente, ste no
suele exceder de 5 mL min
-1
.
4. Posibilidad de lavado para eliminar impurezas.
5. Elucin de los compuestos a analizar. Se hace con un pequeo
volumen de disolvente que desplaza los compuestos de inters. El flujo
lento tambin favorece en este paso.
1 2 3
- Figura 11-3: Pasos en SPE
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
__________________________________________________________________
187
4 5
- Figura 11-3: Continuacin
En la figura 11-4 se muestran una serie de cartuchos comerciales de
diferentes volmenes para SPE.
- Figura 11-4: Cartuchos comerciales para SPE
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
188
11.2.- Procedimiento operativo
El procedimiento utilizado se indica a continuacin:
- Acondicionamiento. La fase slida (Zorbax C18) sobre la que se hace la
extraccin necesita una activacin previa antes de su uso. En nuestro caso
se utilizan 3 mL de metanol seguidos de 3 mL de agua destilada que se
inyectan manualmente a travs de la fase slida con el mbolo de una
jeringa.
- Se pasan 10.0 mL de la muestra a analizar a travs del cartucho de fase
slida.
- Se eluyen los compuestos de la muestra que contiene los compuestos objeto
de estudio con 3.0 mL de diclorometano.
- Se aade el patrn interno al extracto y se analiza, por triplicado, por
cromatografa de gases con detector FID.
Las condiciones cromatogrficas son las que se muestran en el captulo 4,
apartado 4.4.5.
11.3.- Optimizacin de variables
En este procedimiento se optimizaron las siguientes variables:
- Volumen de muestra
- Volumen de elucin
Los compuestos con los que trabajamos fueron:
- 1-Hexanol (1H)
- 2-Feniletanol (2FE)
- 3-Metil-1-butanol (3M1B)
- Acetato de 2-feniletilo (AFE)
- Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B)
- cido decanoico (AD)
- cido hexanoico (AH)
- cido octanoico (AO)
- Hexanoato de etilo (HE)
- Octanoato de etilo (OE)
- Succinato de dietilo (SD)
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
__________________________________________________________________
189
11.3.1.- Volumen de muestra
Para optimizar el volumen de muestra, se realiz un estudio con distintos
volmenes de sta (10.0 mL y 25.0 mL). El estudio, como en los anteriores
captulos de otros mtodos de extraccin, se realiz con diclorometano como
eluyente. Para ello se prepar una disolucin de vino sinttico en la que la
concentracin de los compuestos a analizar fue de 35.4 a 120 g mL
-1
. El volumen
de disolvente utilizado fue de 5.0 mL (aunque se hizo una segunda extraccin con
otros cinco mL para asegurar que no quedaban analitos en el cartucho). Al extracto
obtenido se le aadi el p.i. (3-octanol).
Para cuantificar se utiliz el mtodo del patrn interno tomando la seal de
rea de los cromatogramas obtenidos como parmetro de cuantificacin. Los
valores de K correspondientes a cada compuesto respecto al patrn interno 3-
octanol se muestran en el apndice A. Los resultados obtenidos (rendimientos) se
indican en la tabla 11-1 y su representacin grfica en la figura 11-5.
COMPUESTOS
Rendimiento (%)
10.0 mL muestra 25.0 mL muestra
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
70.91.3
90.20.4
68.32.2
83.71.2
78.20.7
83.82.9
78.30.9
85.71.8
75.61.4
79.00.6
76.21.0
60.22.3
73.51.2
54.30.9
73.00.3
58.11.7
65.61.4
65.90.8
72.52.3
56.32.5
56.03.1
48.02.8
- Tabla 11-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos volmenes de muestra en
SPE
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
190
- Figura 11-5: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
con distintos volmenes de muestra en SPE
Si se analizan los resultados, se observa que con los 25.0 mL no mejoran
respecto a utilizar 10.0 mL. Por ello se considera el volumen de 10.0 mL de
muestra a introducir en la fase slida idneo por las caractersticas del cartucho.
Los porcentajes de extraccin en este caso estn en un rango entre 68% y 84% para
steres, entre 76% y 90% para alcoholes y entre 76% y 86% para cidos. Esta
tcnica es sencilla, cmoda y consume poco disolvente orgnico.
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
__________________________________________________________________
191
11.3.2.- Volumen de elucin.
Para estudiar la influencia del volumen de elucin se realizaron dos estudios:
- Eluyendo con 5.0 mL de disolvente dos veces consecutivas y a continuacin,
una vez acondicionados los extractos, se analizaron por cromatografa de gases
(5+5).
- El segundo ensayo consisti en pasar primero 3.0 mL, a continuacin se volvi
a eluir con otros 2.0 ml y por ltimo se pasaron otros 2.0 mL. Las tres
fracciones, una vez acondicionadas, se analizaron por separado (3+2+2).
Observamos directamente en los cromatogramas (reas de los picos
cromatogrficos) que los compuestos se eluyen prcticamente en los tres primeros
mL utilizados, aunque se extraen algunos de los compuestos en los siguientes 2 mL
como puede verse en la representacin grfica de la figura 11-6. Por ello elegimos
como volumen de elucin 3 mL de diclorometano ya que la cantidad de analitos
que se obtiene con los 2 mL restantes se puede considerar despreciable.
2.0 2.0 3.0
A
r
e
a
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
Volumen de elucin (mL)
- Figura 11-6: Representacin grfica del volumen de elucin
utilizado en SPE (3+2+2)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
192
11.3.3.- Condiciones ptimas
Una vez optimizadas las variables en estudio, las condiciones ptimas de
trabajo se muestran en la tabla 11-2.
PARMETROS CONDICIONES
Disolvente
Volumen de muestra
Volumen de elucin
Temperatura detector
Columna
Temperatura inyector
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
Programa de temperatura
Diclorometano
10.0 mL
3.0 mL
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (0.9 mL min
-1
)
Helio (30 mL min
-1
)
400 mL min
-1
30 mL min
-1
0.2:1
2.0 L
4 C min
-1
60 C 170 C
4 min 12 min
- Tabla 11-2: Condiciones ptimas en SPE
Los rendimientos obtenidos con estas condiciones se muestran en la tabla
11-3.
A3M1B 3M1B HE 1H OE SD AFE AH 2FE AO AD
71.6 91.1 67.6 83.2 78.7 84.3 76.4 84.8 74.7 78.1 76.4
- Tabla 11-3: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (SPE)
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
__________________________________________________________________
193
11.4.- Caractersticas analticas
Se procedi a hacer las rectas de calibrado con esta metodologa de trabajo
para cada uno de los compuestos utilizados. Para ello se prepararon diferentes
disoluciones de los compuestos en estudio (incluido el p.i.) entre 0.500 y 200 g
mL
-1
en DM y se inyectaron en las condiciones optimizadas. A los valores de
pendiente, lmite de deteccin y lmite de cuantificacin (tal y como se expuso en
el apartado 4.5) se aplicaron los rendimientos de extraccin de cada compuesto en
esta metodologa. Los resultados se muestran en la tabla 11-4. Como parmetro de
cuantificacin se emple el rea del pico cromatogrfico.
Para el estudio de la reproducibilidad o precisin del mtodo expresado
como s
r
(%) (desviacin estndar relativa) se realizaron tres extracciones de una
disolucin en las condiciones optimizadas y se inyectaron por triplicado.
COMPUESTOS Pendiente
(mL g
-1
)
1
o.o.
(intervalo de
confianza de 95%)
2
L.D.
(g mL
-1
)
3
L.C.
(g mL
-1
)
4
s
r
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.01220.0002
0.02820.0007
0.01010.0001
0.02170.0002
0.01890.0002
0.04720.0009
0.2240.006
0.01210.0002
0.008960.00015
0.01660.0003
0.01860.0002
-4.81 E
-2
0.02E
-2
-1.21E
-2
0.31E
-2
-4.03E
-2
0.03E
-2
-5.10E
-2
0.61E
-2
-1.01 E
-
0.11E
-2
-2.53E
-2
0.82E
-2
-8.21E
-2
0.12E
-2
-2.64E
-2
0.73E
-2
-3.62E
-2
0.31E
-2
-1.93E
-2
0.40E
-2
-1.03E
-2
0.52E
-2
0.0416
0.0183
0.0621
0.0245
0.0268
0.0114
0.0224
0.0343
0.0574
0.0312
0.0276
0.137
0.0611
0.208
0.0814
0.0891
0.0367
0.0745
0.114
0.190
0.101
0.0909
4.0
3.1
1.2
2.7
4.1
2.2
3.2
3.1
2.0
2.6
3.2
- Tabla 11-4: Caractersticas analticas en SPE,
1
o.o.= Ordenada en el origen
2
L.D.= Lmite de deteccin
3
L.C.= Lmite de cuantificacin
4
s
r
(%) = Desviacin estndar relativa porcentual
11.5.- Cuantificacin en muestras de vino real
Una vez optimizado el procedimiento de extraccin se pas a aplicarlo a
muestras de vino real. Para ello seguimos el mismo protocolo de actuacin,
haciendo pasar la muestra de vino (10.0 mL) a travs de la fase slida y posterior
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
194
elucin con 3.0 mL de DM. Al extracto se le aade el patrn interno y se inyecta
en el cromatgrafo por triplicado. Para ello se utilizaron cuatro muestras de vino
tinto joven de la DOCa Rioja.
11.5.1.- Rectas de calibrado
Interpolando los valores de rea de pico de los cromatogramas obtenidos en
las rectas de calibrado, y aplicando para cada compuesto el valor del rendimiento
en las condiciones ptimas se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla
11-5.
COMPUESTOS
CONCENTRACIN (g mL
-1
)
muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
3.390.22
4776
4.090.11
27.90.3
1.880.40
2.820.22
nd
5.990.52
30.10.3
9.060.71
3.420.41
3.550.30
4657
4.300.01
29.30.2
1.970.32
2.960.14
nd
6.390.61
31.50.6
9.510.50
3.590.11
3.620.21
4675
4.370.21
29.80.4
2.010.51
3.090.32
nd
6.410.42
32.20.2
9.690.60
3.660.71
3.250.20
4684
3.920.19
26.70.34
1.840.48
2.720.74
nd
5.760.31
28.80.4
8.690.21
3.280.30
- Tabla 11-5: Cuantificacin en vino real mediante SPE. Rectas de calibrado
(nd: no detectado)
11.5.2.- Patrn interno
Para utilizar el mtodo del patrn interno previamente se calcularon los
valores de las constantes en el disolvente a utilizar como se expuso en el apartado
4.6. Una vez aplicados, como en el caso anterior, a los valores obtenidos, los
rendimientos en las condiciones ptimas, los resultados se indican en la tabla 11-6.
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
__________________________________________________________________
195
COMPUESTOS
CONCENTRACIN (g mL
-1
)
muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
3.420.12
4696
4.110.21
26.80.3
1.680.42
2.760.16
nd
5.740.41
29.00.2
8.960.70
3.310.31
3.450.22
4635
4.270.10
27.10.1
1.950.26
2.940.13
nd
6.370.41
30.50.5
9.210.41
3.540.12
3.190.11
4593
4.130.11
28.70.6
2.110.51
3.100.34
nd
6.260.41
31.90.2
9.590.62
3.650.70
3.820.24
4624
3.980.19
27.70.3
1.960.46
2.870.70
nd
5.940.31
28.90.4
9.190.22
3.470.27
- Tabla 11-6: Cuantificacin en vino real mediante SPE. Patrn interno
(nd= no detectado)
Observamos, a partir de los valores obtenidos, que los resultados son
similares utilizando ambos mtodos de cuantificacin.
Con la finalidad de conocer si la diferencia entre los resultados por ambos
mtodos de cuantificacin era significativa o no, como se ha venido haciendo en
metodologas anteriores, se realiz, para cada compuesto una prueba estadstica de
comparacin de medias en la que se calcul la significacin (s). Tomando como
probabilidad el 95%, para ver si el valor de la s era mayor de 0.05, en cuyo caso
se aceptaba la hiptesis nula, es decir, no exista diferencia significativa entre los
resultados dados por ambos mtodos de cuantificacin.
En la tabla 11-7 se indican los resultados obtenidos.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
196
COMPUESTOS
s SIGNIFICACIN
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.469
0.322
0.122
0.145
0.611
0.743
*
0.514
0.931
0.714
0.128
NS
NS
NS
NS
NS
NS
*
NS
NS
NS
NS
- Tabla 11-7: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (SPE)
(NS: no significativa, *: no hay datos)
Vemos que para ninguno de los compuestos estudiados existe diferencia
significativa entre los resultados por ambos mtodos.
11.5.3.- Efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin
Con la finalidad de validar el mtodo y comparar los rendimientos de
extraccin de las muestras de vino sinttico, con las muestras de vino real y
comprobar si existe efecto matriz, se realiz un estudio adicionando a nuestras
muestras de vino real cantidades conocidas de cada uno de los compuestos a dos
niveles. Se realiz la extraccin con las condiciones optimizadas y los resultados
obtenidos se muestran en la tabla 11-8. En estos resultados estn corregidas las
cantidades de cada compuesto que contena el vino.
Si comparamos estos rendimientos con los obtenidos con muestras de vino
sinttico (tabla 11-3) vemos que son similares, por lo que deducimos que no existe
efecto matriz.
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
__________________________________________________________________
197
COMPUESTOS CONCENTRACIN (g mL
-1
)
aadida
Rendimiento
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
10.0
22.0
150
300
1.52
3.13
10.0
25.0
1.51
3.00
2.50
4.02
5.03
10.0
1.41
2.82
10.0
20.0
3.51
7.04
0.812
1.72
70.11.1
69.51.3
92.70.7
91.71.1
66.42.1
64.52.0
84.01.6
84.81.3
79.50.8
76.70.9
83.73.1
84.82.8
71.80.7
71.20.8
86.52.1
86.22.3
74.11.1
74.51.2
80.30.8
77.10.7
75.01.1
76.71.2
- Tabla 11-8: Efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin
En la figura 11-7 se muestra un cromatograma de vino sinttico obtenido por
SPE para los compuestos voltiles seleccionados.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
198
- Figura 11-7: Cromatograma. Vino sinttico, SPE
5 10 15 20 25 30 35 40
Minute
0.02
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
mVolts
A3M1B
(5.769)
3M1B
(7.793)
HE
(8.611)
1H
(12.123)
3-octanol
(13.406)
OE
(14.679)
SD (21.772)
AFE
(25.468)
AH
(26.413)
2FE
(27.921)
AO
(31.653)
AD
(38.778)
CAPTULO 12
Microextraccin en fase slida (SPME)
- Introduccin
- Procedimiento operativo
- Estudios previos
- Optimizacin de variables
- Caractersticas analticas
- Cuantificacin en muestras de vino real
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
201
12.- MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
12-1.- Introduccin
Con la finalidad de ampliar el estudio realizado hasta ahora sobre los
diferentes mtodos de extraccin, se propuso la utilizacin de un nuevo mtodo de
extraccin, que complementase los mtodos clsicos. Los ms utilizados a lo largo
de la historia, respecto a los voltiles en vino son mtodos tediosos, largos y
generalmente requieren elevados volmenes de muestra y de disolvente, lo que
puede llevar a contaminar la muestra, por ello se pens en la Microextraccin en
Fase Slida o Solid Phase Microextraction (SPME) como alternativa, ya que con
este mtodo se resolvan algunos de los problemas mencionados, como la cantidad
de muestra, el tiempo de preparacin, disolvente, etc., adems de tener las ventajas
de la simplicidad, rapidez, sensibilidad, fcil automatizacin e incluso mejora de
los lmites de deteccin.
La Microextraccin en Fase Slida, desarrollada en 1990 por Pawliszyn y
colaboradores
135
es una novedosa tcnica de extraccin, en la que se utiliza una
fase estacionaria apropiada para cada tipo de compuestos con los que se trabaje. Se
introduce como una tcnica que no necesita disolventes en la preparacin de la
muestra y sobre todo destaca la pequea cantidad de muestra que se necesita.
En esta tcnica, una pequea proporcin de fase de extraccin dispersa en un
soporte slido se expone a la muestra por un periodo de tiempo definido, pasado el
cual se produce un equilibrio entre las distintas fases. El nmero de fases que
intervienen en el equilibrio son tres: matriz o muestra, fibra y fase gas.
Equilibrio de distribucin entre las fases del sistema
Todo el analito que existe en la matriz, una vez alcanzado el equilibrio,
queda distribuido en tres fases, la fase de la muestra matriz (L), la fase de la fibra
(F) y la fase gas (G) (ver figura 12-1).
135
Pawliszyn J. et al, Anal. Chem., 62, 2145-2148, (1990)
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
202
- Figura 12-1: Equilibrio en tres fases de la fibra en muestras
lquidas
En dicho equilibrio, los compuestos voltiles iniciales presentes en la
muestra, se distribuirn en las diferentes fases siguiendo el balance de materia que
se muestra a continuacin:
C
0
V
L
= C
F
V
F
+ C
G
V
G
+ C
L
V
L
(ecuacin 1)
donde C
0
es la concentracin inicial de analito en la matriz, V
L
es el volumen de la
fase lquida, C
F
, C
G
y C
L
son las concentraciones del analito en el equilibrio en la
fibra, fase gaseosa y fase lquida respectivamente, y V
F
y V
G
son los volmenes de
la fibra y de la fase gaseosa.
En el equilibrio, la proporcin de concentraciones en las tres fases viene
descrita por las constantes de equilibrio:
K
1
= C
L
/ C
G
K
2
= C
F
/ C
L
K
3
= C
F
/ C
G
C
0
V
L
= C
G
V
G
+ C
L
V
L
+ C
F
V
F
K
1
= C
L
/C
G
K
2
= C
F
/C
L
K
3
=C
F
/C
G
G
F
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
203
donde K
1
, K
2
y K
3
son las constantes de equilibrio entre la fase lquida y la gas,
entre la fibra y la fase lquida y entre la fibra y la fase gas.
A la cantidad de analito retenido en la fibra se le denomina n
fibra
= C
F
V
F.
Si en la ecuacin 1 multiplicamos todos los miembros por C
F
V
F
/C
L
,
empleamos los valores de las constantes K
1
y K
2
y reagrupamos trminos, queda:
C
0
V
L
C
F
V
F
/C
L
= C
F
V
F
C
F
V
F
/C
L
+ C
G
V
G
C
F
V
F
/C
L
+ C
L
V
L
C
F
V
F
/C
L
La masa extrada en la fibra es proporcional a la concentracin inicial del
analito, cuando se mantienen constantes los volmenes de las fases. Adems, la
posicin de la fibra en el sistema no influye en la cantidad extrada en el equilibrio.
Estas expresiones se simplifican en dos situaciones lmites:
1.- Si V
L
es mucho mayor que K
2
x V
F
+ K
1
x V
G
esto implicara que:
n
fibra
= K
2
x V
F
x C
0
Es decir, si la suma del volumen de fase de la fibra por K
2
y el volumen de
la fase gas por K
1
es despreciable frente al V
L
, ste no influye en la cantidad de
analito extrada.
2.- Si por el contrario V
L
+ K
1
x V
G
es mucho menor que K
2
x V
F
esto
implicara que:
n
fibra
= V
L
x C
0
Es decir, cuando el volumen de la muestra ms el producto K
1
x V
G
es
despreciable frente al V
F
x K
2
, se produce extraccin exhaustiva, esto ocurre con
muestras de volumen muy pequeo y analitos con valores de K
2
muy grandes. Al
aumentar el volumen de muestra, aumenta la cantidad de analito extrada hasta
alcanzar un valor a partir del cual la cantidad extrada no depende del volumen de
muestra.
o
L G F
L F
fibra
C
V V K V K
V V K
n
+ +
=
.
1 2
2
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
204
Se han considerado numerosos soportes de fase estacionaria para SPME,
como son: fibras, tubos, discos, partculas en suspensin, etc. Las ms utilizadas
136
son las fibras y los tubos para SPME.
La SPME puede acoplarse a varios tipos de tcnicas analticas: CG
137
,
HPLC
138
y CL
139
y se aplica a una variedad amplia de compuestos
140
, tanto polares
como no polares, en muestras gaseosas, lquidas o slidas, especialmente para la
extraccin de compuestos orgnicos voltiles y semivoltiles. Sin embargo, el
instrumento ms utilizado con SPME es el cromatgrafo de gases, con el que se
utilizan fibras comerciales.
La fibra propiamente dicha es una fase estacionaria de polmeros unida a una
varilla adjunta, con una cubierta protectora. sta se inserta en una jeringa diseada
con un sistema de mbolo que le permite ser introducida y sacada, y que adems es
posible reutilizar y reemplazar. En las figuras 12-2 y 12-3 se muestran la fibra en el
soporte y su sistema de ensamblaje en el cromatgrafo de gases, respectivamente.
Hay varios tipos de fibras comerciales y su utilizacin depende del tipo de
compuesto seleccionado. La afinidad de la fibra por el analito en estudio es funcin
de la polaridad de ambos. En general, los compuestos voltiles requieren un
polmero ms denso que otros compuestos menos voltiles. Con estos polmeros
ms densos, el proceso es de adsorcin, ya que los analitos quedan en la capa
superficial del polmero. Adems, las fibras con rellenos ms densos requieren ms
tiempo para alcanzar el equilibrio de extraccin, pero tienen mayor sensibilidad. En
el caso de que el polmero sea menos denso, los analitos penetran tambin en los
poros de ste, producindose un proceso de adsorcin y absorcin
simultneamente. Por este motivo, es habitual encontrar en la bibliografa ambos
trminos.
