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BIOL 3010L Laboratorio # 10 Extraccin de DNA

INTRODUCCIN:

El cido desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la molcula que guarda el cdigo gentico de todas las clulas. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehculo de su cdigo gentico. Muchas de las tcnicas de biologa molecular incluyen algn tipo de manipulacin del material gentico. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el conocimien-to del cdigo gentico, que ya es posible clonar organismos enteros. Los procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podan pasar varios das antes de saber con certeza que se haba logrado obtener DNA en calidad y cantidad suficiente para poder manipularlo. Adems algunos de los reactivos usados para estos procesos son txicos y mutagnicos. Hoy da podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en unas horas. Durante el laboratorio de hoy estaremos utilizando un mtodo rpido para aislar DNA a partir de tejidos animales. Este se llama "DNeasy Tissue Kit" y es producido por QIAGEN. Este usa tecnologa avanzada de membranas de silicato para purificar rpidamente DNA celular total sin usar extracciones orgnicas ni precipitacin con etanol. El sistema permite una lisis directa seguida de fijacin selectiva de DNA a la membrana. Los contaminantes e inhibidores enzimticos son removidos por centrifugacin. Luego de la lisis, el procedimiento toma unos 20 minutos. La lisis se logra usando proteinasa K. Luego se ajusta el pH con amortiguadores para lograr mxima fijacin de DNA a la membrana, durante una corta centrifugacin. Los contaminantes restantes son removidos en dos lavados y el DNA es eludo en agua o amortiguador. El resultado es DNA listo para usar. El tamao de los fragmentos de DNA obtenidos varan entre los 0.1 a 50 kb, predominando fragmentos de ~ 30 kb de largo. Estos pueden ser usados para PCR (reaccin en cadena de polimerasa), Southern Blotting, RFLP ( para determinar presencia de genes marcadores, tipificacin de tejidos), etc. La cantidad mxima de tejido para lograr aislar DNA vara, dependiendo del tipo de dicho tejido. En caso de los tejidos animales, la cantidad mxima es de 25 mg. Si se usa bazo, se reduce a 10 mg porque este tejido es extremadamente denso. Si se usan cultivos microbiolgicos, deben usarse durante la fase temprana de crecimiento

logartmico a una concentracin no mayor de 2 x 109 unidades formadoras de colonias (cfu) en caso de bacterias y de 5 x 107 cfu en caso de levaduras.

MATERIALES:

Papel para pesar Balanza analtica Bistur Palillos de dientes Tubos de microcentrfuga Microcentrfuga Bao a 55C Bao a 70C Etanol absoluto helado

PROCEDIMIENTO:

1. A. Corte y pese 25 mg de tejido (hgado, timo) en pedazos pequeos, depositar en un tubo de centrifuga de 1.5 ml, y aadir 180 l Buffer ATL. O, en su lugar: B. Raspe el epitelio bucal con un palillo de dientes y deposite las clulas sobre papel para pesar y verifique el peso de la muestra. Eche en microtubo y aada 180 l de Buffer ATL. Asegurarse que la cantidad correcta de material se utilize. Para tejidos como el bazo, con un nmero alto de clulas para una masa determinada de tejido, no utilizar ms de 10 mg del material.

