Manual de Productos

Nidacin
1. La construccin de un nido, Nidus, como las aves. 2. Implantacin de un vulo fertilizado (Zigoto) y la construccin de un nido en el endometrio, la placenta.

Concepcin
1. La unin de los gametos masculinos y femeninos, del esperma y el huevo. 2. Una impresin o idea.

Contenido

Contenido
Introduccin Calidad .......................................................................................................................................... 4 Aseguramiento de la calidad .......................................................................................................................... 5 Vida til .................................................................................................................................................................................. 6 Empaque ............................................................................................................................................................................... 6 Composicin del producto ............................................................................................................................... 7 Productos Informacin pedidos ............................................................................................................ 8 Productos ................................................................................................................................................................... 9-12 Bases cientficas ........................................................................................................................................................ 13 Preparacin de gradiente de densidad ................................................................................. 14-15 SpeediKit........................................................................................................................................................................... 16 ProInsert ........................................................................................................................................................................... 17 Swim-up ............................................................................................................................................................................. 18 Congelacin de semen ............................................................................................................................ 19-21 ICSI .......................................................................................................................................................................................... 22 NidOil ................................................................................................................................................................................... 23 Vitrificacin y calentamiento de blastocistos .............................................................. 24-27 Tincin para vitalidad ........................................................................................................................................ 28 Tincin para morfologa ................................................................................................................................. 29 Referencias ..................................................................................................................................................................... 30 Contactos.......................................................................................................................................................................... 31

Introduccin Calidad

Introduccin
Nidacon International AB fabrica y vende productos mdicos principalmente para Tcnicas de Reproduccin Asistida (ART); IVF, ICSI e inseminacin intrauterina (IUI). La compaa fue fundada en 1996 por el Profesor Assoc. Paul V. Holmes MSc, PhD, DrMedSc, embrilogo y endocrinlogo del departamento de ginecologa y obstetricia de la Universidad Hospital Sahlgrenska en Gotemburgo Suecia. Nidacon considera muchos factores cuando disea sus productos. Nos concentramos en los pequeos detalles que nos ayuden a crear productos para obtener mejores resultados. Nuestro objetivo es trabajar en estrecha relacin con nuestros clientes, ellos son la piedra angular de nuestro departamento de investigacin. Nos enorgullecemos con el desarrollo de nuestros productos y aseguramos que respondan a las necesidades de nuestros clientes y colegas de investigacin. Todos nuestros productos son desarrollados en estrecha cooperacin con profesionales en los diferentes campos. Uno de los primeros productos originado por nuestro departamento de investigacin y desarrollo, PureSperm, fue lanzado al mercado en Noviembre de 1996. Ha venido ganando rpida aceptacin y se ha convertido en el lder del mercado global para el aislamiento y preparacin de esperma, en tcnicas de reproduccin humana asistida. Fue el primer producto de su categora en alcanzar tanto la acreditacin 510(k) por parte de US FDA como la marca CE con las autoridades europeas.

Calidad
Nidacon est certificada de acuerdo a SS-EN ISO 9001 (Implementado 2000-12-15) y SS-EN ISO 13485 (Implementado 2003-08-15). El sistema de gestin de calidad nos asegura un continuo desarrollo de la organizacin. Registramos nuestros productos de acuerdo a las normas vigentes y las necesidades en los distintos pases del mundo. Esto tambin garantiza nuestra alta calidad en el mercado y seguir siendo nuestra gua. Controles de esterilidad son realizados en cada uno de los lotes fabricados, los niveles de endotoxinas son medidos y pruebas de eficacia biolgica son llevadas a cabo. Los lotes son liberados para la venta, nicamente si cumplen ciertos criterios especficos.
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La intencin siempre de Nidacon es mantener una alta calidad de nuestros productos y, para lograr este cometido, todos nuestros lotes son probados en Nidacon antes de salir al mercado.

En cada lote se adjunta un certificado de control de calidad con los registros de las pruebas efectuados. Solamente usando este riguroso control nos aseguramos que cada lote cumpla con los estndares correctos. Por consiguiente, los clientes estarn seguros que nuestros productos son fiables y darn buenos resultados cuando se utilizan correctamente.