136
Mestres M. et al, J. Chromatogr. A , 835, 137-144, (1999)
Heather L. et al, J. Chromatogr. A, 885, 153-193, (2000)
137
Castro R. J. Chromatogr. A, 953, 7-15, (2002)
Franciola S. et al, Am. J. Enol. Viticult, 54, 158-162, (2003)
Monje M.C. et al, Anal. Chim. Acta, 458, 111-117, (2002)
Lopez R et al, J. Chromatogr. A, 966, 167-177, (2002)
Demyttenaere J. et al, J. Chromatogr. A, 985, 233-246, (2003)
138
Gonzlez C., J. Chromatogr. A, 896, 373-379, (2000)
139
Eisert R., Anal. Chem., 27, 103-109, (1997)
140
Kataoka H. et al, J. Chromatogr. A, 880, 35-62, (2000)
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
205
- Figura 12-2: Fibra con soporte para SPME
- Figura 12-3: Fibra ensamblada al cromatgrafo con el
sistema de agitacin
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
206
Comercialmente, para facilitar el manejo e identificar con ms facilidad cada
una de las fibras, en funcin del polmero que contengan se les asigna un color
(figura 12-4). En ella los colores utilizados representan los colores de las fibras.
Los analitos polares son atrados por fases polares, por ejemplo poliacrilato
(blanca) o carbowax (naranja). Las fibras con mayor espesor de capa son idneas
para compuestos voltiles, incluso pueden utilizarse para menos voltiles, pero se
requieren mayores tiempos de extraccin; las ms finas, tipo polidimetilsilano
(amarilla o verde) de 7 y 30 m, son mejores para molculas grandes. Por otro
lado, las fibras porosas con revestimientos de carboxen (negra) divinilbenceno
(naranja), tambin pueden retener analitos pequeos y son ideales para analitos C
2
-
C
6
. Entre ellas tambin existen fibras con dos rellenos diferentes como se muestra
en la figura.
- Figura 12-4: Fibras comerciales y propiedades: PDMS: polidimetilsilano,
CAR: carboxen, DVB: divinilbenceno, CW: carbowax, TPR: resina templada,
PA: poliacrilato
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
207
Las fibras estn compuestas de diversas sustancias orgnicas, principalmente
polmeros, y antes de utilizarlas debemos acondicionarlas para retirar todo tipo
de contaminantes. Para ello, se introducen en el inyector el tiempo que determine el
fabricante y a la temperatura sealada por ste, de forma que se eliminen los
residuos que puedan estar adheridos a la fibra.
Sin embargo, las fibras tienen el inconveniente de ser frgiles y se rompen
fcilmente, incluso pueden estropearse o daarse con la insercin y agitacin.
Adems, compuestos de elevado peso molecular, como son las protenas, se pueden
adsorber irreversiblemente, cambiando as las propiedades de la fase estacionaria,
volvindola inutilizable. La vida media de la fibra es aproximadamente de 100
extracciones, dependiendo de la matriz y del tipo de extraccin utilizado, ya sea
por espacio de cabeza o por inyeccin directa, en la que la fibra dura para un menor
numero de extracciones.
La fase estacionaria acta de esponja concentrando los analitos orgnicos de
la matriz en su superficie durante la adsorcin y los cuales posteriormente sern
desorbidos para ser analizados (figura 12-5). La muestra se coloca en un vial, el
cual est tapado con un sptum. Cuando la jeringa de SPME perfora el sptum y la
fibra entra en el vial es cuando se establece el equilibrio entre las distintas fases
(matriz, fase gaseosa y fibra), una vez adsorbidos los analitos en la fase de la fibra,
sta se extrae y se lleva al inyector del cromatgrafo donde una vez introducida la
fibra son desorbidos los analitos.
- Figura 12-5: Proceso de adsorcin y
desorcin en la fibra.
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
208
La temperatura de desorcin es aproximadamente igual al punto de
ebullicin del compuesto menos voltil, y el tiempo de desorcin depende de la
temperatura del inyector y de la proporcin de flujo del gas portador alrededor de
la fibra. La fibra se inserta en el inyector del cromatgrafo de gases y los analitos
son volatilizados y transportados a la columna cromatogrfica.
Tal y como se ha comentado anteriormente existen dos modos principales de
emplear la fibra: espacio de cabeza (HS-SPME) e inyeccin directa (DI-SPME).
Existe otra posibilidad que consiste en la utilizacin de una membrana protectora
que recubre la fibra
141
, pero es un mtodo mucho menos utilizado.
En espacio de cabeza la fibra no entra en contacto con la disolucin (figura
12-6a), slo se expone a la fase de vapor o gaseosa de la muestra y en la inyeccin
directa, la fibra se introduce directamente en la disolucin (figura 12-6b).
(a) (b)
- Figura 12-6: SPME en (a) espacio de cabeza y (b) inyeccin directa
141
Lord H. et al, J. Chromatogr. A, 885, 153-193, (2000)
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
209
La eficacia de cada una de estas tcnicas depende de las propiedades de los
analitos y de la matriz de la muestra. En general DI-SPME es ms sensible que HS-
SPME pero para los analitos ms voltiles se utiliza HS-SPME ya que de lo
contrario, los compuestos no voltiles se concentran en la fibra y reducen su vida
media as como la reproducibilidad de la extraccin.
El campo de aplicacin de esta tcnica es muy numeroso y en distintas reas,
tal y como lo demuestra el gran nmero de publicaciones que han aparecido en los
ltimos aos como por ejemplo, medio ambiente, clnico y forense, de higiene
industrial o alimentacin. A continuacin se citarn algunos ejemplos.
En el ao 2000 Lord y Kataoka en colaboracin con Pawliszyn publicaron
dos importantes revisiones, una sobre la evolucin de la SPME en lo que a
instrumentacin
142
se refiere y otra sobre aplicaciones de esta tcnica en anlisis de
alimentos
143
.
Existen numerosos trabajos en los que se emplean matrices acuosas, como es
el caso de contaminantes en agua
144
, donde los resultados fueron muy fructferos
indicando que la SPME es una tcnica muy vlida, consiguindose valores
interesantes en los LD (hasta 0.001 g mL
-1
para algunos compuestos) tanto para
voltiles como para semivoltiles, incluidos fenoles y pesticidas.
En el caso de matrices ms complejas, una buena alternativa es la utilizacin
del espacio de cabeza con SPME. Dentro del campo de anlisis clnicos y forenses,
se han analizado muestras de sangre y orina
145
, se ha determinado etanol, acetona e
isopreno en aliento humano
146
y alcohol y drogas en fludos corporales, as, existen
numerosos estudios sobre determinacin de anfetaminas
147
, cocana, antidepresivos
tricclicos
148
, nicotina u otros anestsicos locales.
De la misma forma, se han determinado compuestos voltiles orgnicos
existentes en productos farmacuticos
149
, que estn frecuentemente contaminados
debido a procesos de fabricacin.
142
Lord H. et al, J. Chromatogr. A, 885, 153-193, (2000)
143
Kataoka H. et al, J. Chromatogr. A, 880, 35-62, (2000)
144
Wu I. et al, J. Chromatogr. A, 976, 357-367, (2002)
Gonzlez C. et al, J. Chromatogr. A, 896, 373-379, (2000)
145
Xilan C. et al, J. Chromatogr.y B, 802 , 239-245, (2004)
146
Grote C. et al, Anal Chem., 69, 587-592, (1997)
147
Nagasawa N. et al, Forensic Sci. Int., 78, 185-191, (1996)
148
Kumazawa T. et al, J. Forensic. Toxicol., 13, 25-31, (1996)
149
Urruty L. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 1519-1522, (1997)
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
210
Siguen probndose nuevas aplicaciones cada da, investigndose y
desarrollando el anlisis de protenas bsicas y de matrices ms complejas como
muestras biolgicas, o incluso simples clulas, para las que se han diseado fibras
de dimensiones muy pequeas.
Otra aplicacin que resulta de gran inters es el anlisis de alimentos y
bebidas
150
, tanto alcohlicas como no alcohlicas. Las matrices que se han
empleado son muy diferentes y, en la mayora de los casos se estudia el contenido
en compuestos responsables del aroma. As, se ha analizado queso
151
, plantas
152
,
frutas
153
, trufas blancas y negras
154
, aceite
155
o bebidas de cola
156
.
El vino
157
es una matriz en la que se han determinado numerosos analitos:
pesticidas, compuestos de azufre o nitrogenados, compuestos responsables del
aroma y sus distintas familias, etc. Sin duda, el estudio del aroma es uno de los
aspectos de mayor inters en la actualidad, por lo que existe tambin gran cantidad
de bibliografa referida a la determinacin de compuestos responsables del
mismo
158
, como alcoholes, steres, o cidos.
Una familia de compuestos que juega un importante papel dentro del aroma
del vino son los terpenos. Dentro del mundo enolgico en particular, son los nicos
compuestos integrantes del aroma de las uvas, a los que se les ha asignado un claro
papel en el aroma final de los vinos (linalol, terpineol, nerol, geraniol). De acuerdo
De la Calle Garca D. et al, J. High Resolut. Chromatogr., 19, 257-263, (1996)
Urruty L. et al, J. Agric. Food Chem., 44, 3871-3878, (1996)
Page D. et al, J. Chromatogr. A, 648, 199-204, (1993)
150
Fitzgerald G. et al, J Chromatogr. A, 896, 351-359, (2000)
151
Jaillais B. et al, Talanta, 48, 747-753, (1999)
152
Coleman W.M. et al, J. Chromatogr. Sci, 36, 401-405, (1998)
153
Ibaez E. et al, Food Chem., 63, 281-286, (1998)
154
Pelusio F. et al, J. Agric Food Chem., 43, 2138, (1995)
155
Yang X. et al, J. Agric Food Chem., 42, 1925-1932, (1994)
156
Hawthorne S et al, J. Chromatogr. A, 603, 185-191, (1992)
157
Rodrguez J.J. et al, J. Chromatogr. A, 991, 13-22, (2003)
Mestres M. et al, J. Chromatogr. A, 945, 211-219, (2002)
Rodrguez J.J. et al, J.Chromatogr. A, 963, 213-223, (2000)
Vas G. et al, Am. J. Enol. Viticult, 49, 100-104, (1998)
Boyd-Boland A. et al, J. Chromatogr. A, 704, 163,(1995)
158
Demyttenaere J. et al, J. Chromatogr. A, 985, 233-246, (2003)
Mejas R. et al, J.Chromatogr. A, 953, 7-15, (2002)
Matisova E. et al, J. Chromatogr. A, 960, 159-164, (2002)
Pino J. et al, J. Chromatogr A, 954, 51-57, (2002)
Holt R.U., et al, J. Chromatogr. A, 937, 107-114, (2000)
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
211
con el trabajo de Rapp
159
, los terpenos tienen la caracterstica de no cambiar su
estructura durante el proceso de fermentacin.
De la pequea parte que se conoce sobre el aroma final del vino, los
terpenos, constituyen, de momento, los nicos compuestos a los que se les asigna
un valor claramente varietal, es decir, son los compuestos a los que cabe atribuir
una parte importante de la diferenciacin de los aromas de los vinos que proceden
de distintas variedades de uvas. Seguramente, no sern los nicos, ya que cada vez
van apareciendo ms compuestos sintetizados en la uva, por diferentes rutas
metablicas, bien diferenciadas de las terpnicas.
Desde Austerweil en 1946
160
hasta los trabajos de Ribereau-Gayon en
1975
161
las investigaciones iban dirigidas al estudio del aroma libre, es decir de los
compuestos responsables del aroma directamente, ignorando la existencia de
compuestos ligados a ciertas molculas no voltiles, y por tanto no odorgenos.
Compuestos como el linalol, terpineol, nerol, geraniol y los xidos de
algunos de ellos, estn presentes en numerosos estudios, sin embargo no se
detectan ni limoneno, ni mirceno, ni citroneol, ni farnisol, entre otros; incluso hay
compuestos, cuyas frmulas estn sin identificar, con propiedades muy similares a
las del linalol. Se llega a afirmar, que hay determinadas variedades que no poseen
terpenos, en contra de algunos estudios anteriores
162
.
Posteriores estudios corroboraron la validez de estos datos. En 1978
Wagner
163
, demostr estadsticamente la relacin entre el contenido en linalol y
geraniol de una cepa y su carcter de moscatel. Tambin cada vez van apareciendo
ms compuestos en forma de terpenos oxidados, confirmndose la hiptesis de que
eran muchos los compuestos que simultneamente formaban el aroma del vino en
las variedades tipo moscatel. As, en 1981, Williams identifica 22 terpenos en uvas
moscatel
164
y Etievant en 1983 ms de 30, incluyendo una valoracin de su
contribucin al aroma
165
.
159
Rapp A., Wine Analysis, (1988)
160
Austerweil G., Ind. Parfum, (1946)
161
Ribereau-Gayon et al, J. Agric. Food Chem., 23, 1042-1047, (1975)
162
Stevens K.L. et al, J. Agric. Food Chem., 17, 1102-1106, (1969)
Stevens K.L et al, J. Agric. Food Chem., 15, 378-381, (1967)
163
Wagner R. et al, Gen. Am. Vigne, 429-434, (1978)
164
Williams P.J. et al, Am. J. Enol. Vitic., 32, 230-235, (1981)
165
Etivant P.X, et al, J. Sci. Food Agric., 34, 393-493, (1983)
Etivant P.X. et al, J. Sci. Food Agric., 34, 497-504, (1983)
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
212
As como en un principio los estudios iban dirigidos a las variedades de
moscatel, en la ltima dcada los estudios se han ampliado y han abierto
horizontes, dirigidos a la explotacin tecnolgica de los precursores aromticos,
para la produccin de vinos y de otros productos con aromas varietales marcados y
diferentes a los hasta ahora producidos.
Dada la importancia demostrada de estos compuestos en el aroma final del
vino, se ha considerado oportuno incluir en nuestro estudio
166
algunos terpenos en
la mezcla de voltiles que se vena utilizando hasta ahora. As, los compuestos
utilizados fueron:
- o-Terpineol (T)
- 3-Metil-1-butanol (3M1B)
- 1-Hexanol (1H)
- 1-Pentanol (1P)
- 2-Feniletanol (2FE)
- Acetato de 2-feniletilo (AFE)
- Acetato de-3-metil-1-butilo (A3M1B)
- cido octanico (AO)
- Geraniol (G)
- Hexanoato de etilo (HE)
- Linalol (L)
- Succinato de dietilo (SD)
12.2.- Procedimiento operativo
El procedimiento utilizado es muy sencillo, la muestra no precisa
preparacin ni se emplean disolventes para su extraccin, es por ello que se
considera como una alternativa atractiva para estudiar los compuestos voltiles en
vino. Adems, es una tcnica con la que se obtienen valores muy buenos en los
factores de preconcentracin.
El procedimiento de extraccin (realizado por triplicado) se indica a
continuacin:
A 10.0 mL de vino sinttico o real se aadi 0.1 g de NaCl y 0.1 g de (NH
4
)
2
SO
4,
para favorecer el paso de los voltiles a la fase gas. Se tomaron tres alcuotas de
0.80 mL que se colocaron en tres viales capsulados, para realizar una sola
inyeccin en cada vial. Como en casos anteriores, se emple 3-octanol como
patrn interno
166
Cabredo S. et al, Chromatographia, en prensa
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
213
El proceso de adsorcin se hizo en espacio de cabeza y con agitacin durante 10
minutos, pasados los cuales la fibra (Carbowax-divinilbenceno o fibra color
naranja) se somete al proceso de desorcin de 2 minutos en el cromatgrafo de
gases.
Las condiciones cromatogrficas utilizadas son las que se muestran en el
captulo 4, apartado 4.4.5.
12.3.- Estudios previos
Antes de pasar a la optimizacin de los parmetros que influyen en la
extraccin se realizaron unos estudios preliminares con la finalidad de tener un
conocimiento previo del sistema.
Para evaluar y comparar los resultados obtenidos en diferentes condiciones,
se calcularon factores de preconcentracin. sta es una variable que no suele
utilizarse pero en este caso lo consideramos ms apropiado al concentrarse el
analito en la fibra. Para ello se calcularon, como en casos anteriores, los valores de
las K preparando una disolucin en diclorometano con todos los compuestos
voltiles en estudio que fue inyectada en el cromatgrafo. Por otro lado se
prepararon disoluciones de vino sinttico a concentraciones conocidas (c
1
), una vez
sometidas al mtodo de extraccin las concentraciones obtenidas (c
2
) se calcularon
con los valores de las K mencionados. Se considera factor de preconcentracin
a la relacin c
2
/c
1.
En nuestro caso, los estudios previos a la optimizacin se centraron en el
tipo de extraccin, relacin de split, tiempo de adsorcin, tipo de fibra y nmero de
viales en el cromatgrafo para cada muestra.
- Respecto al tipo de extraccin, los mtodos ms utilizados, como ya se ha
mencionado son la inyeccin directa (DI-SPME) y el espacio de cabeza (HS-
SPME). Ambos casos fueron comparados calculando el factor de
preconcentracin para cada uno de los compuestos voltiles. Para ello
preparamos una disolucin de vino sinttico con todos los compuestos en
estudio ms el patrn interno a concentracin conocida, la cual fue sometida a
ambos tipos de extraccin, tanto HS-SPME como DI-SPME utilizando las
condiciones cromatogrficas que se indican en el apartado 4.4.5. Los resultados
de estas determinaciones se muestran en la tabla 12-1. Puede verse que son
resultados similares, por ello la opcin elegida es la de espacio de cabeza. La
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
214
bibliografa
167
consultada ya muestra que generalmente se utiliza HS-SPME, ya
que adems de prolongar la vida de la fibra, en la DI-SPME la fibra debe
limpiarse con agua antes de cada extraccin y equilibrarla en el inyector del
cromatgrafo de gases.
COMPUESTOS FACTORES DE PRECONCENTRACIN
DI-SPME HS-SPME
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
0.6110.051
2.390.11
5.400.17
4.360.14
2.390.23
3.950.29
1.800.03
2.940.20
4.200.28
9.860.63
3.230.13
15.50.7
0.5900.041
2.410.12
5.230.15
4.660.23
2.760.30
4.420.03
1.820.03
2.830.19
3.810.26
7.180.60
3.140.11
17.70.8
- Tabla 12-1: Factores de preconcentracin con SPME en inyeccin directa y en
espacio de cabeza
- En segundo lugar se estudi la posibilidad de inyeccin en split o splitless. Se
eligi la opcin del split, ya que en splitless la seal del etanol era
excesivamente grande. La relacin de split se optimiz posteriormente en el
diseo de Plackett-Burman, utilizando un rango determinado por la experiencia
del grupo de trabajo en este tema, junto con los datos obtenidos de la
bibliografa.
- Respecto al tiempo de extraccin (o tiempo de adsorcin), en la bibliografa
estudiada se observa que el rango es muy amplio (de 5 minutos a 4 horas).
Nuestros experimentos nos demostraron que tiempos por encima de los 10
167
Castro M. et al, J. Cromatogr. A, 995, 11-20, (2003)
Rodrguez J.J. et al, J. Cromatogr. A, 991, 13-22, (2003)
Mestres M. et al, J. Cromatogr. A, 945, 211-219, (2002)
Whiton R.S. et al, Am. J. Enol. Viticult, 51, 379-382, (2000)
De la Calle D. et al, J. High Resolt. Chromatogr., 21, 373-377, (1998)
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
215
minutos no mejoraban los factores de preconcentracin e incluso puede llegar a
descontrolarse el equilibrio con el tiempo y empobrecer la precisin en las
medidas.
- Otro de los parmetros estudiados fue el nmero de viales a utilizar para cada
una de las muestras (nmero de inyecciones por vial). Para ello se prepararon,
por un lado, tres viales diferentes con 0.80 mL de muestra en cada uno de ellos,
los cuales fueron sometidos a SPME. Por otro lado se prepar otro vial con
otros 0.80 mL de muestra en el cul se introdujo la fibra tres veces
consecutivas. Se observ en este estudio que la seal decreca en los
progresivos pinchazos realizados en el mismo vial.
Un ejemplo de los factores de preconcentracin obtenidos puede verse en la
tabla 12-2 y su representacin grfica en la figura 12-7. En el segundo
pinchazo pueden observarse prdidas de entre el 8 y 69%, y en el tercero entre
60 y 92%. Incluso en alguno de los casos la prdida de la seal fue total (para
el acetato de 3-metil-1-butilo). Este parmetro fue optimizado, incluyndolo
en el diseo realizado posteriormente para aclarar esta influencia en la
utilizacin de un solo vial o ms.
