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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN-ADSORCIÓN MOLECULAR

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN-ADSORCIÓN MOLECULAR

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CROMATOGRAFÍA

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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓNADSORCIÓN MOLECULAR Y DE FILTRACIÓN POR GEL

Conceptos Básicos
 LA SORCIÓN O ADSORCIÓN:

es la transferencia selectiva de uno o más solutos de una fase fluida a un lote de partículas sólidas.  La selectividad común de un sorbente entre el soluto y el fluido portador o entre varios solutos, hace posible la separación entre ciertos solutos presentes en el fluido portador o entre sí.
CROMATOGRAFÍA 2

Conceptos Básicos
 ADSORCIÓN:

los adsorbentes son materiales naturales o sintéticos de estructura amorfa y microcristalina altamente poros con áreas internas muy grandes por unidad de volumen.  Adsorbentes: carbón activado, alúmina activada, gel de sílice, tierra de fuller, otras arcillas y mallas moleculares.  La adsorción es causada por lo general por las furzas intermoleculares (furezas de Van der Waals)a temperartura ordianria, ADSORCIÓN FÍSICA O FISIOSORCIÓN.
CROMATOGRAFÍA 3

Conceptos Básicos
 A temperaturas más elevadas ( arriba,

aproximadamente,de 200 a 400 °F) se dispone de la energía de activación necesaria para hacer o romper las uniones químicas QUIMIOSORCIÓN.  Elución: es un proceso en el cual los solutos son lavados a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil.
CROMATOGRAFÍA 4

Conceptos Básicos
 Eluyente: es un disolvente que se usa para

llevar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria.

CROMATOGRAFÍA

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51 0. NEW YORK. DEKKER.56 0.25 0.30 0.Conceptos Básicos DISOLVENTE POTENCIA ELUYENTE E -0.01 0.63 FLUOROCARBONOS CLOROFORMO METILETILCETONA N-PENTANO ETER DE PETROLEO ACETONA DIETILETILAMINA CICLOHEXANO TETRACLORURO DE CARBONO CLORURO DE n-PROPILO 0.82 0. 1968 CROMATOGRAFÍA 6 .R. SNYDER.40 0.95 BENCENO L.32 PIRIDINA n-PROPANOL METANOL 0.00 0.71 0.04 DISOLVENTE POTENCIA ELUYENTE E 0.18 0. PRINCIPLES OF ADSORPTION CHROMATOFRAPHY.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA  Se utiliza un tubo de vidrio con un diámetro de alrededor de 10 a 50 mm que sostiene una columna de partículas sólidas las cuales constituye la fase estacionaria CROMATOGRAFÍA 7 .

PROCESO CROMATOGRAFÍA 8 .

 La cromatografía en gel se efectúa en una columna por el método de elución. por la menos en parte.CROMATOGRAFÍA EN GEL  Es una técnica en la que el fraccionamiento se basa. CROMATOGRAFÍA 9 .  Recibe varios nombres: permeación en gel. cromatografia de exclusión y cromatografia de tamizado. en el tamaño y la forma molecular de las especies de las muestras.

CROMATOGRAFÍA EN GEL  El grado de retardo depende del grado en que las moléculas o iones de soluto pueden penetrar en aquella parte de la fase de la solución que se mantiene dentro de los poros del material de empaque. CROMATOGRAFÍA 10 . que es un gel muy poroso.

CROMATOGRAFÍA EN GEL  Las moléculas o iones mayores que los poros del gel son completamente excluidos del interior. CROMATOGRAFÍA 11 . mientras que las especies monores pueden penetrar en esta región más o menos libre.

CROMATOGRAFÍA EN GEL CROMATOGRAFÍA 12 .

CROMATOGRAFÍA 13 .ASPECTOS DIFERENCIALES DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO CON RESPECTO A OTRAS MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA.

casi nunca se trabaja con gradiente de elución. 2) Teóricamente no existe interacción química ni fisico-química soluto-fase estacionaria.1) La fase estacionaria actúa de soporte inerte. aportando solo una porocidad controlada que retiene la fase móvil estancada. 4) Las características de la fase móvil no constituyen un factor decisivo en la descriminación entre los solutos. CROMATOGRAFÍA 14 . 3) El mecanismo de retención o retraso es atípico y se establece por entropía más que por entalpía.