Aseguramiento de la calidad

Aseguramiento de la calidad
Anlisis fsicos pH probado en todos los lotes durante la produccin y despus de ser embotellado el producto a temperatura ambiente en aire. La osmolarida probada en cada lotes durante la produccin y luego que el producto es embotellado. Esterilidad y anlisis de toxinas Control de crecimiento microbiolgico Se realiza despus de la produccin de un lote para ver crecimiento de bacterias y hongos. Los ensayos se realizan en un perodo de 2-3 semanas con el fin de detectar cualquier crecimiento. Estos controles son llevados a cabo por el Laboratorio Bacteriolgico acreditado del Hospital Universitario Sahlgrenska, Gotemburgo, Suecia. Deteccin de endotoxinas Este anlisis se realiza por medio de un test FDA aprobado, Limulus Amoebocyte Lisado (LAL) utilizando un mtodo espectrofotomtrico cuantitativo con el fin de obtener valores reales con unidades de UE / ml, de acuerdo con la U.S. farmacopea. La prueba se realiza por el acreditado laboratorio de la microbiologa del Hospital Universitario Sahlgrenska de Gotemburgo, Suecia. Anlisis biolgico Prueba de esperma humano El ensayo de eficacia biolgica implica evaluacin de, rendimiento de la motilidad y viabilidad medido tanto subjetivamente como mediante el anlisis de esperma asistido por computadora (Hamilton Thorne, IVOS). Cada lote se prueba biolgicamente con muestras de semen humano. Las muestras se separan en dos partes, una parte se utiliza como control y el segunda parte se utiliza para la preparacin de los espermatozoides con los lotes nuevos. Los resultados se comparan con los resultados del control. El anlisis proporciona un recuento de los espermatozoides por ml, la actividad de los espermatozoides se clasifica como la actividad que es expresada como un porcentaje del total de esperma. Todos los datos se registran antes y despus de la separacin y purificacin, y se comparan con el control, es decir, utilizando un lote recientemente aprobado. Esperma humano prueba de supervivencia para aceite Los espermatozoides son preparados cubierto con aceite y se incuban durante la noche a 37C, CO2 5.6%. Porcentaje de espermatozoides mviles en el da 2. Ensayo de embriones de ratn (MEA) para las botellas, etc. se utiliza para evaluacin In vitro de crecimiento y desarrollo pre-implantacin de embriones expuestos a elementos de prueba. El ensayo predice la toxicidad del embrin en los medios, dispositivos mdicos o productos relacionados para ser utilizados en la tecnologa de reproduccin asistida (ART). Ensayo de fertilizacin in vitro de embriones de ratn para medios de IVF Una prueba sensible con la imitacin de un procedimiento de IVF. Este ensayo es la tcnica preferida para analizar las tcnicas de reproduccin asistida, suministrando datos de toxicidad en cuanto a la capacidad fecundante del gameto masculino y femenino y la capacidad de desarrollo embrionario. Anlisis de Perxido el nivel de perxido se mide utilizando un QuantiChrom ensayo de perxido. Es un mtodo mejorado que utiliza el cromgeno Fe3 +-xilenol reaccin naranja. Se forma un complejo de color prpura cuando el Fe2 + incluido en el reactivo se oxida a Fe3 + por la peroxidasa presentes en el muestra. El anlisis funcional / Prueba de eficacia se utiliza para probar la eficacia y la funcin de los productos. Control visual Control visual constante durante la produccin, llenado, etiquetado y control final de los empaques listos elegidos.

Vida til Empaque

Vida til
Nidacon es consciente de las necesidades de nuestros clientes y siempre trata de ofrecer productos que son convenientes. Estas conveniencias incluyen, fcil transporte y una larga vida til. Es por eso que los productos tienen una vida til entre uno y dos aos a temperatura ambiente. Todos los ingredientes son escogidos por su tolerancia a la temperatura y su estabilidad en solucin acuosa. Pruebas rigurosas de vida til se llevan a cabo en el laboratorio de Nidacon para garantizar que la estabilidad terica de las formulaciones de sal concuerde con la estabilidad actual cuando se combina con el producto