COMPUESTOS N inyeccin
1 2 3
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
0.5910.040
2.410.12
5.230.15
4.660.23
2.760.30
4.420.03
1.820.03
2.830.19
3.810.26
7.180.60
3.240.11
17.70.8
0.5000.062
2.110.20
4.760.23
2.660.26
2.520.32
3.270.05
0.8350.042
1.970.21
2.530.28
5.630.71
1.280.18
5.420.79
nd
0.5160.210
0.6310.220
1.320.28
0.5570.363
1.220.11
0.7170.060
0.7910.231
0.6230.311
0.3820.721
0.6340.222
1.320.82
- Tabla 12-2: Factores de preconcentracin para tres inyecciones sucesivas diferentes
en el mismo vial en SPME
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
216
- Figura 12-7: Representacin grfica de los factores de preconcentracin para tres
inyecciones sucesivas diferentes en el mismo vial en SPME
- Para la clase de fibra a utilizar, el estudio se hizo con cuatro de ellas: roja
(polidimetilsiloxano, 100 m), naranja (carbowax-divinilbenceno, 65 m)
blanca (poliacrilato, 85 m) y verde (polidimetilsiloxano, 7 m). Esta
preseleccin se hizo atendiendo a las caractersticas tanto de polaridad de los
analitos como de volatilidad y tamaos o pesos moleculares de stos.
Una vez realizados unos estudios previos con las cuatro fibras, observamos
que las que mejor respondan a los compuestos en estudio eran las fibras roja y
naranja, por ello, la optimizacin fue realizada usando ambas.
Inyeccin
3 2 1
20
10
0
A3M 1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
F
a
c
t
o
r
d
e
P
r
e
c
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
217
La bibliografa recomienda la roja, sin embargo los ensayos previos que
realizamos nos mostraron que para nuestros compuestos y condiciones, los
mejores resultados los obtenamos con la fibra naranja como puede verse en
las figuras 12-8 y 12-9 donde a la misma concentracin los picos de la
mayora de los compuestos son muchos ms altos, lo que nos demuestra que la
retencin en la fase estacionaria de la fibra naranja ha sido mayor.
- Figura 12-8: Cromatograma. Fibra roja, SPME
10 15 20 25 30
Minutos
-0.9
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
mVolts
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
3O
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
218
- Figura 12-9: Cromatograma. Fibra naranja, SPME
12.4.- Optimizacin de variables
Una vez realizados los estudios preliminares, el siguiente paso fue la
optimizacin de los parmetros que afectan a la extraccin y separacin de
compuestos mediante SPME. Las variables optimizadas fueron:
- tiempo de adsorcin
- tiempo de desorcin
- split
- agitacin o no de la muestra
- tipo de fibra
- adicin, o no, y tipo de sales
- utilizacin de un vial y pinchar tres veces usar tres viales diferentes
en las rplicas
5 10 15 20 25 30
Minutos
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
mVolts
A3M1B
3M1B HE
1P
1H
30
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
219
Para la optimizacin de las variables consideradas relevantes, se comenz
haciendo un diseo de Plackett-Burman (PB) que nos ayudase a ver que variables
eran ms o menos significativas y como influan en el sistema. En este diseo, se
consideran dos niveles para cada factor, +1 (valor ms alto de la variable) y 1
(valor ms bajo) cuyos valores se indican en la tabla 12-3. Estos valores fueron
elegidos segn los resultados de los estudios preliminares. Para las sales, se ha
considerado como valor mximo 1 g por cada 100 mL, dndole el valor de -1
cuando no se aade la sal.
VARIABLES Niveles +1 -1
Tiempo de adsorcin (min)
Tiempo de desorcin (min)
Relacin de split
Agitacin
Tipo de fibra
Nmero deviales
NaCl
Na
2
SO
4
K
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4
NaH
2
PO
4
10
5
15
SI
ROJA
3
SI
SI
SI
SI
SI
5
2
5
NO
NARANJA
1
NO
NO
NO
NO
NO
- Tabla 12-3: Valores de las variables en el diseo Plackett-Burman en SPME
Los experimentos se hicieron por triplicado, las variables fueron 11 (4n-1
donde n=3), el nmero de experimentos son 4n, y como se hace por triplicado los
experimentos son 36.
Se utiliz Statgraphics para la realizacin de la matriz experimental que
aparece en la tabla 12-4, haciendo tres rplicas y aleatorizando todos los
experimentos. La variable respuesta fue el rea del pico cromatogrfico de cada
compuesto.
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
220
EXPERIMENTOS VARIABLES
x
1
x
2
x
3
x
4
x
5
x
6
x
7
x
8
x
9
x
10
x
11
1 - - - + + + - + + - -
2 - - - - - - - - - - -
3 + + - + - - - + + + -
4 + - + + - + - - - + +
5 + - - - + + + - + + -
6 + + - + + - + - - - +
7 - + - - - + + + - + +
8 - - + + + - + + - + -
9 + - + - - - + + + - +
10 + + + - + + - + - - -
11 - + + - + - - - + + +
12 - + + + - + + - + - -
13 - - - + + + - + + - -
14 - - - - - - - - - - -
15 + + - + - - - + + + -
16 + - + + - + - - - + +
17 + - - - + + + - + + -
18 + + - + + - + - - - +
19 - + - - - + + + - + +
20 - - + + + - + + - + -
21 + - + - - - + + + - +
22 + + + - + + - + - - -
23 - + + - + - - - + + +
24 - + + + - + + - + - -
25 - - - + + + - + + - -
26 - - - - - - - - - - -
27 + + - + - - - + + + -
28 + - + + - + - - - + +
29 + - - - + + + - + + -
30 + + - + + - + - - - +
31 - + - - - + + + - + +
32 - - + + + - + + - + -
33 + - + - - - + + + - +
34 + + + - + + - + - - -
35 - + + - + - - - + + +
36 - + + + - + + - + - -
- Tabla 12-4: Matriz experimental con el diseo de Plackett-Burman en SPME:
x
1 =
tiempo de adsorcin
,
x
2
= tiempo de desorcin
,
x
3
=relacin de split, x
4
=agitacin,
x
5
=tipo de fibra, x
6
=NaCl, x
7
= Na
2
SO
4
, x
8 =
nmero de viales/ muestra
,
x
9
= K
2
SO
4,
x
10
=(NH
4
)
2
SO
4
, x
11
=NaH
2
PO
4
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
221
Los resultados obtenidos del diseo de PB se muestran en la tabla 12-5, en la
que, adems de la significacin de las variables, se muestran los pesos de cada una
de ellas, donde para cada compuesto los nmeros indican la importancia que tiene
las distintas variables, siendo el 1 el de mayor peso hasta 11 que es el de menor, ya
sea con valor positivo o negativo.
A3M1B 3M1B EH 1P 1H L SD T FEA G 2FE AO
S S S S S S S S S S S S Tiempo de
adsorcin -8 +2 -9 -7 +2 +2 +2 +2 +2 +2 +2 +2
S S S S S S S NS S S S S Tiempo de
desorcin +4 -5 -8 +3 -4 -10 -5 -4 -6 -4 -5
S S S S S S S S S S S S Relacin de
split -10 +3 -6 -9 +3 +3 +3 +3 +3 +3 +3 +3
NS S S NS S S S S S S S S Agitacin
+6 +2 +6 +6 +6 +4 +5 +4 +6 +6
S S S S S S S S S S S S Tipo de fibra
-1 -1 +1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
S S S S S S S S S S S S Nmero de
viales -5 +4 +3 -6 +5 +4 +4 +7 +6 +5 +5 +4
S S S NS S S S S S S S S NaCl
-9 +8 -5 +8 +9 +8 +6 +7 +8 +8 +8
S S S S S S S S NS NS NS S Na
2
SO
4
-6 -11 -10 -8 -11 +8 -10 +8 -11
S S NS S S S NS NS NS NS S S K
2
SO
4
-2 -9 -2 -9 +5 -9 -9
S S S S S S S S S S S S (NH
4
)
2
SO
4
+7 +10 -7 +5 +10 +11 +9 +5 +8 +9 +10 +10
S S S S S S S NS NS S NS S NaH
2
PO
4
+3 -7 -4 +4 -7 +7 +7 -7 +7
- Tabla 12-5: Pesos de las variables en el diseo de Plackett-Burman en SPME
Con los resultados obtenidos se hizo una representacin de cada variable
frente a los pesos con la finalidad de facilitar la observacin de las variables ms
relevantes (figura 12-10).
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
222
- Figura 12-10: Resultados Plackett-Burman: 1= tipo de fibra, 2= tiempo adsorcin,
3= relacin de split, 4= nmero de viales, 5= agitacin, 6= tiempo de desorcin,
7= NaCl, 8=(NH
4
)
2
SO
4,
9= K
2
SO
4,
10= Na
2
SO
4
, 11= NaH
2
PO
4
A la vista de los resultados, observamos que las variables ms influyentes
son la fibra y el tiempo de adsorcin, le siguen en importancia la relacin de split y
la utilizacin de un vial distinto para rplicas de la misma muestra en vez de
pinchar varias veces un mismo vial. Tambin se consideran relevantes la agitacin
de la muestra y el tiempo de desorcin. Con respecto a la utilizacin de sales
parece interesante utilizar NaCl y (NH
4
)
2
SO
4
, ya que son las que ms peso tienen y
con carcter positivo, el Na
2
SO
4
y NaH
2
PO
4
no se usan aunque el resultado fue
positivo ya que son las dos variables con pesos ms bajos. Por ltimo, el K
2
SO
4
muestra un peso negativo, lo que implica que es mejor al nivel ms bajo, o sea, no
utilizarla (ver tabla 12-3).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Peso
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
223
En la siguiente tabla se indican las condiciones cromatogrficas y las variables
optimizadas que se han utilizado en los estudios por SPME.
PARMETROS CONDICIONES
Tipo de fibra
Tiempo de adsorcin
N de Viales/ muestra
Tiempo de desorcin
NaCl
(NH
4
)
2
SO
4
Volumen de muestra/ vial
Tipo de extraccin
Temperatura del detector
Columna
Temperatura del inyector
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de split
Programa de temperatura
Carbowax-divinilbenceno o naranja
10 min con agitacin
3
2 min
1% (m/v)
1% (m/v)
0.80 mL
HS-SPME
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (0.9 mL min
-1
)
Helio (30 mL min
-1
)
400 mL min
-1
30 mL min
-1
0.15:1
4 C min
-1
60 C 170 C
4 min 12 min
- Tabla 12-6: Condiciones ptimas en SPME
12.5.- Caractersticas analticas
Se procedi a hacer las rectas de calibrado con esta metodologa de trabajo
para cada uno de los compuestos a analizar. Para ello se prepararon diferentes
disoluciones de vino sinttico de los compuestos ms el p.i. a concentraciones entre
0.100 y 750 mg L
-1
y se sometieron al mismo proceso de extraccin en las
condiciones optimizadas en HS-SPME. En la tabla 12-7 se muestran los valores de
pendiente, lmite de deteccin y lmite de cuantificacin.
Para el estudio de la reproducibilidad o precisin del mtodo expresado
como s
r
(%) (desviacin estndar relativa porcentual) se realizaron tres
extracciones de una disolucin en las condiciones optimizadas y se inyectaron por
triplicado en el cromatgrafo de gases, los resultados se muestran en la tabla 12-7.
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
224
COMPUESTOS
Pendiente
(mL g
-1
)
1
o.o.
(intervalo de
confianza de 95%)
2
L.D.
(g mL
-1
)
3
L.C.
(g mL
-1
)
4
s
r
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
0.4870.023
0.5830.018
1.900.18
0.4060.029
0.5030.016
0.9620.056
0.6030.014
0.8020.042
0.8580.045
0.2790.020
0.9780.101
0.6830.015
0.02800.0011
0.02800.0016
0.4180.019
0.05300.0035
0.02000.0012
0.1260.064
0.01900.0014
0.06700.0029
0.1210.040
0.08800.0232
0.2830.025
0.02100.0013
0.00300
0.00260
0.00800
0.00370
0.00320
0.00160
0.00250
0.00190
0.00180
0.00540
0.00150
0.00220
0.00990
0.00858
0.0264
0.0122
0.0105
0.00528
0.00825
0.00627
0.00594
0.0178
0.00495
0.00726
5.1
5.7
4.8
1.8
4.1
1.1
4.4
5.3
5.1
2.4
3.5
3.1
-
Tabla 12-7: Caractersticas analticas HS-SPME
1
o.o.= Ordenada en el origen
2
L.D.= Lmite de deteccin
3
L.C.= Lmite de cuantificacin
4
s
r
(%) = Desviacin estndar relativa porcentual
12.6.- Cuantificacin en muestras de vino real
Una vez optimizado el procedimiento de SPME se aplic a muestras de vino
de la DOCa Rioja. Se utilizaron cinco muestras de diferentes vinos tintos jvenes a
los que se les aadi el patrn interno antes de la extraccin. Se analizaron por
triplicado siguiendo el procedimiento optimizado. La cuantificacin se realiz por
interpolacin en las rectas de calibrado. En esta parte del trabajo se trabaja con un
pequeo grupo de muestras diferentes de vino, pero este estudio ser ampliado
posteriormente en la segunda parte de esta memoria ya que fue el mtodo
seleccionado para la aplicacin quimiomtrica.
Interpolando los valores de rea de pico obtenidos, a partir de los
correspondientes cromatogramas, en las rectas de calibrado, se obtuvieron los
resultados de la tabla 12-8.
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
__________________________________________________________________
225
Comp.
CONCENTRACIONES (g mL
-1
)
muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4 muestra 5
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
12.50.3
48.20.3
2.700.10
0.02020.0006
2.770.10
nd
0.3010.010
nd
3.700.12
nd
4.100.19
0.3000.002
10.50.2
46.20.4
2.400.32
0.01830.0002
2.650.09
nd
0.2810.078
nd
2.800.09
nd
3.900.20
0.2920.003
13.20.1
39.60.6
1.900.25
0.01040.0032
3.170.14
nd
0.3020.054
nd
3.600.13
nd
4.000.15
0.3010.006
12.70.1
48.90.1
2.300.16
0.01910.0058
2.970.11
nd
0.3100.021
nd
3.500.11
nd
4.300.25
0.2010.004
10.6 0.4
37.2 0.4
2.80 0.18
0.0232 0.0004
2.87 0.22
nd
0.292 0.063
nd
3.50 0.07
nd
3.70 0.29
0.202 0.010
- Tabla 12-8: Cuantificacin en vino real mediante SPME. Rectas de calibrado
(nd: no detectado)
Finalmente en la figura 12-11 se muestra el cromatograma obtenido por
SPME para vino sinttico, utilizando las condiciones ptimas.
5 10 15 20 25 30 35
Minutos
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
mVolts
A3M1B (5.710)
3M1B (7.827)
HE (8.598)
1P (9.044)
1H (12.159)
3O (13.432)
L (18.136)
SD (21.806)
T (22.304)
AFE (25.503)
G (26.330)
2FE (27.957)
AO (31.690)
- Figura 12-11: Cromatograma. Vino sinttico, SPME
CAPTULO 13
Estudio comparativo de los distintos
mtodos de extraccin empleados
ESTUDIO COMPARATIVO
__________________________________________________________________
229
13.- ESTUDIO COMPARATIVO DE LOS DISTINTOS
MTODOS DE EXTRACCIN EMPLEADOS
Una vez expuestos todos los mtodos de extraccin empleados a lo largo de
la memoria, parece adecuado llevar a cabo un estudio comparativo de los mismos.
Tal y como aparece reflejado en la bibliografa
168
, cada una de las tcnicas presenta
ventajas e inconvenientes, e incluso en ocasiones es necesario combinar diferentes
mtodos para la completa extraccin de los compuestos voltiles del vino. A la
hora de seleccionar uno u otro procedimiento, habr que tener en cuenta el tipo de
muestra, el tipo de analito y sobre todo, el material disponible.
Para poder comparar la eficacia de la extraccin se ha calculado, en cada
caso, el factor de preconcentracin. Este parmetro es el que se ha utilizado a lo
largo del captulo de SPME, y viene dado por c
2
/c
1
, donde c
2
es la concentracin de
analito en el extracto y c
1
la concentracin inicial en el vino sinttico.
El estudio comparativo de las distintas metodologas se va a hacer en
funcin de los valores de factores de preconcentracin y en funcin tambin de
ventajas e inconvenientes operacionales (coste, rapidez, comodidad, limpieza, etc.).
En cuanto a reproducibilidad, todas las tcnicas muestran valores de
desviacin estndar relativa porcentual similares, por lo que no destaca una sobre
el resto.
En la tabla 13-1 se muestran los factores de preconcentracin en las distintas
tcnicas empleadas. En algunos casos no hay datos porque no todos los compuestos
se han utilizado en todos los mtodos de extraccin estudiados.
168
Ortega M., et al, Anal. Chim. Acta, 458, 85-93, (2002)
Zhou, Y. et al, J. Agric. Food Chem., 44-3, 818-822, (1996)
Leahy M.M. et al, Analysis of volatiles, (1984)
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
230
COMPUESTOS ELLd ELLc ELLus Microextr. SPE SPME
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
AB
DE
SD
T
AFE
G
AH
2FE
AO
AD
1.4
2.0
1.3
-
1.8
1.4
-
-
-
2.1
-
1.8
-
2.1
2.1
1.3
2.1
2.5
1.5
2.2
-
2.1
2.6
-
-
-
2.3
-
1.8
-
1.2
2.0
2.0
2.1
0.96
1.4
0.51
1.1
0.97
1.0
1.1
-
-
0.70
2.0
1.0
-
1.2
0.81
0.23
0.59
3.8
2.7
3.5
-
3.0
3.9
-
2.1
3.1
3.1
-
3.4
-
2.2
-
3.1
2.7
1.4
1.8
1.3
-
1.7
1.6
-
-
-
1.7
-
1.5
-
1.7
1.5
1.6
1.5
0.59
2.4
5.2
4.7
2.8
-
4.4
-
-
1.8
2.8
3.8
7.2
-
3.2
18
-
x Tabla 13-1: Factores de preconcentracin de las diferentes tcnicas estudiadas
Como se puede observar, en general, los valores ms altos de preconcentra-
cin se dan en el caso de microextraccin con sales y en SPME. En el primer caso
parece lgico que los valores sean elevados ya que se emplea un bajo volumen de
disolvente orgnico.
As, si se tuviese que hacer la seleccin de una de las tcnicas, basndonos
nica y exclusivamente en estos valores de preconcentracin, habra que elegir
microextraccin con sales o SPME, en funcin de los analitos concretos a
determinar.
Como ya se ha comentado, vamos a hacer tambin una comparacin en
funcin de ventajas e inconvenientes operacionales, que en muchos casos van a ser
cuestiones decisivas. As, en la tabla 13-2 aparecen reflejados aspectos como
rapidez, comodidad, coste, consumo de disolventes, etc.
Como se puede apreciar, el nmero de ventajas es mayor en SPME, y por
otro lado, es la extraccin lquido-lquido en continuo la que presenta mayor
nmero de inconvenientes.
ESTUDIO COMPARATIVO
__________________________________________________________________
231
MTODO VENTAJAS INCONVENIENTES
ELLd x Material convencional x Posible prdida de voltiles
x Largo y tedioso
ELLc x Material especfico
x Elevado consumo dtes. org.
x Posible prdida de voltiles
x Largo y tedioso
ELL us x Material convencional x Posible prdida de voltiles
x Largo y tedioso
MICROEX. por
desmezcla
x Material convencional
x Escaso consumo
disolventes orgnicos
x Posible prdida de voltiles
x Largo y tedioso
SPE x Rapidez
x Posibilidad de
automatizacin
x Poca manipulacin de
muestra
x Material especfico
x Posible prdida de voltiles
SPME (HS) x Rapidez
x Comodidad
x Automatizacin
x Sin manipulacin de
muestra
x Sin disolventes
orgnicos
x No contaminacin
medioambiental
x Material especfico
x Elevada inversin inicial
x Tabla 13-2: Ventajas e inconvenientes de los mtodos de extraccin utilizados
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
232
Un aspecto muy importante a tener en cuenta hoy en da es el consumo de
disolventes orgnicos, ya que su uso conlleva problemas medioambientales y
problemas de gestin de residuos. En este sentido, la tcnica ms adecuada es la
SPME, ya que evita por completo la utilizacin de disolventes.
Por otro lado, otro punto a valorar es la comodidad en la realizacin del
anlisis y es indiscutible que la SPME es la mejor en este sentido.
Una vez vistos los factores de preconcentracin y las ventajas e
inconvenientes de las distintas tcnicas, el procedimiento seleccionado como
ptimo es la microextraccin en fase slida (SPME).
PARTE II- APLICACIN QUIMIOMTRICA
Una vez optimizados diferentes procedimientos de extraccin para
compuestos voltiles desde muestras de vino y se seleccion el ms adecuado
desde nuestro punto de vista, se pas al anlisis de muestras de vino para proceder
a su clasificacin mediante diversas tcnicas quimiomtricas.
No se trata de reconstruir el aroma de un vino, sino de que a partir de
ciertas variables podamos construir un modelo que lo caracterice. La
caracterizacin de alimentos va dirigida a proteger al consumidor y ayudar a la
administracin para evitar todo tipo de fraudes comerciales. As se intenta
tipificar vinos, basndonos en distintos compuestos que participan en sus
caractersticas organolpticas.