6) La muestra solutos no sufren alteraciones por interacciones químicas irreversibles o cuasireversibles al pasar por la columna. es decir. con propiedades favorables para reducir solapamientos y facilitar la detección. CROMATOGRAFÍA 15 . sustancias poliméricas de amplio rango de pesos moleculares. 7) Debido a que las fuerzas de retención son bajas los picos cromatográficos son estrechos. 8) Los solutos son.5) La columna no se desactiva debido a su carácter fisico-químico inerte. en general.

10) Una de las propiedades de gran interes es la determinación de pesos moléculares y distribución de los mismos en mezclas complejas poliméricas. CROMATOGRAFÍA 16 . que posterirmente pueden ser cromatografiados por otras modalidades de la cromatografía de alto rendimiento (HPLC). a excepción de la de afinidad.9) El empleo de la modalidad de baja presión (configuración clásica) es mucho mas frecuente que en otras alternativas de la cromatografía líquida en columna. 11) Es una metodología muy útil para fraccionar en grupos de mezclas complajas de solutos.

CROMATOGRAFÍA 17 .  El sólido resultante contiene una gran cantidad de disolvente fijo en los intersticios de la red polimérica.CROMATOGRAFÍA EN GEL  Empaque de la columna: la fase estacionaria en la cromatografía de columna consiste en partículas esféricas de un polímero poroso que absorve facilmente el agua y se hincha a consecuencia de ello.

por otra parte. CROMATOGRAFÍA 18 .EMPAQUE DE LA COLUMNA El concepto de fase estacionaria es vago en cromatografía de exclusión por tamaños. el sólido poroso de la estructura de gel ejerce una influencia decisiva a través del tamaño del poro y. hay que considerar la fase móvil estancado en el volumen Vi que puede considerarse en el sentido laxo una fase estacionaria líquida. Por una parte.

en forma de pequeñas esferas. que debe reunir para alcanzar los objetivos básicos de la separación en cromatografía de exclusión por tamaño: 1) Uniformidad en el tamño de partícula. 2) Uniformidad en el tamaño de poro. 4) Estabilidad química( cambios de pH. 3) Asequibilidad de materiales con un grado my diferente de porosidad.EMPAQUE DE LA COLUMNA Las características ideales de un material poroso. insolubilidad en disolventes órgánicos). temperatura. CROMATOGRAFÍA 19 .

7) Resistencia mecánica cuando se trabaja en la modalidad CLAR. CROMATOGRAFÍA 20 . 6) Preparación previa sencilla y rápida.EMPAQUE DE LA COLUMNA 5) Máxima inercia frente a los solutos-analitos para evitar alteraciones que afecten la separación basada en en los diferentes tameños.

CROMATOGRAFÍA 21 . sintéticos y combinados.  Según su microestructura: aerogeles (en cuyos poros puede penetrar el aire).  Según la felxividad de su estructura: hinchables y rígidos. xerogeles y mixtos aero-xerogeles.  Según su origen: naturales.EMPAQUE DE LA COLUMNA Calsificacion de los materiales:  Según su naturaleza: orgánicos e inorgánicos.

 Los geles orgánicos tienen. CROMATOGRAFÍA 22 . Disponibles en el comercio como bio-glas. CPG y parasil. agarosas y poliestirenos. generalmente. La porosidad es de 7-300 nm. dextranos.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles inorgánicos son aerogles y tienen estructura rígida de naturaleza silícia. una estructura polimérica entrecruzada. Existen cuatro tipo fundamentales: poliacridamidas. El rango de pesos moleculares esta comprendido entre 1E 03 y 1E 07.

 Haciendo variar la cantidad de epiclorhidrina en el polímero. CROMATOGRAFÍA 23 .EMPAQUE DE LA COLUMNA  Uno de los polímeros más usados se prepara por entrecruzamiento del polisacárido dextrano con epiclorhidrina (nombre comercial de Sephadex). se obtiene una serie de resinas con diferentes tamaños de poro.

con agua irviendo este intervalo es de 1 a 5 horas. CROMATOGRAFÍA 24 .EMPAQUE DE LA COLUMNA  A temperatura ambiente. el tiempo de inchamiento oscila entre 3 horas (menos poroso) y 3 días (más poroso).