Empaque
El empaque de los productos de Nidacon, recibe el mismo cuidado y atencin en detalles como cuando se disea el producto. Botella; Para la mayora de nuestros productos hemos elegido vidrio de borosilicato en lugar de vidrio de silicato de sodio para evitar la filtracin de sodio desde las botellas en el contenido durante la larga vida til. La investigacin en nuestro laboratorio ha demostrado que suficientes iones de sodio se pueden filtrar desde una botella de silicato de sodio y tener un efecto negativo en el desarrollo de embriones de ratn de dos clulas. Por lo tanto evitamos la exposicin de todas las clulas a niveles elevados de iones de sodio en el producto utilizando empaque de vidrio de borosilicato. Tapones; Basndose en las pruebas de embrio-toxicidad de tres diferentes tapones de goma disponibles hoy comercialmente y aprobados para uso farmacutico, Nidacon eligi tapones de goma de silicona como material para los tapones. Encontramos que tanto los de goma de ltex natural y los de caucho butlico son txicos para embriones, obstaculizando el desarrollo y provocando tal vez muerte embrionaria. Los de caucho de silicona no tienen ningn efecto perjudicial, lo que permite el desarrollo embrionario y el hatching de forma normal. Por lo tanto los tapones para uso farmacutico hechos de caucho de silicona fueron elegidos para nuestros productos.

Esta conveniencia incluye la facilidad en el transporte y la larga vida til.

Composicin del producto

Fundamentos
Bajo circunstancias fisiolgicas normales, los espermatozoides sufren una serie de cambios en la maduracin despus de la eyaculacin que les permite negociar las diferentes secciones de tracto reproductor femenino y eventualmente localizar y fertilizar el vulo. Si los espermatozoides se van a utilizar para ART, es esencial que cualquier producto que se use para la capacitacin del semen, coincida con los requerimientos fisiolgicos del semen lo ms fielmente posible. Si los espermatozoides son estimulados en exceso, sobre todo inicamente, se vuelven hiperactivos, un proceso que da lugar a que los espermatozoides utilicen sus recursos energticos y mueran antes que la fertilizacin ocurra. Por lo tanto, el pH y la osmolaridad de las soluciones de espermatozoides deben ajustarse muy especficamente para evitar el shock inico y posteriores hiperactivaciones.

Antibiticos
Los antibiticos no estn incluidos en nuestros productos por varias razones. La penicilina G es el antibitico ms usado en los medios de cultivo pero solo dura unos 10 das en solucin acuosa, siendo inactivada despus de ese tiempo y los productos de degradacin son txicos celulares. Adems este antibitico no es eficaz contra algunas de las bacterias ms comnmente encontradas en el semen. La estreptomicina y la gentamicina son citotxicas. La gentamicina en particular, se ha demostrado que es txica para los embriones. Es prudente no incluir componentes espermaticidas en las preparaciones de esperma. Por otro parte la contaminacin bacteriana en el eyaculado es eliminada por la preparacin de gradientes de densidad. Por lo tanto la ausencia de antibiticos en el gradiente no ser perjudicial en la capacitacin espermtica y si evita exponer a los espermatozoides a compuestos potencialmente txicos.

Composicin del Producto

Las sales que componen los productos de Nidacon se equilibran poniendo especial atencin a la composicin inica tanto del eyaculado como del tracto reproductor femenino. Este equilibrio garantiza una transicin sin problemas desde la eyaculacin al medio de fertilizacin a travs del gradiente y el lavado.

Aditivos y Rojo de Fenol

No conservantes ni ingredientes inestables se aaden a los productos de Nidacon. Adems hemos decidido no usar el rojo de fenol en nuestro medio, ya que se ha demostrado que tiene efectos estrognicos. Los gametos tienen receptores para estrgenos y pueden ser afectados por su presencia. Por ejemplo, se ha demostrado que el estrgeno inhibe la motilidad del espermatozoide y la reaccin del acrosoma.

Buer
El buffer zwitterion, HEPES, se incluye para mantener el ph de PureSperm Gradiente y PureSpermWash mientras se trabaja con el semen en la mesa de trabajo. Los fluidos diseados para mantener el pH en ambiente de CO2 es decir en la incubadora, no son adecuados para su uso fuera de la incubadora ya que no poseen la suficiente capacidad de buffer para mantener el pH. Las fluctuaciones en el pH y la temperatura son perjudiciales para la supervivencia de los espermatozoides en el rea de trabajo. Adems el HEPES tiene un efecto anti-oxidante, reduciendo las especies reactivas de oxgeno (ROS), que pueden ser perjudiciales en la capacitacin espermtica.