De todos es sabido que la instrumentacin analtica moderna proporciona
gran cantidad de datos en poco tiempo, pero obtener datos no es sinnimo de
poseer informacin, debemos interpretarlos y colocarlos en el contexto adecuado
para convertirlos en informacin til, y es la quimiometra la disciplina que tiene
esta finalidad.
En esta parte de la memoria se utilizan distintas tcnicas de clasificacin:
Anlisis de Componentes Principales (ACP), Anlisis Lineal Discriminante (ALD)
y Anlisis Cluster (AC).
CAPTULO 14
Introduccin
INTRODUCCIN APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
239
14.- INTRODUCCIN
El trmino quimiometra fue introducido en 1972 por el sueco Svante Wold
y el americano Bruce R. Kowalski. El desarrollo de la quimiometra fue tardo
como consecuencia de la lenta evolucin de la instrumentacin cientfica. En la
primera mitad del siglo XX era costoso y difcil obtener, tratar y almacenar datos
qumico-analticos. Se dispona de pocos datos, y su examen directo permita al
analista extraer toda la informacin significativa. Pero esta situacin comenz a
cambiar hacia 1960, debido al fuerte impulso que experiment el desarrollo de
nueva instrumentacin.
En la dcada 1960-1970 se comenzaba a tratar datos con algoritmos
matemticos, pero eran procesos lentos y complicados.
Haca 1975 aparecieron las calculadoras electrnicas, lo que supuso un gran
avance en el tratamiento de los datos. El impulso de la quimiometra como
disciplina independiente fue debido a la popularizacin del microordenador y su
incorporacin a los instrumentos cientficos, a mediados de la dcada 1980-1990.
Muchas tcnicas quimiomtricas se encuentran incorporadas al software de la
instrumentacin analtica.
Como ya sabemos, la instrumentacin analtica moderna permite obtener en
un tiempo muy corto mucha informacin dando lugar a tablas de datos en funcin
de dos o ms variables (seales multivariantes).
A travs de la quimiometra se pueden evaluar e interpretar esos datos. Se
pueden utilizar para realizar pruebas de significacin o para clasificarlos.
Si queremos clasificarlos, al conjunto de medidas que se utilizan para
caracterizar una muestra se denomina pauta.
Dentro de las tcnicas de reconocimiento de pautas existen los siguientes
modelos:
A) No supervisados, se utilizan para decir si un conjunto de pautas
(variables) se pueden dividir en grupos, aqu no se espera ningn
conocimiento a priori de las clases o grupos. Dentro de las tcnicas no
supervisadas est el anlisis cluster.
B) Mtodos supervisados, en ellos se conocen las clases en que puede caer
una muestra, y el objetivo es clasificar una muestra de clase desconocida
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
240
por su pauta. Dentro de estos mtodos estn el anlisis discriminante
[lineal (LDA) y cuadrtico (QDA)], mtodo del K del vecino ms
prximo (KNN), SIMCA o las redes neuronales artificiales (ANN).
Actualmente, la quimiometra se utiliza diariamente en el mbito del
laboratorio, tanto en investigacin como en el control analtico de calidad. Adems,
es evidente que los conocimientos de estadstica son de aplicacin comn en un
amplio campo de disciplinas, abarcando numerosas actividades cientficas y
humanas en general.
A continuacin se comentan la distintas tcnicas quimiomtricas que van a
utilizarse en esta parte de la memoria:
- Anlisis de Componentes Principales (ACP)
- Anlisis Lineal Discriminante (ALD)
- Anlisis Cluster
Anlisis de Componentes Principales (ACP)
El Anlisis de Componentes Principales es una tcnica multivariante
encuadrada dentro del grupo de tcnicas de simplificacin o reduccin de la
dimensin. Este anlisis permite transformar un grupo inicial de variables
correlacionadas en otro de variables ortogonales denominadas Componentes
Principales (CP), de modo que se reduce el nmero de datos cuando est presente
la correlacin. Es obvio afirmar que no es una tcnica til cuando las variables no
estn correlacionadas.
La idea que se encuentra detrs del ACP es encontrar componentes
principales que sean combinaciones lineales de las variables originales que
describe cada muestra. Las componentes principales se eligen de modo que la
primera componente principal recoge la mayor parte de la variacin que hay en el
conjunto de datos, la segunda recoge la siguiente mayor parte de la variacin y as
sucesivamente. Por consiguiente, cuando hay correlacin significativa el nmero
de CP tiles ser mucho menor que el nmero de variables originales.
Las primeras CP recogen la mayor parte de la variacin en el conjunto de
datos. Como resultado, los datos se pueden representar en dos dimensiones en lugar
de en las totales de origen.
INTRODUCCIN APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
241
En trminos matemticos las CP son los autovectores o vectores propios de
la matriz de correlacin y la tcnica para encontrar estos autovectores se llama
anlisis propio. A cada componente principal (es decir, a cada autovector) le
corresponde un autovalor que proporciona la cantidad de varianza en el conjunto de
datos que se encuentra explicada por esa componente principal
169.
Anlisis Lineal Discriminante (ALD)
El Anlisis Lineal Discriminante es una tcnica multivariante que trata de
clasificar a individuos en grupos previamente determinados. Los objetivos
concretos que pretenden cubrirse con este anlisis son dos, el primero de ellos es
determinar a partir de la informacin inicial sobre una serie de individuos, de los
cuales se conoce el grupo o poblacin al que pertenecen, si los individuos estn
suficientemente definidos en funcin de las variables que se han medido. El
segundo es clasificar a individuos, distintos de los manejados en la informacin
inicial, en uno de los grupos existentes.
El Anlisis Discriminante tiene su origen en un famoso trabajo de Fisher en
1936 sobre la clasificacin de especies de flores de gnero Iris, utilizando como
variables de clasificacin la anchura y la longitud de spalos y ptalos.
El punto de partida del ALD es encontrar una funcin lineal discriminante
(FLD) que sea combinacin lineal de las variables originales. Las medidas
originales para cada objeto se combinan en este nico valor, de modo que los datos
se han reducido a una sola dimensin. Los coeficientes de los trminos se eligen de
modo que la FLD refleje la diferencia entre los grupos tanto como sea posible: los
objetos en el mismo grupo tendrn valores similares y los objetos en grupos
diferentes tendrn los valores muy diferentes. En consecuencia la FLD proporciona
un medio de discriminacin entre los distintos grupos
170
.
Anlisis Cluster
El anlisis cluster se define como un conjunto de tcnicas multivariantes
utilizadas para clasificar o agrupar objetos en grupos homogneos llamados
conglomerados (cluster) de acuerdo a algn criterio de seleccin predeterminado.
Los objetos dentro de cada conglomerado son similares entre s y diferentes a los
objetos de otros conglomerados. Como el conglomerado agrupa objetos similares,
se necesitan medidas de similitud o semejanza entre los que van a ser agrupados;
cuando las variables son mtricas se utilizan medidas de distancia.
169
Vandeginste B.G. et al, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, (1998)
170
Wold S. et al, Mathematics and Statistics in Chemistry, (1984)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
242
Para la formacin de conglomerados se pueden utilizar:
a) Mtodos no jerrquicos, en los cuales primero se especifica el
nmero de conglomerados y despus se asignan los objetos a ellos.
b) Mtodos jerrquicos, que se caracterizan por el desarrollo de una
jerarqua. Partiendo de tantos grupos iniciales como individuos se
estudian, se trata de conseguir agrupaciones sucesivas entre ellos de
forma que los resultados obtenidos en un paso previo siempre
necesitan encajarse dentro de los resultados del paso siguiente. La
representacin grfica se denomina dendograma.
El criterio de unin es el que determinar la forma de los grupos
171
. Para
desarrollar los conglomerados existen diferentes algoritmos:
1) Enlace simple o de distancias mnimas: los puntos que forman grupo
quedan representados por uno de ellos, que ser el que presente la
menor distancia con respecto a cualquier otro punto que no pertenezca
al grupo, tambin se llama mtodo del vecino ms prximo.
2) Enlace completo o de distancias mximas: considera como distancia
entre dos grupos la que existe entre los individuos ms alejados de cada
grupo, tambin se denomina mtodo del vecino ms alejado.
3) Mtodo del centroide: considera la distancia entre dos grupos la que
existe entre los centros de gravedad de cada uno de ellos, definidas stas
como las medias aritmticas de las variables de los individuos de cada
cluster.
El dendograma se construye de la siguiente manera:
1.- En la parte inferior del grfico se disponen los n elementos iniciales.
2.- Las uniones entre elementos se indican por tres lneas rectas. Dos
dirigidas a los elementos que se unen y que son perpendiculares al eje de los
elementos, y una paralela a este eje, que se sita al nivel en que se unen.
3.- El proceso se repite hasta que todos los elementos estn conectados por
lneas rectas.
171
Forina M. et al, Chemometrics for Analytical Chemistry, (1992)
Forina M. et al, Anal. Chim. Acta, 454, 13-19, (2002)
INTRODUCCIN APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
243
Si cortamos el dendograma a un nivel de distancia dado, obtenemos una
clasificacin del nmero de grupos existentes a ese nivel y los elementos que lo
forman.
Una vez comentadas las diferentes tcnicas quimiomtricas utilizadas,
exponemos algunas de sus aplicaciones.
La bibliografa encontrada sobre anlisis clasificatorios es muy amplia, en
diferentes campos como aceite
172
, agua
173
, leche
174
, bebidas destiladas
175
,
vinagre
176
, indicadores marinos
177
, etc.
Respecto al vino, los estudios van dirigidos tanto a la clasificacin de vinos
de distintas denominaciones de origen
178
, como a clasificaciones por el tipo de
tratamiento
179
, variedad
180
, etc. en funcin de compuestos no voltiles
181
,
voltiles
182
, parmetros del color
183
, u otros.
172
Jelen H. et al, Agric. Food Chem, 48, 2360-2367, (2000)
173
Dron J. et al, J. Chromatogr. A, 963, 259-264, (2002)
Gonzlez C. et al, J. Chromatogr. A, 896, 373- 379, (2000)
174
Massili R. T. et al, J. Agric. Food Chem., 48, 3470-3475, (2000)
175
Fitzgerald G., J. Chromatogr. A, 896, 351-359, (2000)
Ortiz M. C. et al, Analyst, 118, 801-805, (1993)
176
Castro R. et al, J. Chromatogr. A, 953, 7-15, (2002)
177
Gndara S. et al, Cienc. Tecnol. Aliment., 2, 244-247, (2000)
178
Prez S. et al, Anal. Chim. Acta, 458, 187-190, (2002)
Cliff M. et al, Am. J. Enol. Viticult., 53, 46-53, (2002)
Rebolo S. et al, Anal. Chim. Acta, 417, 211-220, (2000)
179
Guitart A. et al, Am. J. Enol, Viticult., 49, 4, 389-396, (1998)
180
Rebolo S. et al, Anal. Chim. Acta, 417, 211-220, (2000)
Gadarrama A. et al, Anal. Chim. Acta, 411, 193-200, (2000)
Pozo M.A., et al J. Chromatogr. A, 922, 267-275, (2001)
De La Calle D. et al, Vitis, 37, 181-188, (1998)
Aragn P. et al, Am. J. Enol. Viticult., 49, 211-219, (1998)
181
Fras S. et al, Talanta, 59, 335-344, (2003)
Rodrguez M.A. et al, Food Chem., 78, 523-532, (2002)
Barbaste M. et al, Anal. Chim. Acta, 472, 161-174, (2002)
Hernndez P. et al, J. Agr. Food Chem., 50, 2891-2899, (2002)
Ortega M. et al, Quim. Anal., 18, 127-131, (1999)
182
Daz C. et al, Food Chem., 80, 1-6, (2003)
Marengo E. et al, J. Chromatogr. A, 943, 1, 123-137, (2002)
Falqu E. et al, J. Agr. Food Chem., 50, 538-543, (2002)
Daz E.M. et al, Anal. Chim. Acta, 458, 139-145, (2002)
Petka J. et al, J. Sci. Food Agr., 81,.1533-1539, (2001)
183
Melndez M.E. et al, Anal. Chim. Acta, 446, 159-169, (2001)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
244
Algo muy novedoso respecto al anlisis quimiomtrico en el campo de la
enologa es la nariz electrnica.
Como se ha comentado es algo muy actual con lo que se est trabajando
mucho en el campo del vino. Se le denominada nariz u olfato electrnico
184
.
Estos instrumentos estn diseados para generar un elevado nmero de seales
selectivas frente a compuestos voltiles. Constan de un sistema de introduccin de
la muestra (que es una bomba aspiradora de gases o un inyector en espacio de
cabeza), un analizador y un sistema informtico capaz de tratar y convertir en
informacin til las seales originadas en el analizador. La deteccin de los olores
se realiza mediante sensores de diferentes tipos, o bien mediante un espectrmetro
de masas. En concreto, la idea bsica de este sistema consiste en proporcionar
medidas sensoriales automticas de calidad sobre los aromas, sin necesidad de
utilizar un panel de expertos catadores.
Los sensores constan de un material activo (xido metlico, un polmero,
etc.), cuyas propiedades elctricas o mecnicas cambian transitoriamente en
presencia de ciertos compuestos voltiles. Los lmites de deteccin obtenidos son
similares a los obtenidos con el olfato humano, frente a los mismos compuestos.
Cuando la nariz electrnica incorpora un espectrmetro de masas, se obtiene
una respuesta ms compleja, con gran cantidad de picos que corresponden a
fragmentos moleculares y que se distinguen por su relacin carga/masa.
La ventaja que tiene este sistema frente a un panel de expertos es que la
evaluacin siempre es objetiva, puesto que no est sujeta a la variabilidad humana
y la fatiga que afecta al olfato humano. El experto humano necesita de un descanso
despus de evaluar un nmero corto de muestras, sin embargo la nariz electrnica
puede evaluar un elevado nmero de muestra sin perder prestaciones.
Otra ventaja del sistema es que es rpido y puede adecuarse para el trabajo
en campo. La rapidez en la monitorizacin de los datos casi en tiempo real supone
ahorros considerables tanto de tiempo como de dinero.
Sin embargo, la utilizacin de la nariz electrnica en anlisis cuantitativos es
ms problemtica. Los sensores experimentan problemas de deriva de la lnea base
y prdida de sensibilidad con el uso, sobre todo en presencia de elevadas
cantidades de agua, etanol y cido actico. Otro problema es su limitada vida, que
obliga a sustituirlos al cabo de cierto tiempo de uso. En comparacin con el uso de
sensores, el espectrmetro de masas ofrece prestaciones superiores, siempre a
184
Ramis Ramos G. et al, Quimiometra, (2001)
INTRODUCCIN APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
245
cambio de un mayor coste econmico. Un espectrmetro de masas discrimina las
seales de agua, etanol o cido actico, separndolas fcilmente de las respuestas
del resto de molculas, presentando menos problemas de deriva y prdida de
sensibilidad, resultando as una respuesta ms rpida y cuantitativa.
Por encima de lo ya mencionado, la mayor limitacin de este sistema es la
falta de estndares especficos de los olores que se quieren cuantificar. El problema
es debido a la complejidad de la combinacin de los compuestos voltiles, algunos
de los cuales no pueden aislarse por su inestabilidad. En ciertos casos, lo que se
hace es utilizar mezclas de compuestos puros que imitan el olor de la muestras
reales. Otra solucin es utilizar un panel de expertos catadores para definir los
estndares a partir de muestras reales. Los resultados, en general, son buenos,
desde el punto de vista clasificatorio, pero es peor la estimacin cuantitativa de la
intensidad del olor, la cual est sujeta a una incertidumbre considerable.
La principal aplicacin de la nariz electrnica es el control de calidad en la
industria agroalimentaria.
Una vez descritas algunas tcnicas quimiomtricas y sus aplicaciones,
pasamos a comentar en los captulos siguientes, los objetivos de esta segunda parte
del trabajo y el desarrollo experimental de la misma.
Nos proponemos estudiar, haciendo uso de una estadstica sencilla, la
posibilidad de relacionar determinados vinos entre s, con caractersticas similares,
referidas siempre a su contenido en compuestos voltiles. No se trata nicamente
de reconstruir el aroma del vino a travs de su composicin, sino de valorar ciertas
partes de ste, que nos permitan, a partir de los datos de los que disponemos,
obtenidos en el anlisis cromatogrfico, construir un modelo a seguir
185
.
Como ya se coment en el captulo 13, la tcnica seleccionada para la
determinacin del contenido en compuestos voltiles fue SME:
El primero de los casos estudiado se refiere a la caracterizacin de vinos
tintos, rosados, claretes y mezclas de tintos y blancos (prohibidas). En todos los
185
Massart D.L. et al, Chemometrics & textbook, (1988)
Box G.E.P. et al, Estadstica para investigadores. Introduccin al diseo de
experimentos, anlisis de datos y construccin de modelos, (1993)
Miller J.N. et al, Estadstica y Quimiometra para Quimica Analtica, (2002)
Manly F.J., Multivariate Statistical Methods, (1997)
Daz C. et al, Food Chem., 81, 447-452, (2003)
Bueno J.E. et al, J. Food Sci, 68, 158-163, (2003)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
246
casos las muestras proceden de la DOCa Rioja, en concreto son 20 muestras de
vino jven del ao 2002.
De acuerdo con las normativas legales
186
, los vinos rosados son aquellos
que proceden de uvas rojas, o de la mezcla de rojas y blancas, cuyos zumos se han
fermentado sin orujos. Sus propiedades sensoriales estn entre las de los vinos
tintos y los vinos blancos. Los claretes son aqullos que se hacen con uvas rojas o
blancas o de sus mostos fermentados con los hollejos. En la legislacin de la CE,
no se admite el clarete como vino europeo, solamente se permite exportar el vino
rosado, mientras que los claretes nicamente pueden consumirse en Espaa, debido
a su baja difusin y hbito de consumo. Es por ello prctico construir un modelo
quimiomtrico que sea lo suficientemente sensible y especfico para evitar fraudes.
Existen estudios de tipificacin de vinos rosados y de mezclas fraudulentas con
diferentes variables, pero referidos al color, tonalidad y claridad, como
caractersticas discriminantes en los vinos.
Otra seccin de la Regulacin Europea
187
, prohbe hacer vinos rosados con la
mezcla de vinos tintos y vinos blancos.
El segundo caso estudiado en este trabajo se refiere a un grupo de vinos de
diferentes denominaciones de origen. La construccin de un modelo puede permitir
aceptar un vino de DOCa Rioja o bien descalificarlo como tal. Se comienza con un
pequeo nmero de muestras (18 vinos), y posteriormente se amplia el estudio a un
total de 244 muestras de cinco denominaciones de origen:
- Denominacin de Origen Calificada Rioja (R): 60 muestras.
- Denominacin de Origen Navarra (N): 54 muestras.
- Denominacin de Origen Valdepeas (V): 52 muestras.
- Denominacin de Origen Cariena (C): 36 muestras.
- Denominacin de Origen La Mancha (M): 42 muestras.
186
Estatuto de la Via y de los Alcoholes, Decreto 835/1972 de 23 de Marzo. Reglamento
de la Ley 25/1970
187
Reglamento (CE) 1128/96, DOCE, L 150/13, (1996)
CAPTULO 15
Objetivos
OBJETIVOS APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
249
15.-OBJETIVOS
Los objetivos marcados para esta parte de la memoria son :
x Puesta al da de la bibliografa sobre el tema.
x Bsqueda de tcnicas estadsticas adecuadas para clasificar muestras de
diferentes vinos, en funcin de su contenido en compuestos voltiles.
x Evaluacin de las diferentes tcnicas quimiomtricas.
x Caracterizacin de vinos tintos, rosados, claretes y mezclas de vinos
tintos y blancos en la DOCa Rioja.
x Caracterizacin de vinos de diferentes denominaciones de origen
(Rioja, Navarra, Valdepeas, La Mancha y Cariena).
CAPTULO 16
Procedimiento experimental
- Estudio con vinos de distinto tipo
- Anlisis en componentes principales
- Anlisis lineal discriminante
- Anlisis cluster
- Estudio preliminar con vinos de distinta denominacin
de origen
- Anlisis en componentes principales
- Anlisis lineal discriminante
- Anlisis cluster
- Estudio ampliado con vinos de distinta denominacin
de origen
- Anlisis en componentes principales
- Anlisis lineal discriminante
- Anlisis cluster
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
253
16.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
Como ya se ha comentado, el mtodo seleccionado para determinar los
compuestos voltiles en vino fue la microextraccin en fase slida (captulo 12). A
modo de recordatorio, el procedimiento empleado se expone de nuevo a
continuacin.
A 10.0 mL de vino sinttico o real se aadi 0.1 g de NaCl y 0.1 g de (NH
4
)
2
SO
4,
para favorecer el paso de los voltiles a la fase gas. Se tomaron tres alcuotas de
0.80 mL que se colocaron en tres viales capsulados, para realizar una sola
inyeccin en cada vial. Como en casos anteriores, se emple 3-octanol como
patrn interno. El proceso de adsorcin se hizo en espacio de cabeza y con
agitacin durante 10 minutos, pasados los cuales la fibra (Carbowax-
divinilbenceno o fibra color naranja) se somete al proceso de desorcin de 2
minutos en el cromatgrafo de gases.
