Amplificacin de DNA in vitro: PCR (Polymerase Chain Reaction)

Laboratorio de Gentica BIOL 3300L

Objetivos
Conocer:

Los fundamentos de la tcnica de amplificacin de DNA por PCR Usos y aplicaciones del PCR Ventajas y desventajas del PCR Mtodos de secuenciacin de DNA

PCR Polymerase Chain Reaction

Es

la amplificacin de DNA in vitro por medio de la polimerizacin en cadena de DNA utilizando un termociclador. propsito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA. realiza la amplificacin de un segmento especfico de DNA, teniendo poco material disponible.

El

Se

Polimerasa Chain Reaction: Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en 1987. Gan el premio Nbel de Qumica en 1993 por su invento. Utilizo el PCR para amplificacin del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

Termociclador
La

PCR se realiza en un Thermo Cycler Termociclador.

Es

una mquina que calienta y enfra la reaccin en periodos cortos de tiempo.

El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces o ms:

1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. -Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma-

2. Apareamiento o anneling: Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores segn sea el caso.

3. Polimerizacin o Extensin. Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde Se efecta a 70C por 1 minutos (puede variar segn sea necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

En el PCR hay una amplificacin exponencial

Reactivos necesarios para PCR:

Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2. MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la funcin de la polimerasa dNTPs (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. -La concentracin de dNTPS, es proporcional al tamao del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos ms concentracin de dNTPS para el de 5500pb. -Generalmente, se usa una concentracin de 200M de cada uno.

Reactivos necesarios para PCR:

Cebadores primers: Son secuencias cortas de nucletidos 20-24 nucletidos de longitud, complementarias a una regin del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentracin de 1MDNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucletidos de longitud. El mnimo va de 10-100 ng. y el mximo entre 400-500 ng. Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reaccin.

ADYUVANTES DE LA PCR

Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Se usa DMSO, glicerol o BSA. El adyuvante ms utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como una protena captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa

Polimerasa

En un principio, la polimerasa de DNA que

se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo que haba que aadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

Se

reemplazo la enzima por la de la bacteria Thermus aquaticus conocida como Taq pol

Anlisis de la Muestra

La deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico. Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

Anlisis de la Muestra
La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecficos se pegan a varios sitios)

Anlisis de la Muestra

En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas Hibridacin, Southern Blot

Se puede amplificar directamente de:

ADN genmico cDNA (RT-PCR)

Aplicaciones Deteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros
Anlisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, anlisis de fsiles

Mutagnesis dirigida (cambios en la informacin contenida a travs de primers con mutaciones)

Investigacin forense Pruebas de paternidad

Aplicaciones
Criminalstica

Ejemplo de un caso de criminalstica resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se observan los patrones bandas podr comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil gentico de la vctima (V)

Utilidad del PCR

Ventajas del PCR

A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y anlisis. Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto. Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense, diagnsticos, anlisis prenatales, etc.

Desventajas del PCR

Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb. Se necesitan primers especficos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)

Materiales Para PCR

Termociclador Thermo cycler

ADN molde (ADN en estudio) Primer Forward y Reverse dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP de [25 M] c/u) 10X buffer para PCR (Solucin amortiguadora para PCR) MgCl2 (25 mM) BSA Polimerasa Taq

Microcentrfuga

Micropipetas de 2, 20 y 200 ul Microtubos para PCR, estriles Puntas estriles Agua destilada, desionizada y estril

Fenotipo Puertorriqueo

Herencia del DNA mitocondrial

Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de 16571 pares de bases: Hebra pesada (H), Hebra liviana (L). Primer Directo H34, primer reverso L15829

Procedimiento para extraccin del DNA genmico (previamente realizado)

Se realiz un frotis bucal El contenido del hisopo swab se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9% Centrifugar por 5 minutos a 7K Descarta sobrenadante Resuspender el precipitado pellet en 500ul de chelex al 10% Incubar a 100C por 20 minutos Centrifugar por 5 minutos a 7K Tomar el sobrenadante ( DNA en solucin) Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella

Nota: El chelex acta como agente desestabilizador de membranas y quelante.

Diagrama de la extraccin del DNA genmico (previamente realizado)

Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)

Aada los siguientes reactivos en el orden indicado: Cantidad (ul) 10.3 3.0 0.5 1.5 1.0 1.0 Componente Agua estril (dH2O) MgCl2 25mM BSA 100X 2.5 Mm de dNTPs Primer H34. 5-3 Primer L15829. 3-5 Buffer 10X Taq pol DNA en estudio

Mix 1 17.3

Mix 2 2.7

2.5 0.2 5.0

Total: 25 ul

Condiciones para reaccin en el termociclador:

1 ciclo : 94C por 2.5 minutos. 32 ciclos: 94 C por 30 segundos 54 C por 1 minutos 72 C por 70 segundos 1 ciclo: 72 C por 10 minutos Lleve a reaccionar en el termociclador.

Secuenciacin de DNA
Mtodo enzimtico de terminacin de cadena (mtodo dideoxi de Sanger) Polimerizacin interrumpida de ADN Se lleva a cado polimerizacin de ADN en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerizacin en diferente momento, obtenindose fragmentos de diferente tamao. Se examinan en electroforesis, se lee secuencia directamente del gel

Mtodo dideoxi de Sanger

Mtodo dideoxi de Sanger (2)

Mtodo dideoxi de Sanger (3)

Mtodo secuenciacin automtica

Electroferograma de la secuenciacin automtica

Geles de secuencia

Secuencia automtica

Secuencia Manual

Direcciones de animaciones
Direccin PCR http://www.sumanasinc. com/webcontent/anisamples/molecularbiolog y/pcr.html Direccin de secuenciacin http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03EstructuraDelGenoma/animaciones/secuenci a.swf