Glucosa
La glucosa es un componente de los productos PureSperm. Glucosa es el sustrato de energa primaria disponible para los espermatozoides en el tracto reproductor femenino.

Productos Informacin sobre pedidos

Productos de diagnostico Preparacin semen

Sperm VitalStain
Un paso tincin Vital

Sperm MorfoStain
Un paso tincin Morfologa

Preparacin gradiente
PureSperm 100
Solucin Stock Gradiente

Swim-up
PureSperm Wash
Medio de lavado optimizado

Capa nica
PureSperm SpeediKit
Kit de preparacin de semen para IUI

PureSperm 40/80
Gradiente listo para su uso

ProInsert
Fcil manejo gradiente

PureSperm Buer
Diluyente optimizado PureSperm

PureSperm Wash
Medio de lavado optimizado

Sperm CryoProtecII
Congelacin de Semen optimizado

Sperm CryoFloater
Dispositivo para congelacin de semen por vapor

SpermCatch
Desaceleracin espermatozoides antes de ICSI

Productos de Cultivo

VitriBlast
Vitricacin de blastocistos

ThermoBlast
Descongelacin de blastocistos vitricados

NidOil
Superposicin durante el cultivo de embriones

Informacin sobre pedidos

Cat. No. PSK-020 PS40-100 PS80-100 PS100-100 PS100-250 Descripcin PureSperm 40/80 PureSperm 40 PureSperm 80 PureSperm 100 PureSperm 100 Tamao 2 20 mL 100 mL 100 mL 100 mL 250 mL 1000 mL 100 mL 100 mL 2 20 mL Cat. No. SC-100 SCP-020 NO-100 NO-300 SVS-010 SMS-250 VBK-010 TBK-010 PI15-5 Descripcin SpermCatch Sperm CryoProtecII NidOil NidOil Sperm VitalStain Sperm MorfoStain VitriBlastKit ThermoBlastKit ProInsert Tamao 6 100 L 2 20 mL 100 mL 300 mL 2 10 mL 250 mL 3 10 mL 4 10 mL 5 kits

PS100-1000 PureSperm 100 PSB-100 PSW-100 PSW-020 PSSK-070 PureSperm Buffer PureSperm Wash PureSperm Wash

PureSperm SpeediKit 5 patient preps

10 artculos o ms en una sola orden tendrn un 5% de descuento adicional. Tenemos distribuidores en la mayora de los pases, para una lista completa por favor visite nuestra pgina www.nidacon.com

Productos

PureSperm 100
Es un coloide de slice estril (auto clavado SAL-10-3), recubierto de silano en una solucin salina isotnica. Esta optimizado para la preparacin de gradientes de densidad discontinuos en la separacin y purificacin de los espermatozoides humanos. Periodo de validez 2 aos.
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Componentes Slice recubierto con silano Agua Purificada NaCl CaCl Glucosa KCl HEPES EDTA

QA Esterilidad Osmolaridad Endotoxinas pH Supervivencia

PureSperm 40 PureSperm 80
Solucin de gradiente de densidad listo para su uso, de 40 y 80%. Hace el trabajo de laboratorio ms sencillo y minimiza el riesgo de errores. Periodo de validez 2 aos.
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Componentes Slice recubierto de silano KCl NaCl Citrato Glucosa Lactato Piruvato HEPES EDTA Agua Purificada

QA Esterilidad Osmolaridad Endotoxinas pH Supervivencia

PureSperm Buer
Solucin salina equilibrada diseada especficamente para diluir PureSperm100 para hacer las diferentes capas densidades en gradiente discontinuo. La formulacin optimizada de PureSpermBuffer est diseada para maximizar la supervivencia de los espermatozoides durante la centrifugacin. Periodo de validez 2 aos.
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Componentes NaCl KCl HEPES Lactato Piruvato EDTA Citrato Glucosa Agua Purificada