Las variables analizadas fueron 11: 3-metil-1-butanol (3M1B), 1-hexanol
(1H), 2-feniletanol (2FE), acetato de-3-metil-1-butilo (A3M1B), cido decanoico
(AD), cido hexanoico (AH), cido octanico (AO), geraniol (G), hexanoato de
etilo (HE), octanoato de etilo (OE), succinato de dietilo (SD).
Una vez obtenidos los cromatogramas, los resultados fueron tratados con los
paquetes estadsticos STATGRAPHICS
188
y SPSS
189
.
16.1.- Estudio con vinos de distinto tipo
Inicialmente se realiz un estudio preliminar con un nmero reducido de
muestras de vino (vino tinto, rosado, clarete y mezclas en diferentes proporciones
de vino tinto y blanco preparadas por nosotros en el laboratorio), para ver si a partir
de tcnicas quimiomtricas se podan diferenciar bien los distintos tipos, dado que
como ya se ha comentado pueden existir fraudes, sobre todo con vinos rosados y
claretes. Este estudio se realiz con 20 muestras de vino de la DOCa Rioja
pertenecientes a los cuatro tipos anteriormente indicadas [3 claretes (c), 4 rosados
(r), 6 mezclas (m) (proporcin 1 tinto/10 blanco) y 7 tintos (t)]. A partir de los
cromatogramas se obtuvieron las reas de cada compuesto para cada uno de los
vinos. Los datos obtenidos se indican en la tabla 16-1.
188
Fernndez M.A. et al, Estadstica asistida por ordenador. Statgraphics plus 4.1,
(2000)
189
Prez C., Tcnicas Estadsticas con SPSS, (2001)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
254
VINO A1B3M 3M1B HE 1H OE SD
c-1 572953 143147 785428 227619 225935 57426
c-1 646736 6111224 959622 228453 1753943 87534
c-1 277425 3172835 1211845 206043 3296835 60025
r-2 1010154 5007143 1341236 223241 3437024 91014
r-2 1467013 4554323 9773121 223264 1150554 3562936
r-2 1110034 4008645 1390467 143065 3719355 28717
r-2 270789 4877356 1403334 223062 32930122 89815
m-3 339754 4272565 413276 206424 399876 13209
m-3 279232 4100567 427477 186746 476034 84923
m-3 242843 4518854 410765 140465 283876 81854
m-3 264962 4671965 384464 187756 355176 10358
m-3 306454 4137761 381912 212365 628070 84223
m-3 365954 39855132 559365 208524 8720101 54119
t-4 188845 4726976 442887 230123 524490 16798
t-4 133278 4028432 366045 196956 662065 11347
t-4 376354 5122065 348134 98213 272034 145023
t-4 196943 5370654 349945 20419 442739 161456
t-4 123067 48281121 403048 223867 512476 147323
t-4 179934 4282855 457065 238365 385876 100466
t-4 280365 4345676 636734 74127 1972772 16428
x Tabla 16-1: Valores de las reas de los distintos tipos de vino (c, r, m, t)
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
255
VINO AH G 2FEA OA AD
c-1 98965 46878 440843 194155 54499
c-1 101644 80868 511611 256856 99677
c-1 77166 120443 245155 348279 120367
r-2 -- 119857 298078 382580 120389
r-2 53167 90769 223589 287699 94922
r-2 62477 130898 191443 353077 75612
r-2 50232 114244 294832 302253 98821
m-3 45024 87156 413345 2307101 --
m-3 35232 67576 234832 180723 --
m-3 -- 36345 252134 137221 --
m-3 -- 44355 281445 376722 --
m-3 -- 37146 220567 113455 --
m-3 -- 62276 179356 168554 --
t-4 62732 61554 383624 134032 --
t-4 -- 52757 295676 123935 --
t-4 32234 50667 394847 87744 --
t-4 29412 23045 490236 69056 --
t-4 54032 46346 318726 107546 --
t-4 142067 81235 289417 117035 --
t-4 -- 73416 27349 133768 --
x Tabla 16-1: Continuacin. (-- : no detectado)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
256
A los datos obtenidos se les realiz un test ANOVA (nivel de significancia D
= 0.05) y mediante el test de la diferencia mnima significativa (DMS), donde los
valores de las medias se ordenan de mayor a menor, se estudi qu tipos de vino
eran diferentes entre s y en funcin de qu variables. (Los datos de este estudio se
encuentran en el apndice G).
A partir de estos datos se deduce que las variables significativas son: acetato
de 3 metil-1-butilo (A3M1B), hexanoato de etilo (HE), octanoato de etilo (OE),
succinato de dietilo (SD), cido hexanoico (AH), geraniol (G), cido octanoico
(AO) y cido decanoico (AD).
Si analizamos los resultados que se obtienen en la tabla de comparaciones
mltiples (apndice G), podemos ver qu variables son significativas para cada
grupo de vinos comparndolos con el resto de grupos. Los resultados obtenidos se
indican en la tabla 16-2.
Vino Variables
c r A3M1B HE 2FE
m A3M1B HE OE AH G 2FE AD
t HE OE SD G AO AD
r m A3M1B HE OE AO AD
t A3M1B HE OE SD AO AD
m t SD AO
x Tabla 16-2: Variables significativas en los distintos grupos de vinos
Como vemos, por ejemplo, entre los vinos claretes (c) y rosados (r) hay tres
variables que los hacen significativamente diferentes: acetato de 3 metil-1-butilo
(A3M1B), hexanoato de etilo (HE) y 2-feniletanol (2FE) o entre las mezclas (m) y
los vinos tintos (t) nicamente se diferencian en dos variables, succinato de dietilo
(SD) y cido octanoico (AO).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
257
De todas las variables estudiadas, nicamente el 3 metil-1-butanol (3M1B) y
el 1-hexanol (1H) no aparecen en la tabla de comparaciones mltiples, es decir, no
influyen para que entre los grupos de vinos exista diferencia significativa.
El objetivo de este estudio era clasificar una serie de muestras de vino, las
cuales pertenecan a cuatro tipos o clases diferentes, as en los apartados siguientes
se van a exponer diferentes tcnicas quimiomtricas que se han utilizado para
realizar el estudio.
16.1.1.- Anlisis en componentes principales
En primer lugar se comprob si se poda realizar la clasificacin
representando las muestras en componentes principales. De este modo, con el fin
de reducir la dimensionalidad del problema y ver cuantas direcciones eran tiles se
realiz el anlisis de las componentes principales (ACP). Para ver el nmero de
componentes realizamos el grfico de sedimentacin (fig. 16-1).
Nmero de componentes
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
A
u
t
o
v
a
l
o
r
6
5
4
3
2
1
0
x Figura 16-1: Grfico de sedimentacin
A partir de l vemos que con tres componentes (cada brusca) sera
suficiente. Si utilizamos el criterio de la varianza explicada y varianza acumulada
vemos que con estas tres componentes principales se explica o modela el 78.2% de
varianza (tabla 16-3)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
258
Componentes Autovalor
% varianza
explicada
% varianza
acumulada
1 5.20 47.3 47.3
2 2.31 21.0 68.3
3 1.09 9.89 78.6
4 0.905 8.22 86.4
5 0.506 4.60 90.9
6 0.401 3.64 94.6
7 0.297 2.70 97.3
8 0.128 1.16 98.5
9 9.23E-02 0.840 99.3
10 6.60E-02 0.601 99.9
11 9.06E-03 8.24E-02 100.0
x Tabla 16-3: Autovalores, varianza explicada y acumulada para las 11 componentes
En la tabla tabla 16-4 se indica la matriz de componentes, la cual da los
coeficientes de correlacin de cada una de las variables originales con las
componentes principales para ver con cual est ms correlacionada.
Componentes
1 2 3
A1B3M 0.689 0.208 -0.328
3M1B -0.106 0.881 6.90E-02
HE 0.963 8.28E-02 0.162
1H 7.79E-03 0.577 -0.688
OE 0.895 2.18E-02 0.301
SD -0.693 0.182 0.465
AH 0.244 0.574 -6.76E-03
G 0.884 -0.107 0.184
2FE -0.296 0.845 0.347
AO 0.856 -5.19E-02 -3.44E-02
AD 0.918 0.242 0.116
x Tabla 16-4: Matriz de componentes
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
259
Como podemos ver a partir de los datos obtenidos en la tabla 16-4, en la
componente 1 las variables que ms peso tienen son HE (0.963), AD (0.918), OE
(0.895), G (0.884) y AO (0.856) y esta componente explica el 47.3% de varianza.
En la segunda componente las variables que ms peso tienen son 3M1B (0.881) y
2FE (0.845) y esta componente explica el 21.0% de varianza y en la componente 3,
la variable que ms peso tiene, pero con correlacin negativa es 1H (-0.688)
seguida de SD (0.465).
Una vez que se han visto qu variables estn mas correlacionadas con las
componentes principales se calcularon los loadings (coeficientes de las
combinaciones lineales sobre las variables antiguas que definen las variables
nuevas) (tabla 16-5) para as poder calcular a partir de ellos los scores, es decir
las nuevas coordenadas de los objetos en las componentes principales.
Componentes
1 2 3
A1B3M 0.133 0.090 -0.302
3M1B -0.020 0.381 0.063
HE 0.185 0.036 0.149
1H 0.001 0.250 -0.633
OE 0.172 0.009 0.276
SD -0.133 0.079 0.427
AH 0.047 0.249 -0.006
G 0.170 -0.046 0.169
2FE -0.057 0.366 0.319
AO 0.165 -0.022 -0.032
AD 0.177 0.105 0.107
x Tabla 16-5: Loadings o coeficientes de las combinaciones lineales
sobre las variables antiguas que definen las variables nuevas
Obtenidos los coeficientes de las componentes principales se pas a
representar los scores de cada objeto en las nuevas componentes. As, si se
representa la componente 1 frente a la componente 2 se obtiene la figura 16-2.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
260
Componente 1
2,5 2,0 1,5 1,0 ,5 0,0 -,5 -1,0 -1,5
C
o
m
p
o
n
e
n
t
e
2
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
-1,0
-1,5
TIPO
t
r
m
c
x Figura 16-2: Grfico de puntuacin sobre las dos primeras componentes
Para explicar la posicin de los objetos en los grficos, llamamos a los
cuadrantes que forman los ejes en 0,0 como: 1, 2, 3 y 4 en el sentido inverso a las
agujas del reloj, comenzando por el 1, que es el de la parte superior derecha. As,
en la figura 16-2 podemos observar, en general, una buena distribucin de los
objetos segn el tipo de vino. Los vinos claretes se sitan en el cuadrante 1 (parte
superior positiva de la componente 2 en la que las variables que ms peso tenan
eran 3M1B y 2FE). Parte de los vinos tintos en el cuadrante 2 (parte izquierda de la
componente 1), y con ellos un vino de la clase mezcla; en la componente 1 las
variables con ms peso eran HE, AD, OE, G y AO. Los vinos rosados, en el
cuadrante 1 (parte derecha de la componente 1 y prximos a ella). Los
pertenecientes a la clase mezcla junto con dos tintos en el cuadrante 3 y en el
cuadrante 4 aparecen una muestra de rosado y otra de clarete.
La representacin de los scores en las coordenadas de la componente 1 y
de la componente 3 di la figura 16-3. En ella no se observa una clara distribucin
de las cuatro tipos o clases, ms bien una dispersin de puntos en el plano, aunque
hay una ligera tendencia a separarse las mezclas y tintos en los cuadrantes 2 y 3
(parte izquierda de la componente 1) de los rosados y claretes en los cuadrantes 1 y
4 (parte derecha de la componente1).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
261
Componente 1
2,5 2,0 1,5 1,0 ,5 0,0 -,5 -1,0 -1,5
C
o
m
p
o
n
e
n
t
e
3
3
2
1
0
-1
-2
TIPO
t
r
m
c
x Figura 16-3: Grfico de puntuacin, componente 1 frente a componente 3
Finalmente, la representacin de la componente 3 frente a la 2 tampoco dio
buenos resultados, ya que como se observa en la figura 16-4, nicamente se
separaron ligeramente los vinos que correspondan a mezclas y los claretes; entre
los otros tipos no se observa separacin.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
262
Componente 2
2,5 2,0 1,5 1,0 ,5 0,0 -,5 -1,0 -1,5
C
o
m
p
o
n
e
n
t
e
3
3
2
1
0
-1
-2
TIPO
t
r
m
c
x Figura 16-4: Grfico de puntuacin, componente 2 frente a componente 3
16.1.2.- Anlisis lineal discriminante
Otro de los mtodos empleados para caracterizar las muestras de vino en las
cuatro clases es un mtodo de reconocimiento de pautas supervisado o clasificado,
el Anlisis Lineal Discriminante. Inicialmente se realiz introduciendo todas las
variables juntas. (Las tablas de datos obtenidas se muestran en el Apndice G).
En la tabla 16-6 se indican los autovalores y la correlacin cannica de las
funciones cannicas discriminantes. El autovalor de una funcin se puede entender
como la parte de variabilidad total de la nube de puntos proyectada sobre el
conjunto de todas las funciones atribuible a la funcin. Si su valor es grande, la
funcin discriminar mucho. Las correlaciones cannicas miden las desviaciones
de las puntuaciones discriminantes entre grupos respecto a las desviaciones totales
sin distinguir grupos. As, si su valor es grande (prximo a 1) la dispersin ser
debida a las diferencias entre grupos y por tanto, la funcin discriminar mucho.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
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263
Funcin Autovalor % Varianza
explicada
% Varianza
acumulada
Correlacin
cannica
1 76.7 88.1 88.1 0.994
2 7.53 8.70 96.8 0.940
3 2.80 3.20 100.0 0.859
x Tabla 16-6: Autovalores y correlacin cannica de las funciones discriminantes
En la tabla vemos que de las tres funciones que se obtienen, los autovalores
van en orden decreciente 76.668 >>> 7.527 > 2.803. La primera funcin explicara
un 88.1% de varianza y las otras dos el 8.7% y el 3.2%, respectivamente. As, la
primera funcin es la que va a dar prcticamente la clasificacin.
En la tabla 16-7 se indican los coeficientes de las funciones cannicas
discriminantes con sus variables tipificadas.
Funcin
1 2 3
A1B3M 0.737 -0.316 0.616
3M1B 0.612 -0.183 0.081
HE 0.345 -2.461 0.543
1H -0.289 -0.690 0.056
OE 1.056 2.256 0.239
SD -0.758 0.091 1.414
AH 0.918 1.359 0.576
G -0.873 -0.626 -0.167
2FE 0.390 0.308 -0.905
AO 0.022 -0.167 -0.674
AD 1.330 1.106 -0.117
x Tabla 16-7: Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes
cannicas
Podemos apreciar qu variables influyen ms en cada funcin discriminante.
Por ejemplo, AD contribuye ms a la discriminacin en la primera funcin (1.330
> 1.106 > -0.117), mientras que AH (1.359 > 0.918 > 0.576) y OE (2.256 > 1.056 >
0.239) lo hacen en la segunda o SD (1.414) en la tercera.
T. CEDRN FERNNDEZ
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264
Otra aportacin que nos da el programa son las tablas de las funciones de los
centroides (tabla 16-8), las cuales nos dan una idea de cmo las funciones
discriminan grupos. As, si las medias de los dos grupos en cada funcin son muy
parecidas la funcin no discrimina grupos, por ejemplo, referente a la funcin 1 la
media entre los vinos de los grupos c y r es muy parecida, luego esta funcin tendr
bajo poder discriminatorio entre estos grupos, lo mismo ocurre para los vinos m y t.
Funcin
Vino 1 2 3
c 10.856 4.269 -1.269
r 10.534 -3.274 0.960
m -5.783 -1.410 -1.808
t -5.715 1.250 1.545
x Tabla 16-8: Funciones en los centroides de los grupos
El mapa territorial (apndice G) representa las fronteras utilizadas para la
clasificacin entre los grupos para las dos primeras funciones discriminantes.
En la figura 16-5 se representa una clasificacin de todos los objetos
estudiados utilizando las dos primeras funciones discriminantes. Vemos que entre
los vinos tintos y los rosados hay una separacin muy buena y que entre los
claretes y las mezclas aunque la separacin tambin se ve, no est tan marcada.
An as, puede observarse que quedan perfectamente clasificados los cuatro
tipos de vinos en los cuatro cuadrantes que forman los ejes en (0,0).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
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265
Funcin 1
20 10 0 -10
F
u
n
c
i
n
2
6
4
2
0
-2
-4
categora
t
r
m
c
x Figura 16-5: Grfico de dispersin de los objetos sobre el plano de
las dos primeras funciones discriminantes
Para ver si exista o no diferencia en cuanto a la forma de realizar el ALD lo
volvimos a repetir pero en el modo de estimacin por etapas, el cual va incluyendo
las variables independientes dentro de la funcin discriminante de una en una. En
concreto, se utiliz como mtodo de inclusin de variables el de Lambda. Los
resultados obtenidos se indican en el apndice G.
Con este tratamiento nicamente se introdujeron tres variables (SD, 2FE y
AD) obteniendo tres funciones discriminantes. En la tabla 16-9 se muestran los
coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes.
Funcin
1 2 3
SD -1.197 0.935 -0.472
2FE 0.958 -0.134 1.187
AD 1.136 0.308 -0.161
x Tabla 16-9: Coeficientes estandarizados de las funciones
discriminantes cannicas por etapas
tipo
T. CEDRN FERNNDEZ
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266
Los autovalores obtenidos para cada funcin se indican en la tabla 16-10.
Funcin Autovalor % Varianza
explicada
% Varianza
acumulada
Correlacin
cannica
1 28.654 96.1 96.1 0.983
2 0.661 2.2 98.3 0.631
3 0.494 1.7 100.0 0.575
x Tabla 16-10: Autovalores de cada funcin
La primera funcin discriminante explicara un 96.1% de varianza frente a
un 2.2% de la segunda funcin y de un 1.7% de la tercera. Los valores de
correlacin cannica tambin indican que la primera funcin discrimina ms que
las otras dos (0.983 > 0.631 > 0.575).
En la representacin grfica (figura 16-6) de la funcin 1 frente a la funcin
2 vemos que los objetos no quedan bien definidos en las diferentes clases o tipos,
los vinos tintos y mezclas, quedan mezclados as como vinos rosados y claretes.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
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267
funciones discriminantes cannicas
Funcin 1
10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 -8
F
u
n
c
i
n
2
2
1
0
-1
-2
-3
VINO
Centroides de grupo
t
m
r
c
4
3
2
1
x Figura 16-6: Representacin de funciones discriminantes: 1 frente a 2
En la representacin de la funcin 1 frente a la funcin 3 (figura 16-7)
tampoco quedan bien clasificados los vinos de distinto tipo, los vinos claretes y
mezclas no quedan bien separados, un vino mezcla aparece en el grupo de tintos, y
los rosados y claretes s que quedan bien separados, pero un vino clarete aparece en
el grupo de rosados.
tipo
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268
Funcin 1
10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 -8
F
u
n
c
i
n
3
3
2
1
0
-1
-2
VINO
t
m
r
c
x Figura 16-7: Representacin de funciones discriminantes: 1 frente a 3
16.1.3.- Anlisis cluster
Para completar las tcnicas de clasificacin realizamos un anlisis cluster. La
informacin de este anlisis es solo complementaria.
Tanto el anlisis clster como el anlisis discriminante sirven para clasificar
individuos en categoras. La diferencia principal entre ellos est en que en el
anlisis discriminante se conoce a priori el grupo de pertenencia, mientras que el
anlisis clster sirve para ir formando grupos homogneos de conglomerados.
La representacin grfica, a modo de rbol invertido, se denomina
dendograma.
Se realiz este primer anlisis cluster con todas las variables utilizando como
medida de distancia la distancia eucldea al cuadrado. Los resultados obtenidos se
indican en el apndice G. La representacin grfica se muestra en la figura 16-8.
tipo
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
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269
Dendograma
Distancias Cluster
0 5 10 15 20 25
Tipo Num +---------+---------+---------+---------+--------+
m 12
t 15
m 9
m 8
t 19
m 13
t 14
t 18
m 10
m 11
t 16 8
t 17
t 20
r 5
c 1 8
c 2
r 4 8
r 7
r 6
c 3
x Figura 16-8: Anlisis cluster para los distintos tipos de vinos
A partir del dendograma observamos que a una distancia de 10 obtenemos
tres conglomerados, uno con todos los vinos tintos, mezclas y un vino rosado, otro
conglomerado con dos vinos claretes y un tercer conglomerado con tres vinos
rosados y un vino clarete. A una distancia de 7 obtenemos 5 conglomerados,
similares a los obtenidos en el caso anterior, pero a esta distancia el vino rosado del
conglomerado 1 y el vino clarete del conglomerado 3 estaran en grupos
diferentes.Mediante esta tcnica de clasificacin y utilizando todas las variables no
se han separado los diferentes tipos de vino.
Con ALD quedan perfectamente clasificados (figura 16-5), sin embargo
mediante ACP la clasificacin no es tan clara, ya que por ejemplo uno de los vinos
de la clase rosado tiene ms similitud con los claretes que con los de su clase. Lo
T. CEDRN FERNNDEZ
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270
mismo ocurre con un vino de la clase clarete, que se asemeja ms a los rosados que
a los claretes.
