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Cuantificación de proteínas por el método de Bradford (BioRad) Método de valoración basado en el

Cuantificación de proteínas por el método de Bradford (BioRad)

Método de valoración basado en el cambio de absorbancia (466nm a 595nm) de una solución ácida de Coomassie Brillant Blue G250 (contenida en el reactivo de Bradford).

Material y Reactivos: Reactivo de Bradford (BioRad), patrones de BSA, tubos de 2.5 ml, cubetas de plástico, espectrofotómetro de UV/VIS, parafilm, papel absorbente.

Obtención de la recta patrón

- Diluir 1/5 el Reactivo Bradford (BioRad).

- Recta patrón: A partir del “stock” de BSA preparar cubetas con las concentraciones de BSA indicadas en la tabla siguiente:

Tubo

Volumen

Concentración

BSA

 

BSA

1

1 ml

0.5

µg/ml

2

1 ml

1 µg/ml

3

1 ml

2.5

µg/ml

4

1 ml

5 µg/ml

5

1 ml

10

µg/ml

6

1 ml

20

µg/ml

- Añadir a cada tubo 1 ml del Reactivo de Bradford, diluido 1/5. Mezclar por inversión.

- Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

- Traspasar el contenido del tubo en una cubeta de lectura. Mezclar por inversión y secar las paredes con papel absorbente.

- Realizar la lectura a 595nm, utilizando el auto cero con agua miliQ/desionizada. Anotar la absorbancia.

- Obtener la ecuación de la recta de regresión.

Plataforma de Proteòmica

Parc Científic de Barcelona Baldiri Reixac, 10-12 08028 Barcelona Tel. 93 403 46 53 Fax 93 403 72 06 E-mail: pproteomica@pcb.ub.es Web: http://www.pcb.ub.es/plataforma/proteomica

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Cuantificación de la muestra - Si “a priori” no se dispone de una estimación del

Cuantificación de la muestra

- Si “a priori” no se dispone de una estimación del contenido proteico de la muestra, habrá de preparar distintas diluciones a más del extracto directo.

- Siguiendo el esquema anterior, introducir en la cubeta de lectura, el volumen de muestra y ajustar con agua miliQ hasta 1 ml.

- Añadir 1 ml del Reactivo de Bradford, diluido 1/5. Mezclar por inversión y secar las paredes con un trozo de papel.

- Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

- Traspasar el contenido en una cubeta de lectura, mezclar por inversión y leer la absorbancia a 595nm.

- Calcular el contenido proteico en la muestra a partir de la ecuación de la recta patrón.

Se recomienda realizar por lo menos dos réplicas, tan por el cálculo de la corva patrón como para la cuantificación de la muestra.

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