QA Esterilidad Osmolaridad Endotoxinas pH Supervivencia

Productos

ProInsertTM
El ProInsert reduce el riesgo de re-contaminacin del pellet durante el proceso de recuperacin del mismo cuando se prepara la muestra de semen por medio de gradientes de densidad. El ProInsert es un dispositivo fcil y seguro de utilizar, para ser usado con los productos Nidacon. Periodo de validez 2 aos. QA Test de eficiencia MEA Componentes Tubo para centrifuga que contiene el ProInsert Tubo para centrifuga para el medio de lavado PRP (Pipeta Retiro Pellet)

PureSperm Wash
Solucin salina estril isotnica. Est optimizada para el lavado de los espermatozoides recuperados de la preparacin de gradiente de densidad. Para uso en procedimientos de Swin-Up, para extensin del semen antes de IUI o como medio para el mantenimiento de espermatozoides. Periodo de validez 1 ao. QA Esterilidad Osmolaridad Endotoxinas pH Supervivencia Componentes NaCl Piruvato KCl MgSO4 EDTA KH2PO4 Agua Purificada Glucosa HEPES NaHCO3 Lactato hSA (Albmina de suero humana)

PureSperm SpeediKit
Es un kit que ofrece todos los componentes necesarios para preparar 5 muestras de semen para IUI. Contiene tubos de muestra para semen, tubos listos para su uso por centrifugacin de una sola capa de coloide y tubos listos para su uso con PureSpermWash para el lavado del Pellet despus de la centrifugacin. Un producto perfecto para las pequeas clnicas, 5 pacientes/kit. Periodo de validez 1 ao. QA Esterilidad Osmolaridad Endotoxinas pH Supervivencia Componentes Slice recubierto de silano KCl NaCl Citrato Glucosa Lactato Pyruvate HEPES EDTA Agua Purificada MgSO4 NaHCO3 hSA (Albmina de suero humana)

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Productos

Sperm CryoProtecTMII
Solucin salina estril que contiene glicerol, optimizado para la congelacin tanto de la capacitacin espermtica por medio de gradientes como el eyaculado sin procesar. Nidacon recomienda la tcnica de congelacin por vapor de nitrgeno, ya que esta tcnica proporciona mejor resultado despus de la descongelacin Periodo de validez de 1 ao.
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Componentes NaCl KCl HEPES Glucosa MgSO4 KH2PO4 EDTA NaHCO3 Lactato Glicerol Piruvato Agua Purificada

QA Esterilidad Endotoxinas PH Rata de recuperacin post descongelacin

Sperm VitalStainTM
Tcnica de un solo paso para la evaluacin de la vitalidad de los espermatozoides. Una herramienta bsica en el anlisis del semen. Periodo de validez 2 aos. QA pH Anlisis funcional
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Componentes NaCl Eosina Agua Purificada Nigrosina Formalina

Sperm MorfoStainTM
Una clsica tincin Romanovsky. Tcnica de un solo paso para la evaluacin morfolgica espermtica. Periodo de validez 2 aos. QA Test morfolgico
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Componentes Metanol Eosina Y Metileno B May Grunwald Giemsa Asur B

SpermCatchTM
Para la desaceleracin de los espermatozoides antes de ICSI, sin el uso de polivinilpirrolidona (PVP). Evita la inyeccin de PVP durante el ICSI, solamente contiene productos naturales para aumentar la viscosidad. Periodo de validez 1 ao QA Esterilidad Osmolaridad Endotoxinas pH Supervivencia

Componentes NaCl Piruvato MgSO4 Lactato KCl EDTA KH2PO4 Agua Purificada Glucosa HEPES NaHCO3 cido hialurnico hSA (Albmina de suero humana)

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Productos

NidOil TM
Aceite de parafina estril, para uso como capa durante el cultivo en la incubadora de gametos, cigotos y pre-embriones, o durante las manipulaciones fuera de la incubadora. No contiene aditivos; empaque proteccin UV. Periodo de validez 2 aos.
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Componentes Aceite de parafina