16.2.- Estudio preliminar con vinos de distinta denominacin de
origen
Se realiz otro estudio preliminar con muestras de vino tinto de diferentes
Denominaciones de Origen. El nmero de muestras utilizadas fueron 18 [3 de
Navarra (N), 7 de Rioja (R), 4 de La Mancha (M) y 4 de Valdepeas (V)], las
variables en estudio fueron las mismas que en el caso anterior mas el acetato de 2-
feniletilo (AFE). La metodologa de trabajo utilizada tambin fue la misma que en
el apartado anterior y la preparacin de las muestras se realiz como se expuso en
el apartado 12-2. A partir de los cromatogramas obtenidos, las reas de cada
compuesto para cada uno de los vinos se indican en la tabla 16-11.
VINO A1B3M 3M1B HE 1H OE SD
N1 388952 7177351 483974 190886 902174 44624
N2 373648 5725753 390858 198584 761958 75915
N3 395982 6127050 368669 183252 604558 77552
R1 453950 5823255 556868 213163 919656 85774
R2 642523 6543163 677785 263385 988441 56174
R3 444419 6816555 554358 253487 902951 90511
R4 732945 8845685 495186 308875 638052 96374
R5 691152 5939574 622058 107158 1512956 49378
R6 242532 7729845 616246 275386 672684 143785
R7 239122 9265755 586354 302296 451674 219185
M1 621352 6266863 429756 185484 1089572 118174
M2 774850 6481763 397663 180385 810671 148958
M3 509752 3848085 188263 137685 530770 297685
M4 836835 6477558 474574 162955 1057751 172182
V1 948159 7803977 374285 160558 830785 92651
V2 563968 6824758 214764 142357 640984 92486
V3 813454 4233195 809325 92550 2048552 51288
V4 972055 5738485 452385 137074 1112841 79574
x Tabla 16-11: Valores de las reas de los picos cromatogrficos de los vinos de
distintas denominaciones de origen
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
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271
VINO
AFE AH G 2FE AO AD
N1 -- 46825 41910 314525 84621 25550
N2 -- 7273 43225 303735 78152 --
N3 -- 32122 -- 472033 40834 --
R1 -- 80142 31652 262882 62452 --
R2 -- 37340 46657 266562 92135 --
R3 -- 92823 36852 316252 63324 --
R4 -- 46258 33925 600458 50250 --
R5 -- 31380 40445 220232 86048 --
R6 -- 70612 114023 1173825 254774 58021
R7 21416 105812 148078 2494025 307552 104812
M1 -- -- -- 554035 175765 --
M2 -- 38522 -- 364141 167325 --
M3 -- -- -- 254025 111525 --
M4 -- -- -- 252932 115536 --
V1 22812 55252 50578 714220 113422 52832
V2 -- 39412 32552 467925 92151
V3 41425 108325 122412 265128 295912 97242
V4 -- 52111 51858 325336 121218 --
x Tabla 16-11: Continuacin. (--: no detectado)
A los datos obtenidos se les realiz un test ANOVA (nivel de significancia D
= 0.05), y como en el estudio anterior, mediante el test de la diferencia mnima
significativa (DMS) estudiamos las diferencias entre los distintos vinos y las
variables en estudio y los resultados se muestran en el apndice H.
A partir de los datos de la tabla ANOVA vemos que las variables
significativas son: acetato de 3 metil-1-butilo (A3M1B), 1-hexanol (1H), succinato
de dietilo (SD), cido hexanoico (AH), geraniol (G), y cido decanoico (AD).
Si analizamos los resultados que se obtienen en la tabla de comparaciones
mltiples (apndice H), podemos ver qu variables son significativas para cada
grupo de vinos comparndolos con el resto de grupos. Los resultados obtenidos se
indican en la tabla 16-12.
T. CEDRN FERNNDEZ
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272
Vino Variables
N R
M A1B3M SD
V A1B3M
R M HE 1H SD AH G
V A1B3M 1H SD
M V AH G
x Tabla 16-12: Variables significativas en los distintos grupos de vinos
Podemos ver que entre los vinos de Navarra y Rioja no hay ninguna variable
que los haga significativamente diferentes; entre Navarra y La Mancha el acetato
de 3 metil-1-butilo (A1B3M) y el succinato de dietilo (SD); entre Navarra y
Valdepeas el acetato de 3 metil-1-butilo (A1B3M); entre vinos de Rioja y de La
Mancha se diferencian por el hexanoato de etilo (HE), 1-hexanol (1H), succinato
de dietilo (SD), cido hexanoico (AH) y geraniol (G); entre los de Rioja y
Valdepeas las variables significativas fueron el acetato de 3 metil-1-butilo
(A3M1B), el 1-hexanol (1H) y el succinato de dietilo (SD); y entre La Mancha y
Valdepeas las variables que se muestran con diferencia significativa son el cido
hexanoico (AH) y el geraniol (G).
Como nuestro estudio tena como objetivo clasificar una serie de muestras de
vino, las cuales pertenecan a cuatro tipos diferentes que eran las cuatro
Denominaciones de Origen, en los apartados siguientes se van a exponer las
tcnicas quimiomtricas que se han utilizado.
16.2.1.- Anlisis en componentes principales
Comenzamos, igual que en el caso anterior, realizando la clasificacin de las
muestras por componentes principales (ACP). Para ver el nmero de componentes
principales realizamos el grfico de sedimentacin (figura 16-9).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
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273
Grfico de sedimentacin
Nmero de componente
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
A
u
t
o
v
a
l
o
r
6
5
4
3
2
1
0
x Figura 16-9: Grfico de sedimentacin
A partir de l vemos que con tres componentes (cada brusca) sera
suficiente. Si utilizamos el criterio de la varianza explicada y la varianza
acumulada observamos que con estos tres componentes se explica el 81.2% de
varianza (tabla 16-13).
Componentes Autovalor % Varianza
explicada
% Varianza
acumulada
1 4.911 40.929 40.929
2 3.204 26.701 67.630
3 1.630 13.585 81.215
4 0.871 7.256 88.470
5 0.598 4.980 93.451
6 0.329 2.741 96.192
7 0.184 1.530 97.722
8 0.103 0.861 98.583
9 8.52E-02 0.710 99.293
10 5.55E-02 0.463 99.756
11 2.46E-02 0.206 99.962
12 4.57E-03 3.81E-02 100.000
x Tabla 16-13: Autovalores, varianza explicada y acumulada para los 12 componentes
T. CEDRN FERNNDEZ
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274
En la tabla siguiente (tabla 16-14) se indica la matriz de componentes, la
cual da los coeficientes de correlacin de cada una de las variables originales con
las componentes principales para ver con cual est ms correlacionada.
Componentes
1 2 3
A1B3M -0.286 0.605 0.130
3M1B 0.418 -0.618 -0.345
HE 0.617 0.432 -0.465
1H 0.364 -0.732 -0.431
OE 0.120 0.949 -0.111
SD 5.21E-02 -0.487 0.784
AFE 0.715 0.500 0.264
AH 0.773 0.111 -0.334
G 0.951 7.85E-02 -5.16E-02
2FE 0.765 -0.540 0.192
AO 0.805 0.140 0.434
AD 0.937 0.135 0.236
x Tabla 16-14: Matriz de componentes
Como podemos ver a partir de los datos obtenidos en esta tabla, en la
componente 1 las dos variables que ms peso tienen son G (0.951) y AD (0.937),
seguidas por AO (0.805), AH (0.773), 2FE (0.765) y AFE (0.715) todas con
correlacin positiva, explicando esta componente el 40.9% de varianza. La segunda
componente explica el 26.7% de varianza, siendo la variable de ms peso el OE
(0.949) seguida de 1H pero con correlacin negativa (-0.732), y la tercera
componente explica el 13.6% y la variable con ms peso es el SD (0.784).
Una vez que se han visto qu variables estn ms correlacionadas con las
componentes principales se calcularon los loadings (tabla 16-15), con la
finalidad de obtener a partir de ellos los scores, es decir las coordenadas de los
objetos en las componentes principales.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
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275
Componentes
1 2 3
A1B3M -0.058 0.189 0.080
3M1B 0.085 -0.193 -0.212
HE 0.126 0.135 -0.285
1H 0.074 -0.228 -0.264
OE 0.024 0.296 -0.068
SD 0.011 -0.152 0.481
AFE 0.146 0.156 0.162
AH 0.157 0.035 -0.205
G 0.194 0.025 -0.032
2FE 0.156 -0.168 0.118
AO 0.164 0.044 0.266
AD 0.191 0.042 0.145
x Tabla 16-15: Loadings o coeficientes de las combinaciones lineales
sobre las variables antiguas que definen las variables nuevas
Obtenidos los coeficientes de las componentes principales se pas a
representar cada objeto en las nuevas componentes. As, si se representa la
componente 1 frente a la componente 2 se obtiene la figura 16-10.
Componente 1
3 2 1 0 -1 -2
C
o
m
p
o
n
e
n
t
e
2
4
3
2
1
0
-1
-2
DO
V
M
R
N
x Figura 16-10: Grfico de dispersin sobre las dos primeras componentes
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
276
En ella podemos observar, en general, una distribucin bastante aleatoria de
los objetos.
La representacin de la componente 1 frente a la componente 3 se muestra
en la figura 16-11.
Componente 1
3 2 1 0 -1 -2
C
o
m
p
o
n
e
n
t
e
3
3
2
1
0
-1
-2
DO
V
M
R
N
x Figura 16-11: Grfico de dispersin sobre las componentes 1 y 3
En esta figura se observa una distribucin ms homognea de los objetos en
funcin de las diferentes denominaciones de origen. Los vinos de Valdepeas y La
Mancha se encuentran ubicados en los cuadrantes 1 y 2 (parte superior positiva de
la componente 1), todos los de La Mancha se sitan en el cuadrante 2 (margen
izquierda de la componente 3). Sin embargo, los vinos de Navarra aparecen en el
cuadrante 3 y los de Rioja mayoritariamente en el 3 tambin, exceptuando dos
vinos que aparecen en el 1 y 4.
Por ltimo, la representacin de la componente 3 frente a la 2 dio los
siguiente resultados (figura 16-12).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
277
Componente 2
4 3 2 1 0 -1 -2
C
o
m
p
o
n
e
n
t
e
3
3
2
1
0
-1
-2
DO
V
M
R
N
x Figura 16-12: Grfico de dispersin sobre las componentes 2 y 3
Tampoco en este ltimo grfico de dispersin observamos una clara
separacin de las diferentes muestras por su pertenencia a las distintas
denominaciones de origen.
16.2.2.- Anlisis lineal discriminante
Para caracterizar las muestras de vino en las cuatro DO se ha utilizado un
mtodo de reconocimiento de pautas supervisado, el Anlisis Discriminante.
Inicialmente se realiz introduciendo todas las variables juntas. (Las tablas de datos
obtenidas se muestran en el Apndice H).
En la tabla 16-16 se indican los autovalores y la correlacin cannica de las
funciones cannicas discriminantes.
Funcin Autovalor % Varianza
explicada
% Varianza
acumulada
Correlacin
cannica
1 81.42 81.1 81.1 0.994
2 17.09 17.0 98.1 0.972
3 1.881 1.9 100 0.808
x Tabla 16-16: Autovalores y correlacin cannica de las funciones discriminantes
T. CEDRN FERNNDEZ
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278
Se puede observar que de las tres funciones que se obtienen, los autovalores
van en orden decreciente 81.428 >>> 17.098 > 1.881. Los valores de las
correlacin cannica son 0.994, 0.972, 0.808. La primera funcin explicara un
81.1% de varianza y las otras dos el 17.0% y el 1.9% respectivamente. As, la
primera funcin es la que va a dar prcticamente la clasificacin.
En la tabla 16-17 se indican los coeficientes de las funciones cannicas
discriminantes con sus variables tipificadas.
Funcin 1 2 3
A1B3M 0.105 -1.891 0.148
3M1B 2.466 1.782 1.828
HE -0.339 4.116 1.169
1H 0.595 -0.466 -0.954
OE 3.155 -0.306 -0.834
SD 4.328 2.202 1.247
AFE 0.552 0.935 2.300
AH -0.004 -0.165 0.036
G -6.407 -0.658 2.466
2FE -2.382 0.200 -0.936
AO 7.442 -0.913 0.854
AD -2.285 -3.427 -5.357
x Tabla 16-17: Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes
cannicas
Podemos apreciar qu variables influyen ms en cada funcin discriminante.
Por ejemplo, AO (7.442), G (-6.407), SD (4.328), OE (3.155) y 3M1B (2.466),
contribuyen ms a la discriminacin en la primera funcin, EH (4.116) en la
segunda o AD (-5.357) en la tercera.
La tabla de las funciones de los centroides (tabla 16-18) nos da una idea de
cmo las funciones discriminan grupos. Referente a la funcin 1, la media entre los
vinos de Rioja y Valdepeas es muy parecida, luego esta funcin tendr bajo poder
discriminatorio entre estos grupos.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
279
Funcin
DO 1 2 3
N -6.757 -0.262 -2.500
R -3.711 3.540 0.776
M 14.720 0.153 -0.336
V -3.157 -6.151 0.853
x Tabla 16-18: Funciones en los centroides de los grupos
En el apndice H se muestra el mapa territorial, igual que se hizo para el
estudio de las variedades.
En la figura 16-13 se representa una clasificacin de todos los objetos
estudiados utilizando los valores de las dos primeras funciones discriminantes.
funciones discriminantes cannicas
Funcin 1
20 10 0 -10
F
u
n
c
i
n
2
6
4
2
0
-2
-4
-6
-8
DO
Centroides de grupo
V
M
R
N
4
3
2
1
x Figura 16-13: Grfico de dispersin sobre las dos primeras funciones
Vemos que entre todos los grupos se muestra una buena separacin, los
vinos de las cuatro denominaciones de origen han quedado perfectamente
clasificados y dentro de su denominacin.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
280
Para ver si exista o no diferencia en cuanto a la forma de realizar el Anlisis
Discriminante lo volvimos a repetir pero en el modo de estimacin por etapas.
Tambin se utiliz como mtodo de inclusin de variables el de Lambda. Los
resultados obtenidos se indican en el apndice H.
Con este tratamiento nicamente se introdujeron cinco variables (A1B3M,
HE, SD, G y AO) obteniendo tres funciones discriminantes. En la tabla 16-19 se
muestran los coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes.
Funcin
1 2 3
A1B3M 0.718 1.321 0.595
HE 0.538 -2.081 0.962
SD 1.638 -1.107 1.007
G -5.264 1.284 0.719
AO 4.654 0.952 -0.903
x Tabla 16-19: Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes cannicas
Los autovalores obtenidos para cada funcin se indican en la tabla 16-20.
Funcin Autovalor % Varianza
explicada
% Varianza
acumulada
Correlacin
cannica
1 32.151 83.9 83.9 0.985
2 5.336 13.9 97.9 0.918
3 0.823 2.1 100.0 0.672
x Tabla 16-20: Autovalores para cada funcin
La primera funcin discriminante explicara un 83.9 % de varianza frente a
un 13.9 % de la segunda funcin y de un 2.1 % de la tercera. Los valores de
correlacin cannica tambin indican que la primera funcin discrimina ms que
las otras dos (0.985 > 0.918 > 0.672).
En la representacin grfica de la funcin 1 frente a la funcin 2 (figura 16-
14) vemos que los objetos de las denominaciones La Mancha y Valdepeas quedan
bien definidos, pero los vinos de Navarra no se diferencian mucho de los de Rioja.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
281
funciones discriminantes cannicas
Funcin 1
12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6
F
u
n
c
i
n
2
6
4
2
0
-2
-4
DO
Centroides de grupo
V
M
R
N
4
3
2
1
x Figura 16-14: Grfico de dispersin sobre las componentes 1 y 2 mediante
estimacin por etapas
16.2.3.- Anlisis cluster
Igual que hicimos en el estudio preliminar de las diferentes tipos de vino
realizamos un anlisis cluster. La informacin de este anlisis es slo
complementaria.
Se realiz este primer anlisis cluster con todas las variables utilizando como
medida de distancia la distancia eucldea al cuadrado. Los resultados obtenidos se
indican en el apndice H.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
282
x Figura 16-15: Anlisis cluster para los vinos de diferentes DO
A partir del dendograma obtenido (figura 16-15), observamos que no se
pueden clasificar mediante esta tcnica los vinos pertenecientes a las distintas
denominaciones.
La conclusin de este estudio es que el ALD es la tcnica que mejor clasifica
los vinos en funcin de su denominacin de origen.
Dendograma
Distancia Cluster
CASO 0 5 10 15 20 25
Num +--------+--------+--------+--------+--------+
N2
R4
N3
R8
V18
M12
M14
R5
M11
N1
R6
V16
R9 8
V15
R7
M13 8
V17
R10
n
2
Funciones discriminantes cannicas
centroides
DO
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA
__________________________________________________________________
291
16.3.3.- Anlisis cluster
Para completar las tcnicas de clasificacin realizamos un anlisis cluster.
Los resultados obtenidos se dan en el apndice I. No se muestra el dendograma ya
que al ser el nmero de muestras tan grande, no se aprecia bien la representacin,
an as no se apreciaba una clara separacin entre los vinos de las distintas
denominaciones de origen.
Como conclusin al estudio de clasificacin de vinos, podemos decir, que su
contenido en determinados compuestos voltiles es una variable que permite
diferenciarlos segn su denominacin de origen empleando para ello Anlisis
Lineal Discriminante.
CAPTULO 17
Conclusiones
CONCLUSIONES
_________________________________________________________________________
295
17.- CONCLUSIONES
Las conclusiones generales de esta memoria pueden resumirse en los
siguientes puntos:
1) Para la extraccin de compuestos voltiles en muestras de vino se pueden
utilizar la extraccin lquido-lquido (continuo, discontinuo y ultrasonidos), la
extraccin en fase slida, la microextraccin por desmezcla y la microextraccin en
fase slida.
2) Las concentraciones obtenidas para los compuestos estudiados, en
muestras de vino, estn de acuerdo con los valores que se encuentran en la
bibliografa.
3) Despus de hacer un estudio comparativo de las tcnicas de extraccin
empleadas, se selecciona la microextraccin en fase slida (SPME) por aspectos
como eficacia, rapidez, nulo consumo de disolventes orgnicos y comodidad.
4) Realizado el estudio quimiomtrico de los distintos tipos de vino (tinto,
clarete, rosado y mezclas) es posible diferenciarlos en base a su contenido en los
compuestos voltiles objeto de estudio.
6) Mediante tcnicas quimiomtricas de clasificacin y de reconocimiento de
pautas es posible caracterizar vinos de distintas denominaciones de origen segn su
contenido en determinados compuestos voltiles.
BIBLIOGRAFA Y APNDICES
Bibliografa
En este apartado bibliogrfico, las citas de las notas al pie de todo el
trabajo estn ampliadas, poniendo en cada uno de los artculos el nombre de todos
los autores y el ttulo. La ltima revisin bibliogrfica se ha hecho en Enero de
2004 en SciFinder.
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Apndices
Apndice A.- Constantes cromatogrficas
COMPUESTOS Ka Kh
Acetato de 3-metil-1-butilo
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
Acido butanoico
Decanoato de etilo
Succinato de dietilo
D-Terpineol
Acetato de 2-feniletilo
cido hexanoico
Geraniol
2-Feniletanol
cido octanoico
cido decanoico
0.6430.023 0.6550.019
0.5070.011 0.4760.010
0.6850.012 0.7000.013
1.380.05 1.300.03
1.430.03 1.350.03
1.600.02 1.580.02
1.770.01 1.750.01
0.4980.020 0.4080.021
1.670.01 1.810.02
0.6560.009 0.6660.018
1.310.02 1.380.01
1.360.03 1.360.01
0.3560.011 0.2460.010
1.610.01 1.650.01
0.7550.012 0.4160.021
0.5840.018 0.2850.011
1.290.02 0.4160.012
x Constantes cromatogrficas en rea (Ka) y en altura (Kh) con diclorometano (DM).