6 0.9 2 4 5 6 6 9 1500 5 000 10 000 50 000 100 000 150 000 200 000 25 PHARMACIA FINE CHEMICALS.5 2.9 LÍMITE DE EXCLUSIÓN APROXIMADO PESO MOL 700 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200 0.PROPIEDADES DE LOS GELES SEPHADEX DESIGNACIÓN DEL GEL G-10 RALACIÓN DE VOLUMEN (ml/g DE GEL ORIGINAL) Vg 0.5 5 7 10 15 20 0.6 Vi 1.0 Vo 0. SUECIA CROMATOGRAFÍA .5 1 1 1 1 1 1.

Debe incharse previamente a su uso durante un tiempo que oscila entre 2 horas y un día a temperatura ambiente. CROMATOGRAFÍA 26 . cuya concentración en la mezcla sintética inicial determina la porosidad.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles de poliacridamida(biogeles) se obtiene por copolimerizción de la arcilamida (CH2=CHCO-NH2) con la N.N’-metil-bis-acrilamida como agente entrecruzante.

000-50.000.000 10.000 500-4.000 20.0 m 50.000.000 80.000-5.TIPO POLICRILAMIDA (BIOGELES) P-2 P-4 P-6 P-10 P-30 P-60 P-100 P-150 P-200 P-300 RANGO DE FRACCIONAMIENTO PESO MOLECULAR 200-2.000 100.000-400.000 40.0 m 1.000.000-5.000-50.000 25.000-70.000 50.000.000 50.000 6.000.000 2.000 30.000.000 AGAROSA 0.000-700.000 POLIESTIRENO (ESTIRAGLES) 60 100 400 1 E 03 5 E 03 10 E 03 30 E 03 1 E 05 3 E 05 5 E 05 10 E 05 800 2.0 m 5.000 8.000-300.0 m 150 m 10% 8% 6% 4% 2% 10.000 100.000 500.000 200.000 100.000-17.0 m 15.5 m 2.000.000-2.000-250.000.000 10.5 m 1.000 CROMATOGRAFÍA 27 .000 10.000 20.000-150.000.000-100.000 600.000 1.000 5.000-15.000 20.000 200.000-150.000-1.000.

Se caracteriza por su gran porosidad. b) el pH de la fase movil debe estar comprendido entre 6 y 8. La diferencia de porosidad se obtiene a partir de disoluciones con difeerentes concentraciones de agarosa.  Un inconveniente importante de los mismos es su inestabilidad: a) no puede emplearse a temperaturas superiores a 30°C. su estructura reticular se debe a los enlaces de hidrógeno entre cadenas poliméricas naturales.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles de agarosa son de tipo natural. CROMATOGRAFÍA 28 . que no puede obtenerse con otros tipos de geles.

CROMATOGRAFÍA 29 . b) tienen una estructura muy rígida lo que los hace especialmente adecuados para trabajar a alta presión (CLAR).  Los geles de poliestireno (styragles) son polímeros sintéticos derivados del estireno con divinilbenceno como agente entrecruzante.EMPAQUE DE LA COLUMNA  C) son sensibles a ciertos agentes químicos como el borato. Presentan dos caracteristicas importantes: a) permiten cromatografiar sustancias con un amplio rango de peso molecular. que interactuan con los grupos hidroxilo rompiendo la estructura entrecruzada.

CROMATOGRAFÍA 30 .EMPAQUE DE LA COLUMNA  Tienen el inconveniente de facilitar las retenciones no específicas debido a fenómenos de adsorción. en especial con proteinas.

TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL  Volumen total de la columna rellena con un gel hinchado en agua (u otro disolvente) está dado por: Vt = Vg + Vi + Vo donde: Vg volumen ocupado por la matriz sólida del gel. Vo volumen libre correspondientes a los intersticios de las partículas porosas. CROMATOGRAFÍA 31 . Vi volumen interno de las partículas porosas que contienen la fase móvil estancada.

TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL En este tipo peculiar de cromatografía. la retención se basa en la distirbución del soluto entre dos fases móviles miscibles: la externa y la interna o estancada. por ello. el volumen de elución será menor o igual que el volumen vacío (Ve<Vt). por lo que el concepto de retención es muy diferentes. Una separación se completa cuando un volumen de fase móvil equivalente al volumen total ha pasado a través de la columna. CROMATOGRAFÍA 32 .

y el volumen interno de los poros. CROMATOGRAFÍA 33 .TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL Para caracterizar el comportamiento de un soluto en una columna de exclusión por tamaño se utiliza el denominado coeficiente de partición: KAV = Ve – VO Vi Este se define como la ralación de la diferencia entre los volumenes de elución e intersticial.

La concentración del soluto dentro de los poros en la fase móvil estancada decrece al aumentar el tamaño del soluto. por lo que su valor decrecerá al aumentar el peso molecular del mismo.TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL Este coeficiente de partición corresponde a la relación entre las concentraciones medias del soluto en la fase móvil dentro (Ci) y fuera (Co) del material poroso (KAV = Ci/Co). CROMATOGRAFÍA 34 .

Caundo KAV = 1. el soluto es totalmente excluido. Cuando su valor es nulo. por lo que el volumen de elución coincide con el intersticial ( Ve = Vo ). por lo que el volumen de elución conincidirá con el volumen total de la fase móvil de la columna de exclusión (Ve = Vo + Vi + Vt).El valor del coeficiente de partición oscila entre 0 y 1. Se define el límite de exclusión como el tamaño mínimo (peso molecular mínimo) para que el soluto sea excluido . el soluto tiene la máxima penetrabilidad (movilidad) entre los poros. CROMATOGRAFÍA 35 .

Vo y Vt son los volumenes límites entre los cuales debe situarse los volumenes de elución de la mezcla de analitos-solutos.Así pues. CROMATOGRAFÍA 36 .

CROMATOGRAFÍA 37 .

en ausencia de interacciones adicionales. CROMATOGRAFÍA 38 . al contrario la amplia variabilidad de otras constantes que rigen otros procesos cromatográficos.La cromatografía de exclusión por tamaño es más restringida que otras modalidades de cromatografía en columna. la variación del coeficiente de partición está restringido entre 0 y 1. lo que básicamente se debe a que.

Debido que las substancias de alto peso molecular tienen coeficientes de difusión muy bajos. la contribución a la difusión longitudinal puede prácticamente despreciarse. CROMATOGRAFÍA 39 . la altura equivalente de plato teórico se debe exclusivamente a la dispersión del soluto en la fase móvil interna o estancada y la trasferencia de materia entre las dos fases móviles internas y externa.TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL En este tipo de cromatografía.

TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL CAPACIDAD DE PICOS EN DISTINTOS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA NÚMERO MÁXIMO DE PICOS EN CROMATOGRAFÍA PLATOS TEÓRICOS GASES LIQUIDA EXCLUSIÓN 400 21 13 5 2500 51 31 11 10000 101 61 21 CROMATOGRAFÍA 40 .

CROMATOGRAFÍA 41 .CROMATOGRAFÍA POR GEL VOLUMEN DE ELUCIÓN:  Para moléculas de tamaño intermedio es : Ve = Vo + KAV(Vi)  Para moléculas demasiado grandes para penetrar en los poros de gel: KAV = 0 y Ve = Vo  Para moléculas de que pueden entrar en los poros sin obstáculos KAV = 1 y Ve = ( Vo + Vi ).

para solutos que actúa entre sí y que pueden penetrar libremente en los poros.CROMATOGRAFÍA POR GEL  Esto con el supuesto de que no hay interacción. aumentaría la cantidad de soluto retenido en los intersticios. KAV sería mayor que la unidad. por ejemplo como adsorción. CROMATOGRAFÍA 42 . En caso contrario. entre las moléculas del soluto y la superficie del gel.

Fuerza iónica.  En relación con la fase móvil: Caudal. Porosidad.FACTORES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN  Relación con el material cromatográfico: Tamño de partícula. pH CROMATOGRAFÍA 43 . Viscocidad. Temperatura.