QA Densidad Esterilidad Endotoxinas Supervivencia MEA Anlisis de perxidos

VitriBlast TM
Kit para vitrificacin de blastocistos basados en formulaciones probadas. Muchas publicaciones demuestran su eficacia tanto en la relacin con las tasas de supervivencia como con las tasas de embarazo. Periodo de validez 9 meses. QA Esterilidad Osmolaridad Endotoxinas pH MEA Componentes NaCl KCl KH2PO4 MgSO4 Glucosa NaHCO3 Piruvato EDTA Ficoll Agua Purificada HEPES Lactato Sucrosa Etilenglicol DMSO hSA (Albmina de suero humana)

ThermoBlast TM
Kit ptimo para usar en el calentamiento de blastocistos vitrificados con el kit de VitriBlast. Periodo de validez 9 meses. QA Esterilidad Osmolaridad Endotoxinas pH MEA Componentes NaCl KCl MgSO4 KH2PO4 Glucosa NaHCO3 Pyruvate EDTA Agua Purificada Sucrosa HEPES Lactato hSA (Albmina de suero humana)

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Productos

Fundamentos
Una muestra de semen normal (eyaculado) est constituida por fluido seminal que contiene una serie de diferentes clulas, restos celulares y sustancias microbiolgicas como biolgicas. Las diferentes tipos de clulas que contiene el semen son, espermatozoides motiles normales, espermatozoides jvenes, espermatozoides senescentes (sin capacidad de fertilizar) y espermatozoides con ruptura en el ADN. Tambin estn presentes clulas epiteliales del tracto reproductor masculino, clulas inmunes del varn, y desechos celulares (detritus) as como tambin bacterias y posiblemente virus. Por otra parte, el lquido seminal contiene sustancias biolgicas tales como factores decapacitantes del semen y especies reactivas de oxigeno (ROS), con efectos negativos en la fertilizacin. Despus de la eyaculacin in vivo, normalmente el esperma migra rpidamente del liquido seminal al crvix uterino de la mujer, separndose de las condiciones adversas y de los factores anteriormente mencionados. En el laboratorio de androloga de una clnica de IVF, la separacin de los espermatozoides motiles del liquido seminal y su contenido, se puede lograr utilizando gradiente de densidad discontinuo o por Swim-Up.

Aspectos positivos de un gradiente de densidad discontinuo segn Nidacon. Aspectos Separa los espermatozoides mtiles de otros tipos de clulas Separa espermatozoides inmaduros, senescentes y moribundos Separa los espermatozoides morfolgicamente anormales Separa los espermatozoides con dao en la cromatina Remueve las bacterias y los virus Si el gradiente de densidad se ha hecho correctamente, el pellet de esperma debe contener solamente espermatozoides funcionales y frtiles. Gradiente de densidad Swim-up

    

Uso de la tcnica de gradiente de doble densidad por centrifugacin y el mtodo swim-up para preparar espermatozoides con daos en la cromatina y anormalidades en el DNA. D. Sakkas et al. (2000) Human Reprod. Muestra inicial Swim-up PureSperm gradiente 21.5 9.5 33.9 21.2 Sedimento 19.6 9.7 25.0 19.8 Prep. Final 22.0 9.5 12.4 12.6 Prueba de t pareada 0.6 P 0.001

The mean percentage of spermatozoa positive to Chrmomomycin A3 decreased presence of protamine.

Cuidados Generales y usos

G

Todas las soluciones deben ser llevadas a temperatura ambiente antes de su uso para evitar las fluctuaciones de la temperatura que son perjudiciales para la supervivencia de los espermatozoides.

Abrir y cerrar las botellas dentro de una cmara de flujo laminar, utilizando tcnicas estriles para evitar la contaminacin. Guarde todas las botellas abiertas a 2-8C despus de cerradas.

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Preparacin de un gradiente de densidad

PureSperm 100 PureSperm 40 PureSperm 80 PureSperm Buer PureSperm Wash Recomendaciones

Si usted usted tiene una muestra con alto volmen (>3ml), puede preparar dos gradientes de PureSperm por cada muestra de semen. Esto reduce el riesgo de sobrecargar el gradiente nico; proporciona seguridad al manipular los tubos o recuperando el pellet de esperma y proporciona dos tubos para equilibrar el rotor de la centrfuga.