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
332
COMPUESTOS DM/HX
(2/1)
IO HX
Acetato de 3-metil-1-butilo
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
Acido butanoico
Decanoato de etilo
Succinato de dietilo
D-Terpineol
Acetato de 2 -feniletilo
cido hexanoico
Geraniol
2-Feniletanol
cido octanoico
cido decanoico
0.4120.009
1.050.02
0.8610.016
1.010.02
0.9720.016
0.8740.012
0.8790.013
0.3120.008
1.530.01
0.5840.011
1.220.02
1.050.01
1.140.02
1.010.02
1.040.02
0.8960.015
0.8520.014
1.180.00
0.6920.015
1.190.01
1.130.02
0.8720.010
0.9730.014
0.9130.017
0.3740.008
1.610.02
0.4320.013
1.070.02
1.400.01
0.6200.013
0.9360.022
0.8610.014
0.1810.006
0.7600.011
1.030.02
0.5030.016
0.8550.007
0.9770.013
1.210.01
0.9850.015
0.8500.008
0.4130.009
1.600.02
0.08430.0061
0.9610.014
0.9330.013
0.3430.008
0.7700.014
0.7510.013
0.2530.010
0.2210.007
x Constantes cromatogrficas (Ka) en diclorometano/hexano (DM/HX), isooctano (IO) y
hexano (HX)
COMPUESTOS P EP MIBC P/DM
(3/2)
Acetato de 3-metil-1-butilo
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
Acido butanoico
Decanoato de etilo
Succinato de dietilo
D-Terpineol
Acetato de 2 -feniletilo
cido hexanoico
Geraniol
2-Feniletanol
cido octanoico
cido decanoico
0.5130.011
0.7310.091
0.7630.015
0.9310.017
1.130.02
0.8610.017
0.8530.011
0.6960.008
1.340.01
0.1350.009
0.7340.021
0.9600.017
0.5700.018
0.8520.036
0.2430.011
0.5100.007
0.6330.012
0.4310.016
0.2130.014
0.5180.007
0.7120.018
0.9760.019
1.250.00
0.9310.042
0.7140.021
1.730.02
0.1030.025
1.130.01
0.9430.017
0.4530.022
0.7630.035
0.4250.011
0.3130.019
0.8610.008
0.6590.017
0.6230.021
0.1710.008
0.4130.025
1.220.03
0.8750.018
0.8410.022
0.5310.018
1.020.01
0.5170.015
0.9710.022
1.270.02
0.4620.016
0.6950.030
0.6230.025
0.6830.016
1.070.03
0.7510.014
0.7200.009
0.3540.004
0.5140.010
1.010.01
0.6910.011
0.5760.012
0.1290.007
1.130.01
0.6020.013
1.110.02
0.9920.011
0.5310.012
0.7970.019
0.3810.006
0.4430.009
0.6610.011
x Constantes cromatogrficas (Ka) en pentano (P), ter de petrleo (EP),
metilisobutilcetona (MIBC) y pentano/diclorometano (P/DM)
APNDICES
__________________________________________________________________
333
Apndice B.- Tiempos de retencin
COMPUESTOS TIEMPOS DE RETENCIN (min)
ELL MicroExtr.
sales SPE SPME
Acetato de 3-metil-1-butilo
3 Metil 1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
cido butanoico
Decanoato de etilo
Succinato de dietilo
D-Terpineol
Acetato de 2-feniletilo
Geraniol
cido hexanoico
2-Fenil etanol
cido octanoico
cido decanoico
5.7
7.8
8.6
-
12.1
14.7
-
-
-
21.7
-
25.4
-
26.1
27.9
31.6
38.7
5.8
7.5
8.3
9.1
11.2
13.4
-
18.1
18.2
22.4
-
-
-
-
24.0
26.1
31.2
5.7
7.7
8.6
-
12.1
14.6
-
-
-
21.7
-
25.4
-
26.4
27.9
31.6
38.7
5.7
7.7
8.6
9.0
12.1
-
18.0
-
-
21.8
22.2
25.5
26.4
-
27.9
31.6
-
x Tiempos de retencin (min) en los distintos procedimientos de extraccin utilizados
ELL: Extraccin lquido-lquido
MicroExtr. sales: microextraccin con sales
SPE: Extraccin en fase slida
SPME: microextraccin en fase slida
APNDICES
__________________________________________________________________
335
Apndice C.- Representaciones CG-Masas
A3M1B
3M1B
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
336
HE
1P
APNDICES
__________________________________________________________________
337
1H
OE
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
338
DE
L
APNDICES
__________________________________________________________________
339
SD
T
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
340
G
AFE
APNDICES
__________________________________________________________________
341
AH
2FE
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
342
AO
AD
APNDICES
__________________________________________________________________
343
Apndice D.- Rectas de calibrado en diclorometano
x Acetato de 3-metil-1-butilo
C/Cp S/Sp
0.416
1.25
2.50
5.20
10.4
26.0
52.0
175
233
292
1.00E
-3
0.0160
0.0380
0.120
0.240
0.550
1.02
2.94
3.98
5.23
C/Cp= concentracin compuesto/ concentracin patrn interno (en Pg/mL)
S/Sp= seal del compuesto en rea / seal de patrn interno en rea
0 50 100 150 200 250 300
0
1
2
3
4
5
6
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,02677 0,00426
B 0,01736 2,59953E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,9991 0,08624 10 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
344
x 3 Metil-1 Butanol
C/Cp S/Sp
19.0
38.0
76.0
152
228
266
380
418
456
532
570
760
5.00E
-3
0.300
1.30
2.56
5.00
6.10
9.50
10.8
13.1
15.2
16.5
22.5
x Hexanoato de etilo
C/Cp S/Sp
0.540
0.714
1.071
2.00
3.00
10.4
25.9
60.6
174
217
1.00E
-3
0.0260
0.0290
0.0340
0.0640
0.156
0.300
0.84
2.10
2.60
0 100 200 300 400 500 600 700 800
0
5
10
15
20
25 Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A -1,44075 0,32848
B 0,03085 8,32996E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99637 0,64618 12 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
0 50 100 150 200 250
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,02382 0,00385
B 0,01197 1,53282E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99934 0,03666 10 <0.0001
S
/
S
p
C/Cp
APNDICES
__________________________________________________________________
345
0 20 40 60 80 100 120
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
S
/
S
p
C/Cp
Parameter Value Error
------------------------------
A 0,02656 0,00679
B 0,0184 3,99531E-4
-------------------------------
R SD N P
----------------------------------
0,99859 0,03935 8 <0.0001
x 1-Pentanol
x 1-Hexanol
C/Cp S/Sp
0.520
1.04
5.19
17.2
25.9
29.4
31.1
43.3
86.5
156
242
0.0600
0.0750
0.153
0.390
0.838
0.903
0.935
1.20
2.20
4.10
6.24
C/Cp S/Sp
0.197
0.328
0.525
0.656
6.12
21.6
56.7
102
0.0180
0.0198
0.0238
0.0271
0.136
0.446
1.15
1.86
0 50 100 150 200 250
0
1
2
3
4
5
6
7
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,07004 0,00902
B 0,02558 3,12067E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99933 0,07521 11 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
346
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
S
/
S
p
C/Cp
Parameter Value Error
-------------------------------------
--
A 0,09732 0,00873
B 0,03918 0,00122
-------------------------------------
R SD N P
------------------------------------
-
0 99 0 0886 8 0 000
x Octanoato de etilo
C/Cp S/Sp
0.790
1.18
1.97
2.76
4.93
9.87
19.7
39.5
98.6
148
197
0.0230
0.0200
0.0480
0.0920
0.147
0.249
0.574
1.01
2.30
3.70
4.73
x Linalol
C/Cp S/Sp
0.347
0.695
1.11
5.39
7.67
10.7
50.3
73.2
0.0600
0.320
0.0900
0.270
0.360
0.492
2.06
2.98
0 50 100 150 200
0
1
2
3
4
5
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,02276 0,00257
B 0,02411 2,77685E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,9994 0,0606 11 <0.0001
S
/
S
p
C/Cp
APNDICES
__________________________________________________________________
347
x cido butanoico
C/Cp S/Sp
7.00
10.5
11.2
12.6
28.0
70.0
140
0.0450
0.117
0.143
0.149
0.450
1.25
2.41
x Decanoato de etilo
C/Cp S/Sp
0.0910
0.181
0.543
1.09
2.72
9.06
36.3
0.0120
0.0140
0.0260
0.0740
0.100
0.500
1.90
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A -0,06080,00641
B 0,01787 2,70674E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99943 0,03269 7 <0.0001
S
/
S
p
C/Cp
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 7,86374E-4 0,00003
B 0,05248 7,29016E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99952 0,02361 7 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
348
-20 0 20 40 60 80 100 120
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
S
/
S
p
C/Cp
Parameter Value Error
----------------------------------------
A 0,02171 0,00312
B 0,02414 6,6844E-5
----------------------------------------
R SD N P
----------------------------------------
0,99998 0,0069 8 <0.
x Succinato de dietilo
C/Cp S/Sp
0.111
0.222
0.444
0.888
22.2
77.7
110
166
222
0.240
0.0620
0.133
0.436
1.70
4.10
6.00
9.65
12.8
x - Terpineol
C/Cp S/Sp
0.212
0.425
0.678
1.27
9.76
49.7
71.2
98.8
0.0261
0.0307
0.0370
0.0501
0.256
1.24
1.74
2.40
0 50 100 150 200 250
0
2
4
6
8
10
12
14
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,11961 0,01661
B 0,05632 0,00113
------------------------------------------------------------
R
SD N P
------------------------------------------------------------
0,99859 0,26679 9 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
APNDICES
__________________________________________________________________
349
0 20 40 60 80 100 120
0
5
10
15
20
25
30
35
S
/
S
p
C/Cp
Parameter Value Error
--------------------------
A 0,14123 0,0195
B 0,29329 0,0081
-----------------------------
R SD N P
--------------------------------
0,9981 0,9018 7
<0.0001
x Acetato de 2-feniletilo
x cido hexanoico
C/Cp S/Sp
3.50
4.38
8.76
87.5
122
175
0.00900
0.055
0.0800
1.10
1.50
2.24
C/Cp S/Sp
110
101
67.5
42.6
11.4
6.30
0.298
33.7
28.5
19.6
12.8
3.39
1.88
0.545
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A -0,02543 0,00584
B 0,01276 1,67652E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99965 0,02734 6 <0.0001
S
/
S
p
C/Cp
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
350
x Geraniol
C/Cp S/Sp
0.231
0.289
0.874
1.16
1.45
0.230
0.266
0.507
0.747
0.930
x 2-Feniletanol
C/Cp S/Sp
4.45
13.4
26.8
31.2
35.7
40.1
62.4
107
208
5.00E
-3
0.0660
0.178
0.203
0.290
0.370
0.600
1.12
2.32
0 20 40 60 80 100
0
10
20
30
40
50
60
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,08668 0,00518
B 0,56013 3,99503E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,9991 0,03628 7 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
0 50 100 150 200
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A -0,10786 0,01592
B 0,01157 1,89692E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99906 0,0341 9 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
APNDICES
__________________________________________________________________
351
x cido octanoico
C/Cp S/Sp
11.5
12.3
13.8
15.3
22.9
30.7
76.6
107
153
3.30E
-2
4.00E
-2
4.60E
-2
0.0830
0.230
0.500
1.35
1.96
3.06
x cido decanoico
C/Cp S/Sp
20.0
36.4
66.8
101
202
250
1.00E
-2
0.460
1.30
1.97
4.47
5.62
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A -0,22858 0,02479
B 0,02107 3,5842E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99899 0,05215 9 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
0 50 100 150 200 250
0
1
2
3
4
5
6
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A -0,4207 0,04415
B 0,02418 3,12446E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99967 0,06518 6 <0.0001
------------------------------------------------------------
S
/
S
p
C/Cp
APNDICES
__________________________________________________________________
353
Apndice E.- Rango de concentraciones en vino real y
frmulas de los compuestos voltiles
En este apndice se presentan las frmulas y concentraciones de los
compuestos voltiles que se utilizan a lo largo del trabajo en vinos tinto y blanco.
x Acetato de 3-metil -1-butilo 0-23 ppm (T) 0.03-0.5(B)
x 3-Metil- 1-butanol 6-490 ppm
x Hexanoato de etilo tr-3.4 ppm (T) 0.003-1.3(B)
x 1-Pentanol 0.008-5.1 ppm
x 1-Hexanol 0.3-12 ppm
x Octanoato de etilo 0.2-3.8 ppm (T) 0.005-2.3(B)
x Linalol libres 100Pg/kg uva ligados 390
x cido butanoico 0.4-4.8ppm (T) 0.04-1.1(B)
x Decanoato de etilo tr-0.3ppm (T) 0-2.1(B)
x Succinato de dietilo 1,.5-7.9 ppm
x -Terpineol libres 5Pg/kg uva ligados 40
x Acetato de 2-feniletilo 0.02-8ppm (T) 0-18.5(B)
x cido hexanico (Caprico) 0.7-2.6 ppm (T) 0.02-5.7(B)
x Geraniol libres 5Pg/kg uva ligados 330
x 2-Feniletanol 4-197 ppm
x cido octanoico ( Caprlico) 0.7-3.7 ppm (T) 0.07-20.9(B)
x cido decanoico (Cprico) 0-1,.6 ppm (T) 0-4.5(B)
x Rango de concentraciones encontrado en la bibliografa sobre muestras de vino real
(T: tinto, B: blanco). En caso de no especificarse engloban ambos tipos.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
354
Acetato de 3-metil-1-butilo
O
O
3-Metil-1-butanol
OH
O
O
Hexanoato de etilo
OH
1-Pentanol
1-Hexanol
OH
O
O
Octanoato de etilo
Linalol
OH
OH
O
cido butanoico
O
O
Decanoato de etilo
O
O
O
Succinato de dietilo
O
OH
D-Terpineol
O
O
Acetato de 2-feniletanol
OH
O
cido hexanoico
Geraniol
OH
2-Feniletanol
OH
OH
O
cido octanoico
OH
O
cido decanoico
(C
7
H
14
O
2
) A3M1B
(C
8
H
14
O
4
) SD
(C
5
H
12
O) 3M1B
(C
10
H
12
O
2
) AFE
(C
5
H
12
O) 1P
(C
6
H
12
O
2
) AH
(C
6
H
14
O) 1H
(C
8
H
10
O) 2FE
(C
10
H
20
O
2
) OE
(C
10
H
18
O) L (C
10
H
18
O) G
(C
8
H
16
O
2
) AO
(C
12
H
24
O
2
) DE (C
10
H
20
O
2
) AD
(C
4
H
8
O
2
) AB
(C
8
H
16
O
2
) HE
(C
10
H
20
O) T
x Frmulas desarrolladas de los compuestos voltiles
APNDICES
__________________________________________________________________
355
Apndice F.- Programas BASIC utilizados
El primero utilizado es un programa en el que se mide a una nica longitud,
donde el nmero de datos que pueden almacenarse son 319. Este programa,
denominado Programa 1, se utilizar cuando queramos realizar medidas en las que
no sea nenesario trabajar en condiciones de mxima sensibilidad.
10 LAMBDA 190
20 Y-SCALE 0 TO .5
30 PLOTTER 1
40 MEASURE 3,6,0,600
50 FOR I=1 TO 301
60 IF NMEAS<I THEN 6
70 NEXT I
80 END
*La longitud de onda de medida se fija en la lnea 10 (en nuestro caso a 190 nm)
*En la lnea 40 se determina cuanto tiempo va a durar el registro (600 segundos), el
tiempo del ciclo (6 segundos), el tiempo de integracin (3 segundos) y el tiempo de
retardo (0 segundos)
*En la lnea 50 muestra el nmero de datos que se recogen. Como se mide durante
600 segundos, se hace una medida cada 6 segundos, el nmero de medidas de
absorbancia es de 300.
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
356
En este programa denominado Programa 2, seleccionamos la longitud de
onda de medida en funcin de las caractersticas del compuesto que est siendo
eluido.
10 ERASE STANDARD
20 ABSORBANCE
30 LAMBDA 200
40 PLOTTER 1
50 Y-SCALE 0 TO .1
60 MEASURE .5, .5, 0, 102
70 FOR I=1 TO 205
80 IF NMEAS < I THEN 80
90 NEXT I
100 STOP MEASURE
110 TO STANDARD 1
120 ABSORBANCE
130 LAMBDA 198
140 PLOTTER 1
150 Y-SCALE 0 TO .1
160 MEASURE .5, .5, 0, 42
170 FOR I=1 TO 85
180 IF NMEAS < I THEN 180
190 NEXT I
200 STOP MEASURE
210 TO STANDARD 2
220 ABSORBANCE
230 LAMBDA 202
240 PLOTTER 1
250 Y-SCALE 0 TO .1
260 MEASURE .5, .5, 0, 42
270 FOR I=1 TO 85
280 IF NMEAS < I THEN 280
290 NEXT I
300 STOP MEASURE
310 TO STANDARD 3
320 ABSORBANCE
330 LAMBDA 200
340 PLOTTER 1
350 Y-SCALE 0 TO .1
360 MEASURE .5, .5, 0, 54
730 LAMBDA 200
740 PLOTTER 1
750 Y-SCALE 0 TO .1
760 MEASURE .5, .5, 0, 120
770 FOR I=1 TO 241
780 IF NMEAS < I THEN 780
790 NEXT I
800 STOP MEASURE
810 TO STANDARD 8
820 END
830 GCLEAR
840 SCALE 0, 600, -.01, 5
850 XAXIS 0, 100
860 YAXIS 0, .1
870 PEN 1
880 RECALL STANDARD 1
890 FOR I=1 TO 205
900 X= .5*1
910 Y=VALUE(X)
920 PLOT X,Y
930 NEXT I
940 RECALL STANDARD 2
950 FOR I=1 TO 85
960 X= .5*1
970 Y=VALUE(X)
980 X=X+102
990 PLOT X,Y
1000 NEXT I
1010 RECALL STANDARD 3
1020 FOR I=1 TO 85
1030 X= .5*1
1040 Y=VALUE(X)
1050 X=X+144
1060 PLOT X,Y
1070 NEXT I
1080 RECALL STANDARD 4
APNDICES
__________________________________________________________________
357
370 FOR I=1 TO 109
380 IF NMEAS < I THEN 380
390 NEXT I
400 STOP MEASURE
410 TO STANDARD 4
420 ABSORBANCE
430 LAMBDA 204
440 PLOTTER 1
450 Y-SCALE 0 TO .1
460 MEASURE .5, .5, 0, 42
470 FOR I=1 TO 85
480 IF NMEAS < I THEN 480
490 NEXT I
500 STOP MEASURE
510 TO STANDARD 5
520 ABSORBANCE
530 LAMBDA 196
540 PLOTTER 1
550 Y-SCALE 0 TO .1
560 MEASURE .5, .5, 0, 90
570 FOR I=1 TO 181
580 IF NMEAS < I THEN 580
590 NEXT I
600 STOP MEASURE
610 TO STANDARD 6
620 ABSORBANCE
630 LAMBDA 196
640 PLOTTER 1
650 Y-SCALE 0 TO .1
660 MEASURE .5, .5, 0, 108
670 FOR I=1 TO 217
680 IF NMEAS < I THEN 680
690 NEXT I
700 STOP MEASURE
710 TO STANDARD 7
720 ABSORBANCE
1090 FOR I=1 TO 109
1100 X= .5*1
1110 Y=VALUE(X)
1120 X=X+186
1130 PLOT X,Y
1140 NEXT I
1150 RECALL STANDARD 5
1160 FOR I=1 TO 85
1170 X= .5*1
1180 Y=VALUE(X)
1190 X=X+240
1200 PLOT X,Y
1210 NEXT I
1220 RECALL STANDARD 6
1230 FOR I=1 TO 181
1240 X= .5*1
1250 Y=VALUE(X)
1260 X=X+282
1270 PLOT X,Y
1280 NEXT I
1290 RECALL STANDARD 7
1300 FOR I=1 TO 217
1310 X= .5*1
1320 Y=VALUE(X)
1330 X=X+372
1340 PLOT X,Y
1350 NEXT I
1360 RECALL STANDARD 8
1370 FOR I=1 TO 241
1380 X= .5*1
1390 Y=VALUE(X)
1400 X=X+480
1410 PLOT X,Y
1420 NEXT I
1430 PENUP
1440END
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
358
*Las primeras lneas (de la 30 a la 110) son similares al programa 1. Se mide a una
longitud de onda de 200 nm durante un tiempo de 102 segundos, realizando
medidas cada 0.5 segundos. Una vez realizada la medida se almacena la
informacin en una de las memorias (denominadas standard). Estas lneas se
repiten las veces que sea necesario (hasta lmite de memoria) y cada registro se
guarda en un standard distinto.
*Una vez que se ha terminado de medir, el programa termina en la lnea 820.
*Entre las lneas 830 y 870 se fijan las escalas del registro que va a ser presentado
en la pantalla y, a partir de la lnea 880 el programa pinta en orden correlativo cada
standard, dibujando as el cromatograma.
*El programa permite tambin corregir un aspecto formal: en cada estndar la
escala de tiempos empieza en cero, por lo que habr que hacer una correccin para
que asigne a cada dato su tiempo real. Esto se hace en dos etapas: la lnea 900 (y
similares en cada grupo) multiplica el nmero del dato (I) por el tiempo con que se
recoge cada dato (0.5 s) y la lnea 980 suma a cada estndar el tiempo de
cromatograma ya transcurrido.
APNDICES
__________________________________________________________________
359
Apndice G.- Resultados quimiomtricos.
Distinto tipo de vino
En este apndice se muestran los resultados obtenidos de la aplicacin de las
distintas tcnicas quimiomtricas en el estudio de muestras de vino de distinto tipo:
tinto (1), clarete (2), rosado (3) y mezclas (4).
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrtica
F Sig.