2. Aadir 20 l de proteinasa K, mezclar por vortex, e incunbar a 55 C hasta que el tejidoeste completamente lisado. Mezclar por vortex ocasionalmente durante el periodo de incubacin para dispersar la muestra. El tiempo de lisis varia dependiendo del tejido que se utilize. Lisis usualmente se completa de 1 a 3 hrs. Si es ms conveniente, las muestras pueden dejarse lisando hasta el otro da. Luego de la incubacin, el lisado puede parecer viscoso pero no debe estar gelationoso ya que puede tapar la columna "DNeasy spin". Si esto sucede hay que lisar de nuevo, usando esta vez menos material 3. Opcional: Tratamiento de la muestra con Rnasa. Aadir 4l de RNasa A (100 mg/mL), mezclar por vortex e incubar por 2 minutos a temperatura ambiente. Tejidos que estan activos transcripcionalmete tal como el hgado y los riones continen niveles altos de RNA, que copurifican con el DNA genmico. Este paso es necesario si se requiere DNA libre de RNA . Este paso se puede omitir si el RNA residual no es de importancia. 4. Vortex por 15 s. Aadir 200 l de Buffer AL a la muestra, mezclar completamente por vortex e incubar a 70 por 10 min. Es esencial que la muestra y el Buffer AL sean mezclados inmediatamente y completamente por vortex o pipeteando para obtener una solucin homognea. Un precipitado blanco se puede formar cuando se le aada el buffer AL. En la mayora de los casos este se disuelve durante la incubacin a 70 C. El precipitado no interfiere con el procedimiento de Dneasy. Algunos tejidos ( baso, pulmones) podran formar un lisado gelationoso luego de aadir el Buffer AL. En estos casos, batir vigorosamente o hacer vortex antes de aadir el etanol en el prximo paso. 5. Aadir 200 l de etanol absoluto (96 - 100%) a la muestra, mezclar completamente con el vortex. Es muy importante que el Buffer AL, y el etanol sean mezclados hasta obtener una mezcla homognea. Un precipitado blanco se puede formar cuando se aada el etanol. Este contiene el DNA de la muestra. Es esencial que se aada todo el precipitado a la columna DNeasy spin. 6. Pipetear la mezcla del paso 5 dentro de la columna DNeasy spin que se encuentra en un tubo de recoleccin de 2 mL. Centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) por 1 min. Descartar lo que pas por la columna y el tubo de recoleccin. 7. Colocar la columna de DNeasy spin en otro tubo de recoleccin de 2 mL, aadir 500l Buffer AW1, y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm) Descartar lo que pas por la columna y el tubo de recoleccin.

8. Colocar la columna de DNeasy spin en otro tubo de recoleccin de 2 mL, aadir 500 l de Buffer AW2, y centrifugar por 3 minutos a velocidad mxima para secar la membrana del Dneasy. Descartar lo que pas por la columna y el tubo de recoleccin. Esta centrifagacin asegura que no quede nada de etanol residual. Luego del paso de centrifugacin, remover la columna de Dneasy spin, cuidadosamente para que esta no tenga contacto con el tubo de recoleccin, ya que esto causara que se contaminara con etanol. ( Si se contamina, vaciar el tubo de recoleccin y reusarlo en otro paso de centrifugacin por 1 min a velocidad mxima. 9. Colocar la columna de DNeasy spin en un tubo de microcentrfuga limpio de 1.5 - 2 mL y pipetear 200 l de Buffer AE directamente a la membrana de Dneasy. Incubar a temperatura ambiente por 1 min, y luego centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rmp) para eluir. Eluir con 100 l (en vez de 200 l) aumenta la concentracin final de DNA en el eludo, pero tambin disminuye la cantidad de DNA que se obtiene. 10. Repetir la elucin como descrita en el paso 9. Un nuevo tubo de microcentrfuga puede ser utilizado para el segundo paso de elucin para prevenir la dilucin del primer eluido. En la segunda elucin, el tubo de microcentrfuga del paso 9 puede ser utilizado para combinar los eluidos.

Nota: No deben ser eluidos ms de 200 l a la vez a un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL ya que la minicolumna de DNeasy puede tener contacto con el eluido.

11. Determinar el rendimiento de DNA obtenido. a. Diluir 20 l de muestra de DNA en 980 l de agua desionizada y esteril (dilucin 1/50)

b. Medir absorbancia a 260 nm usando cuvetas de 1 ml, que puedan usarse a luz ultravioleta. c. La concentracin de DNA a A260 = 1.0 en una cuveta de 1 cm equivale a 50 g de DNA por ml de agua. Para calcular la concentracin de la muestra: [DNA] = 50 g / ml x A260 x factor de dilucin (50)

[DNA total] = [DNA] x volumen eludo en ml

12. Guardar el DNA obtenido para usar en el siguiente laboratorio.