Reactivos y Equipos
PureSperm 100 ms PureSperm Buffer o PureSperm 40 y 80 Pipetas Pasteur Estriles PureSperm Wash Pipetas estriles de 2ml y 10ml Centrifuga con rotor basculante

Procedimiento
1. Si utiliza PureSperm100, diluir con PureSpermBuffer para hacer su gradiente, por ejemplo aadir 2 mL de PureSperm Buffer a 8 mL de PureSperm 100 para obtener 10 mL de PureSperm 80%. Agregar 6 mL de PureSperm Buffer a 4 mL de PureSperm100 para obtener 10 mL de PureSperm 40%. En su lugar puede utilizar las soluciones ya listas de PureSperm 40 y 80. 2. Utilizar una pipeta estril para agregar 2mL de PureSperm 80% en un tubo cnico. 3. Utilizar una pipeta nueva estril y con cuidado agregar 2 mL de PureSperm 40% en la parte superior de la capa de 80%. Es importante de no perturbar las dos capas y mantener una interface definida. 4. Deposite el semen en estado de licuefaccin sobre el gradiente. Recomendamos no tomar ms de 1.5 mL/gradiente o corre el riesgo de sobrecargar el gradiente y no obtener un buen resultado. 5. Centrifugue a 300 x g por 20 minutos. Asegrese que su centrifuga uses las correctas fuerzas g (use la ecuacin) No utilice el freno. 6. Aspirar desde la superficie con movimientos circulares todo, excepto el pellet y unos 4 a 6 mm de la capa de PureSperm 80%. Si no se ve el pellet despus de la centrifugacin, remover todo el lquido, excepto los ltimos 0,5 mL. 7. Utilizar una pipeta nueva para aspirar el Pellet (o los 0,5 mL). Transfiera el Pellet de esperma a un nuevo tubo y resuspenda el Pellet en 5ml de PureSperm Wash. Siempre utilice un nuevo tubo con PureSperm Wash para evitar la contaminacin del eyaculado. Combine los pelles si ha realizado un procedimiento doble. 8. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilice el freno. 9. Aspire el sobrenadante de PureSperm Wash dejando la menor cantidad posible de lquido sobre el pellet. Si no se ve el Pellet deje unos 0,25 mL de lquido del fondo. 10. Re-suspender el Pellet de esperma en un volmen adecuado de medio. La muestra esta lista para su uso.

Antes de la centrifugacin Antes de la centrifugacin

14 14 13 13 12 12 11 11 10 10 9 9 8 8 7 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2

Despus de la centrifugacin Despus de la centrifugacin

14 14 13 13 12 12 11 11 10 10 9 9 8

Semen Semen Capa de Capa de gradiente gradiente superior superior Capa de Capa de gradiente gradiente Inferior Inferior

Plasma Plasma seminal seminal Interfase Interfase superior superior Interfase Interfase Inferior Inferior Pellet (sedimento), Pellet (sedimento), poblacin mvil poblacinselecta mvil selecta

8 7 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2

Inmviles, esperma muerto, basura, Inmviles, esperma clulas basura, muerto,epiteliales, leucocitos, bacterias clulas epiteliales, leucocitos, bacterias Inmaduros y espermatozoides Inmaduros y viejos espermatozoides viejos Espermatozoides Espermatozoides mviles mviles

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Preparacin de un gradiente de densidad

Calibracin de la centrifuga, para alcanzar las fuerzas G correctas use la siguiente ecuacin: Rpm = [ (g/(1.118 x r)] x 10 g = Fuerza centrifuga r = Radio de rotacin, la distancia (mm) desde el centro del rotor al fondo del tubo de centrifugado en el cubo cuando se levanta en posicin horizontal Por ejemplo; para alcanzar 300 x g cuando el radio = 165 mm la velocidad de la centrifuga debe ser: Rpm = [ (300/(1.118 x 165)] x 10 = 1275 Tabla de conversin tiempos gravedad /x g) y la velocidad del rotor (RPM) http://cabinet.weblog.com.pt/arquivo/TR0040dh4-Centrifuge-speed.pdf G Force /RPM calculadora http://drycake.com/calculator/gforce.php

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Trucos
G

Las capas de gradientes deben sobreponerse inmediatamente antes de su uso, pero las diferentes soluciones de densidades de PureSperm se pueden preparar con anterioridad, asegurndose que se guarden a 4C y antes de su uso dejarlas a temperatura ambiente.