A3M1B Inter-grupos 155414026,488 3 51804675,496 9,095 ,001
Intra-grupos 91131361,262 16 5695710,079
Total 246545387,750 19
3M1B Inter-grupos 152585185,919 3 50861728,640 ,998 ,419
Intra-grupos 815322378,631 16 50957648,664
Total 967907564,550 19
HE Inter-grupos 252801490,938 3 84267163,646 45,244 ,000
Intra-grupos 29800271,262 16 1862516,954
Total 282601762,200 19
1H Inter-grupos 128638,093 3 42879,364 ,153 ,926
Intra-grupos 4491868,857 16 280741,804
Total 4620506,950 19
OE Inter-grupos 2082172274,583 3 694057424,861 15,335 ,000
Intra-grupos 724138915,167 16 45258682,198
Total 2806311189,750 19
SD Inter-grupos 2023214,938 3 674404,979 10,305 ,001
Intra-grupos 1047120,262 16 65445,016
Total 3070335,200 19
AH Inter-grupos 1267947,336 3 422649,112 3,526 ,039
Intra-grupos 1917872,464 16 119867,029
Total 3185819,800 19
G Inter-grupos 1083008,205 3 361002,735 7,423 ,002
Intra-grupos 778180,345 16 48636,272
Total 1861188,550 19
2FE Inter-grupos 6108570,943 3 2036190,314 2,822 ,072
Intra-grupos 11546463,607 16 721653,975
Total 17655034,550 19
AO Inter-grupos 13785941,783 3 4595313,928 11,075 ,000
Intra-grupos 6638771,417 16 414923,214
Total 20424713,200 19
x Anova. (sig. ! 0.05 = no significativa)
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
360
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrtica
F Sig.
AD Inter-grupos 4100069,333 3 1366689,778 66,833 ,000
Intra-grupos 327190,667 16 20449,417
Total 4427260,000 19
x Anova. Continuacin.
Intervalo 95%
Variable Diferencia
de medias
Error Sig. Lmite
inferior
Lmite
superior
3MBA 1 2 -4654,50 1822,77 ,021 -8518,60 -790,40
3 1977,17 1687,56 ,259 -1600,30 5554,63
4 2755,71 1646,89 ,114 -735,53 6246,96
2 1 4654,50 1822,77 ,021 790,40 8518,60
3 6631,67 1540,52 ,001 3365,90 9897,43
4 7410,21 1495,86 ,000 4239,13 10581,30
3 1 -1977,17 1687,56 ,259 -5554,63 1600,30
2 -6631,67 1540,52 ,001 -9897,43 -3365,90
4 778,55 1327,76 ,566 -2036,19 3593,28
4 1 -2755,71 1646,89 ,114 -6246,96 735,53
2 -7410,21 1495,86 ,000 -10581,30 -4239,13
3 -778,55 1327,76 ,566 -3593,28 2036,19
3M1B 1 2 5305,42 5452,09 ,345 -6252,50 16863,33
3 8612,17 5047,66 ,107 -2088,38 19312,72
4 4703,10 4926,01 ,354 -5739,57 15145,76
2 1 -5305,42 5452,09 ,345 -16863,33 6252,50
3 3306,75 4607,86 ,483 -6461,47 13074,97
4 -602,32 4474,27 ,895 -10087,35 8882,70
3 1 -8612,17 5047,66 ,107 -19312,72 2088,38
2 -3306,75 4607,86 ,483 -13074,97 6461,47
4 -3909,07 3971,47 ,340 -12328,22 4510,08
4 1 -4703,10 4926,01 ,354 -15145,76 5739,57
2 602,32 4474,27 ,895 -8882,70 10087,35
3 3909,07 3971,47 ,340 -4510,08 12328,22
x Tabla de comparaciones mltiples por Diferencia Mnima Significativa (DMS).
(sig. ! 0.05 = no significativa)
APNDICES
__________________________________________________________________
361
Intervalo 95%
Variable Diferencia
de medias
Error Sig. Lmite
inferior
Lmite
superior
HE 1 2 -2924,50 1042,34 ,013 -5134,16 -714,84
3 5561,17 965,02 ,000 3515,42 7606,91
4 5565,29 941,76 ,000 3568,84 7561,73
2 1 2924,50 1042,34 ,013 714,84 5134,16
3 8485,67 880,94 ,000 6618,17 10353,17
4 8489,79 855,40 ,000 6676,43 10303,15
3 1 -5561,17 965,02 ,000 -7606,91 -3515,42
2 -8485,67 880,94 ,000 -10353,17 -6618,17
4 4,12 759,27 ,996 -1605,46 1613,70
4 1 -5565,29 941,76 ,000 -7561,73 -3568,84
2 -8489,79 855,40 ,000 -10303,15 -6676,43
3 -4,12 759,27 ,996 -1613,70 1605,46
1H 1 2 -157,67 404,68 ,702 -1015,55 700,22
3 -30,00 374,66 ,937 -824,25 764,25
4 65,48 365,63 ,860 -709,63 840,58
2 1 157,67 404,68 ,702 -700,22 1015,55
3 127,67 342,02 ,714 -597,38 852,71
4 223,14 332,10 ,511 -480,88 927,17
3 1 30,00 374,66 ,937 -764,25 824,25
2 -127,67 342,02 ,714 -852,71 597,38
4 95,48 294,78 ,750 -529,43 720,39
4 1 -65,48 365,63 ,860 -840,58 709,63
2 -223,14 332,10 ,511 -927,17 480,88
3 -95,48 294,78 ,750 -720,39 529,43
OE 1 2 -4632,83 5138,18 ,381 -15525,29 6259,62
3 19342,17 4757,03 ,001 9257,71 29426,62
4 17806,67 4642,39 ,001 7965,25 27648,09
2 1 4632,83 5138,18 ,381 -6259,62 15525,29
3 23975,00 4342,56 ,000 14769,19 33180,81
4 22439,50 4216,66 ,000 13500,59 31378,41
3 1 -19342,17 4757,03 ,001 -29426,62 -9257,71
2 -23975,00 4342,56 ,000 -33180,81 -14769,19
4 -1535,50 3742,81 ,687 -9469,91 6398,91
4 1 -17806,67 4642,39 ,001 -27648,09 -7965,25
2 -22439,50 4216,66 ,000 -31378,41 -13500,59
3 1535,50 3742,81 ,687 -6398,91 9469,91
x Tabla de comparaciones mltiples por Diferencia Mnima Significativa (DMS).
Continuacin
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
362
Intervalo 95%
Variable Diferencia
de medias
Error Sig. Lmite
inferior
Lmite
superior
1H 1 2 -157,67 404,68 ,702 -1015,55 700,22
3 -30,00 374,66 ,937 -824,25 764,25
4 65,48 365,63 ,860 -709,63 840,58
2 1 157,67 404,68 ,702 -700,22 1015,55
3 127,67 342,02 ,714 -597,38 852,71
4 223,14 332,10 ,511 -480,88 927,17
3 1 30,00 374,66 ,937 -764,25 824,25
2 -127,67 342,02 ,714 -852,71 597,38
4 95,48 294,78 ,750 -529,43 720,39
4 1 -65,48 365,63 ,860 -840,58 709,63
2 -223,14 332,10 ,511 -927,17 480,88
3 -95,48 294,78 ,750 -720,39 529,43
OE 1 2 -4632,83 5138,18 ,381 -15525,29 6259,62
3 19342,17 4757,03 ,001 9257,71 29426,62
4 17806,67 4642,39 ,001 7965,25 27648,09
2 1 4632,83 5138,18 ,381 -6259,62 15525,29
3 23975,00 4342,56 ,000 14769,19 33180,81
4 22439,50 4216,66 ,000 13500,59 31378,41
3 1 -19342,17 4757,03 ,001 -29426,62 -9257,71
2 -23975,00 4342,56 ,000 -33180,81 -14769,19
4 -1535,50 3742,81 ,687 -9469,91 6398,91
4 1 -17806,67 4642,39 ,001 -27648,09 -7965,25
2 -22439,50 4216,66 ,000 -31378,41 -13500,59
3 1535,50 3742,81 ,687 -6398,91 9469,91
SD 1 2 2,00 195,39 ,992 -412,20 416,20
3 -217,83 180,89 ,246 -601,31 165,64
4 -740,71 176,53 ,001 -1114,95 -366,48
2 1 -2,00 195,39 ,992 -416,20 412,20
3 -219,83 165,13 ,202 -569,90 130,23
4 -742,71 160,35 ,000 -1082,63 -402,80
3 1 217,83 180,89 ,246 -165,64 601,31
2 219,83 165,13 ,202 -130,23 569,90
4 -522,88 142,33 ,002 -824,60 -221,16
4 1 740,71 176,53 ,001 366,48 1114,95
2 742,71 160,35 ,000 402,80 1082,63
3 522,88 142,33 ,002 221,16 824,60
x Tabla de comparaciones mltiples por Diferencia Mnima Significativa (DMS).
Continuacin
APNDICES
__________________________________________________________________
363
Intervalo 95%
Variable Diferencia
de medias
Error Sig. Lmite
inferior
Lmite
superior
AH 1 2 511,08 264,43 ,071 -49,48 1071,65
3 791,67 244,81 ,005 272,69 1310,65
4 467,76 238,91 ,068 -38,71 974,24
2 1 -511,08 264,43 ,071 -1071,65 49,48
3 280,58 223,48 ,227 -193,18 754,35
4 -43,32 217,00 ,844 -503,35 416,71
3 1 -791,67 244,81 ,005 -1310,65 -272,69
2 -280,58 223,48 ,227 -754,35 193,18
4 -323,90 192,62 ,112 -732,24 84,43
4 1 -467,76 238,91 ,068 -974,24 38,71
2 43,32 217,00 ,844 -416,71 503,35
3 323,90 192,62 ,112 -84,43 732,24
G 1 2 -312,08 168,44 ,082 -669,15 44,99
3 269,17 155,94 ,104 -61,42 599,75
4 271,38 152,18 ,094 -51,24 594,00
2 1 312,08 168,44 ,082 -44,99 669,15
3 581,25 142,36 ,001 279,47 883,03
4 583,46 138,23 ,001 290,43 876,50
3 1 -269,17 155,94 ,104 -599,75 61,42
2 -581,25 142,36 ,001 -883,03 -279,47
4 2,21 122,70 ,986 -257,89 262,32
4 1 -271,38 152,18 ,094 -594,00 51,24
2 -583,46 138,23 ,001 -876,50 -290,43
3 -2,21 122,70 ,986 -262,32 257,89
2FE 1 2 1472,42 648,82 ,037 96,98 2847,85
3 1356,00 600,69 ,038 82,60 2629,40
4 497,81 586,21 ,408 -744,90 1740,52
2 1 -1472,42 648,82 ,037 -2847,85 -96,98
3 -116,42 548,35 ,835 -1278,87 1046,04
4 -974,61 532,45 ,086 -2103,36 154,14
3 1 -1356,00 600,69 ,038 -2629,40 -82,60
2 116,42 548,35 ,835 -1046,04 1278,87
4 -858,19 472,62 ,088 -1860,10 143,72
4 1 -497,81 586,21 ,408 -1740,52 744,90
2 974,61 532,45 ,086 -154,14 2103,36
3 858,19 472,62 ,088 -143,72 1860,10
x Tabla de comparaciones mltiples por Diferencia Mnima Significativa (DMS).
Continuacin
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
364
Intervalo 95%
Variable Diferencia
de medias
Error Sig. Lmite
inferior
Lmite
superior
AO 1 2 -649,58 491,97 ,205 -1692,52 393,36
3 651,67 455,48 ,172 -313,91 1617,24
4 1559,67 444,50 ,003 617,36 2501,97
2 1 649,58 491,97 ,205 -393,36 1692,52
3 1301,25 415,79 ,006 419,81 2182,69
4 2209,25 403,74 ,000 1353,36 3065,14
3 1 -651,67 455,48 ,172 -1617,24 313,91
2 -1301,25 415,79 ,006 -2182,69 -419,81
4 908,00 358,37 ,022 148,29 1667,71
4 1 -1559,67 444,50 ,003 -2501,97 -617,36
2 -2209,25 403,74 ,000 -3065,14 -1353,36
3 -908,00 358,37 ,022 -1667,71 -148,29
AD 1 2 -59,33 109,22 ,594 -290,87 172,20
3 914,67 101,12 ,000 700,31 1129,03
4 914,67 98,68 ,000 705,47 1123,86
2 1 59,33 109,22 ,594 -172,20 290,87
3 974,00 92,31 ,000 778,32 1169,68
4 974,00 89,63 ,000 783,99 1164,01
3 1 -914,67 101,12 ,000 -1129,03 -700,31
2 -974,00 92,31 ,000 -1169,68 -778,32
4 ,00 79,56 1,000 -168,66 168,66
4 1 -914,67 98,68 ,000 -1123,86 -705,47
2 -974,00 89,63 ,000 -1164,01 -783,99
3 ,00 79,56 1,000 -168,66 168,66
x Tabla de comparaciones mltiples por Diferencia Mnima Significativa (DMS).
Continuacin
APNDICES
__________________________________________________________________
365
ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES
Inicial Extraccin
A3M1B 1.000 .626
3M1B 1.000 .792
HE 1.000 .961
1H 1.000 .807
OE 1.000 .893
SD 1.000 .729
AH 1.000 .389
G 1.000 .826
2FE 1.000 .923
AO 1.000 .736
AD 1.000 .915
x Comunalidades. Mtodo de extraccin
Componentes Autovalor % Varianza explicada % Varianza acumulada
1 5.198 47.258 47.258
2 2.311 21.005 68.263
3 1.088 9.889 78.152
4 .905 8.224 86.376
5 .506 4.602 90.978
6 .401 3.643 94.621
7 .297 2.697 97.317
8 .128 1.160 98.477
9 9.238E-02 .840 99.317
10 6.606E-02 .601 99.918
11 9.060E-03 8.236E-02 100.000
x Autovalores.Varianza explicada, varianza acumulada
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
366
Componente
1 2 3
A3M1B .689 .208 -.328
3M1B -.106 .881 6.901E-02
HE .963 8.276E-02 .162
1H 7.787E-03 .577 -.688
OE .895 2.179E-02 .301
SD -.693 .182 .465
AH .244 .574 -6,755E-03
G .884 -.107 .184
2FE -.296 .845 .347
AO .856 -5,193E-02 -3,443E-02
AD .918 .242 .116
x Matriz de componentes
Componente
1 2 3
A3M1B .133 .090 -.302
3M1B -.020 .381 .063
HE .185 .036 .149
1H .001 .250 -.633
OE .172 .009 .276
SD -.133 .079 .427
AH .047 .249 -.006
G .170 -.046 .169
2FE -.057 .366 .319
AO .165 -.022 -.032
AD .177 .105 .107
x Matriz de coeficientes para el clculo de las puntuaciones en las componentes
(loadings)
Componente 1 2 3
1 1.000 .000 .000
2 .000 1.000 .000
3 .000 .000 1.000
x Matriz de covarianza de las puntuaciones de las componentes
APNDICES
__________________________________________________________________
367
ANLISIS LINEAL DISCRIMINANTE
Mtodo I: variables juntas
Casos no
ponderados
N Porcentaje
Vlidos 20 100.0
Excluidos Cdigo de grupo de perdido o fuera de rango 0 .0
Perdida al menos una variable discriminante 0 .0
Perdidos o fuera de rango ambos, el cdigo de
grupo y al menos una de las variables
discriminantes.
0 .0
Total 0 .0
Total 20 100.0
x Resumen del procesamiento para el anlisis de casos
N vlido (segn lista)
VINO No ponderados Ponderados
1 3MBA 3 3.000
3M1B 3 3.000
HE 3 3.000
1H 3 3.000
OE 3 3.000
SD 3 3.000
AH 3 3.000
G 3 3.000
2FE 3 3.000
AO 3 3.000
AD 3 3.000
2 3MBA 4 4.000
3M1B 4 4.000
HE 4 4.000
1H 4 4.000
OE 4 4.000
SD 4 4.000
AH 4 4.000
G 4 4.000
2FE 4 4.000
AO 4 4.000
AD 4 4.000
x Estadsticos del grupo
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
368
N vlido (segn lista)
VINO No ponderados Ponderados
3 3MBA 6 6.000
3M1B 6 6.000
HE 6 6.000
1H 6 6.000
OE 6 6.000
SD 6 6.000
AH 6 6.000
G 6 6.000
2FE 6 6.000
AO 6 6.000
AD 6 6.000
4 3MBA 7 7.000
3M1B 7 7.000
HE 7 7.000
1H 7 7.000
OE 7 7.000
SD 7 7.000
AH 7 7.000
G 7 7.000
2FE 7 7.000
AO 7 7.000
AD 7 7.000
Total 3MBA 20 20.000
3M1B 20 20.000
HE 20 20.000
1H 20 20.000
OE 20 20.000
SD 20 20.000
AH 20 20.000
G 20 20.000
2FE 20 20.000
AO 20 20.000
AD 20 20.000
x Estadsticos del grupo. Continuacin
APNDICES
__________________________________________________________________
369
Resumen de las funciones cannicas discriminantes
Funcin Autovalor % Varianza
explicada
% Varianza
acumulada
Correlacin
cannica
1 76.668 88.1 88.1 .994
2 7.527 8.7 96.8 .940
3 2.803 3.2 100.0 .859
x Autovalores. Varianza explicada, varianza acumulada y correlacin cannica
Contraste de
las funciones
Lambda de
Wilks
Chi-cuadrado gl Sig.
1 a la 3 .000 90.062 33 .000
2 a la 3 .031 40.008 20 .005
3 .263 15.362 9 .081
x Lambda de Wilks
Funcin
1 2 3
3MBA .737 -.316 .616
3M1B .612 -.183 .081
HE .345 -2.461 .543
1H -.289 -.690 .056
OE 1.056 2.256 .239
SD -.758 .091 1.414
AH .918 1.359 .576
G -.873 -.626 -.167
2FE .390 .308 -.905
AO .022 -.167 -.674
AD 1.330 1.106 -.117
x Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes cannicas
Funcin
1 2 3
AD .404 -.060 .040
HE .322 -.243 .185
OE .191 -.065 .116
2FE .005 .258 .096
x Matriz de estructura. Correlaciones intra-grupo combinadas entre las variables
discriminantes y las funciones discriminantes cannicas tipificadas Variables
ordenadas por el tamao de la correlacin con la funcin
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
370
Funcin
1 2 3
A3M1B .128 -.238 .089
AH .058 .223 .101
G .123 -.158 .120
3M1B .030 .118 .069
1H .013 -.045 -.018
SD -.119 .151 .492
AO .142 -.215 -.253
x Matriz de estructura. Continuacin
Funcin
VINO 1 2 3
1 10.856 4.269 -1.269
2 10.534 -3.274 .960
3 -5.783 -1.410 -1.808
4 -5.715 1.250 1.545
x Funciones en los centroides de los grupos
Estadsticos de clasificacin
Previas Casos utilizados
en el anlisis
VINO No ponderados Ponderados
1 .250 3 3.000
2 .250 4 4.000
3 .250 6 6.000
4 .250 7 7.000
Total 1.000 20 20.000
x Probabilidades previas para los grupos
Procesados 20
Excluidos Cdigo de grupo perdido o fuera de rango 0
Perdida al menos una variable discriminante 0
Usados en los
resultados
20
x Resumen del proceso de clasificacin
APNDICES
__________________________________________________________________
371
Mapa territorial
(Asumiendo que todas las funciones excepto las dos primeras son = 0)
Discriminante cannico
Funcin 2
-12.0 -8.0 -4.0 .0 4.0 8.0 12.0
12.0 41
41
41
41
41
41
8.0 41
41
41
41
41
41
4.0 41 *
41
41
41
* 41
411111111111111111111111
.0 4444444444444444444444444 422222222222222222222222
33333333333333333333333334444444444442
* 3333333333332
32
32
32 *
-4.0 32
32
32
32
32
32
-8.0 32
32
32
32
32
32
-12.0 32
12,0 42 21
42 21
42 21
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
378
42 21
42 21
42 21
8,0 42 21
42 21
42 21
42 21
42 21
42 21
4,0 42 21
442 21
44332 21
4433 32 21
4433 32 21
* 4433 32 21
,0 4433 32 * 2*
4433 32 21
4433 * 32 21
4433 32 21
4433 32 21
4433 32 21
-4,0 4433 32 21
4433 32 21
4433 32 21
4433 32 21
4433 32 21
4433 32 21
-8,0 33 32 21
32 21
32 21
3221
321
321
-12,0 31
15,0 23
23
23
23
23
23
10,0 23
2 23
122 23
1122 23
1122 23
1122 23
5,0 1122 23
1122 23
1122 * 23
11222 23
11122 23
1122 23
,0 * 1122 23 *
11222222222222222223
1114444444444444443
111444 43
11444 43
11144 43
-5,0 111444 43
11444 * 43
11144 43
111444 43
111444 43
1444 43
-10,0 4 43
43
43
43
43
43
-15,0 43
APNDICES
__________________________________________________________________
401
12,0 43
43
43
43
43
43
8,0 43
43
43
4 43
1444 43
1114444 43
4,0 1111444 * 43
1114444 43
1111444 43
1114444 43
11114444 43
1122444444 43
,0 122 22222244444443
11* 22222243 *
122 * 23
112 23
1122 23
122 23
-4,0 112 23
122 23
112 23
122 23
112 23
122 23
-8,0 112 23
122 23
12 23
2 23
23
23
-12,0 23