Empaquetamiento. Cantidad o concentración. CROMATOGRAFÍA 44 . Configuración espacial.  En relación con la columna cromatográfica: Longitud.FACTORES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN  En relación con la muestra: Peso molecular.

CROMATOGRAFÍA 45 . de moléculas de productos naturales de alto peso molecular.  En geles muy entrecruzados con tamaños de poro pequeño. como Sephadex G-25 y G-50 han encontrado amplia aplicación a la desalación o eliminación de moléculas de bajo peso molecular.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.

) CROMATOGRAFÍA 46 . glicina.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.(triptófano. albúmina sérica. hemogobina fibrinógeno.  Los geles Sephadex G-25 y G-50 han resultado útilies también para el fraccionamiento péptidos que tiene un tamaño intermedio entre algunas proteinas. tripsina. ribonucleasa.

CROMATOGRAFÍA 47 . ácidos nucleicos.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.  Las geles más porosos han encontrado una gran aplicación al fraccionamiento y purificación de macromoléculas como proteinas.  La cromatografía en gel es usada por los químicos de polímeros y los bioquímicos para la estimación de pesos moleculares de moléculas grandes. y polisacáridos.

En este caso. el volumen de elución de la incognita se conpara con los volúmenes de elución de una serie de compuestos estandar que tienen las mismas caracteristicas químicas.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL. CROMATOGRAFÍA 48 .

Por lo tanto. También se utiliza para la separación de aminoácidos y otros ácidos y bases inorgánicas. A diferencia de los demás métodos en columna.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas de intercambio iónico se encuentran entre los empaques más utilizados para la cromatografía de columna. la cromatografia de intercambio iónico es muy utilizada en química inorgánica. el disolvente es por lo general agua y las especies a separar son iones. CROMATOGRAFÍA 49 .

Muchas substancias. CROMATOGRAFÍA 50 . actúan como intercambiadores de iones. Entre las primeras se encuentran las arcillas y las ceolitas.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO El intercambio iónoico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de inones de signo igual entre una solución y un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. tanto naturales como sintéticas.

Las primeras tienen una aplicación más amplia. CROMATOGRAFÍA 51 .CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas sintéticas de intercambio iónico son polímeros de alto peso molecular que contienen gran números de grupos funcionales iónicos por moléculas. Para el intercambio de cationes se puede escoger entre resinas ácidas fuertes que contienen grupos de ácidos sulfónico ( RSO3-H+ ) y resinas ácidas débiles que contienen grupos de ácidos carboxilicos ( RCOOH ).

Estas son generalmente aminas.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas de intercambio de aniones contienen grupos funcionales básicos adheridos a la molécula del polímero. CROMATOGRAFÍA 52 . y los básicos débiles contienen aminas secundarias y terciarias. Los intercambiadores básicos fuertes contienen aminas cuaternarias (RN(CH3)3+OH-).

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Un proceso de intercambio catiónico se ilustra por el equilibrio: xRSO3 H   M x   RSO3 x M x   xH  Sólido solución sólido solución   Donde: Mx+ representa un catión R representa una parte de la molécula de resina. CROMATOGRAFÍA 53 .

CROMATOGRAFÍA 54 .CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO El proceso análogo en el que interviene una resina de intercambio de aniones típicas se escribe: xRN(CH ) OH  A  RNCH  3 3  x   3 3 x  A x  xOH  sólido solución sólido solución Donde Ax-es un anión.

ademas del fenómeno de intercambio de iones. se producen otros fenómenos: a) Adsorción por efecto de la matriz polimérica hidrocarbonada de la resina. b) Partición en sus dos modalidades: de fase invertida con una alta proporción de un disolvente orgánica en el interior de la resinade bajo entrecruzamiento.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Debe indicarse que la interacción entre el soluto orgánico y el material cambiador ( generalmente una resina de poliestireno) es muy compleja ya que. CROMATOGRAFÍA 55 .

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO c) Exclusión de iones. CROMATOGRAFÍA 56 . d) Intercambio de ligados entre un complejo catiónico retendo y los solutos-ligados a la fase móvil.

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