Cuando se recupere el pellet despus de la centrifugacin por gradiente, debe tener cuidado para evitar la contaminacin del Pellet con componentes del eyaculado o las capas de gradientes superiores. Por lo tanto le recomendamos que utilice una pipeta nueva estril tras haber eliminado la mayor parte del gradiente para evitar contaminacin, por ejemplo por bacterias.

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SpeediKit

PureSperm SpeediKit Fundamentos

Recomendamos especialmente el PureSperm Speedikit, para las clnicas ms pequeas o para las clnicas que realizan procedimientos de (IUI). El SpeediKit es una alternativa rpida y eficaz para la preparacin de semen. Todo est incluido en el Kit para la rpida preparacin del semen, basado en la centrifugacin efectiva a travs de una sola capa de PureSperm Colide en lugar de un gradiente de dos capas, seguido por el lavado de los espermatozoides con PureSperm Wash. El kit contiene el colide y el PurSperm Wash para 5 pacientes, los tubos de centrifuga previamente preparados, ms los tubos para recoleccin del semen. Usted no necesita incubadora.

Reactivos y Equipos
Tubos para coleccin de semen (Incluidos en el kit) Tubos listos para su uso con PureSperm Unilayer y PureSperm Wash (incluidos en el Kit) Tubos para balance (Incluidos en el Kit) Centrfuga con rotor basculante Pipetas Pasteur estriles

Procedimiento
1. Utilizar una pipeta estril y con cuidado deposite una capa de semen en estado de liquefaccin (Hasta 1,5 mL) en la parte superior de PureSperm Unilayer. Si tiene una muestra de ms de 1,5 mL de volmen, use dos tubos. 2. Centrifugar a 300 x g durante 30 minutos. No utilice el freno. 3. Utilizar una nueva pipeta estril para aspirar el sobrenadante, dejando unos 5 mm de lquido por encima del pellet, Si no se ve el pellet de la centrifugacin, quite todo el lquido excepto 0,5 mL de la parte ms baja. 4. Utilizar una nueva pipeta estril para aspirar el pellet (o los 0,5 mL de la parte ms baja).
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5. Transfiera el pellet de esperma al tubo que contiene PureSperm Wash y resuspenda el esperma. 6. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilizar el freno. 7. Utilizar una nueva pipeta estril para aspirar el sobrenadante, dejando la menor cantidad posible de lquido sobre el pellet. Si no se ve el pellet, deje 0,25 mL de lquido de la parte ms baja. 8. Re suspender el pellet en el resto de PureSperm Wash. La preparacion de esperma est lista para su uso.

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Trucos
G

Todo lo que necesita es la muestra de semen, una centrifuga con rotor basculante, pipetas estriles, el resto lo encontrar en el kit.

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ProInsert

ProInsertTM Fundamentos
El gradiente de densidad elimina linfocitos, clulas epiteliales, espermatozoides anormales o inmaduros, restos celulares, lquido seminal, bacterias y en algunos casos virus. Cuando se realizar un gradiente de densidad la forma de recuperar el pellet de esperma del fondo del tubo es, ya sea directamente a travs de las capas corriendo el riesgo de perturbarlas y contaminar el pellet, o eliminar la mayor cantidad posible de las capas, atravesar el contenido restante y todava correr el riesgo de re-contaminar el pellet. Puesto que en el gradiente hay muchos contaminantes potencialmente peligrosos, es crucial que el pellet de esperma no se vuelva a contaminar. El ProInsert eliminar este riesgo de re-contaminacin. El inserto est incluido con el tubo de centrfuga y despus de obtener el pellet, este puede ser recuperado a travs del canal central que conduce hasta donde se encuentra el pellet, sin entrar en contacto con el gradiente contaminado.

Reactivos y Equipos
Tubo para centrfuga que contiene el ProInsertTM Tubo para centrifuga para el medio de lavado (PureSperm Wash) PRP (Pipeta Retiro Pellet) Centrifuga con rotor basculante Pipetas estriles

Procedimiento para el uso de ProInsertTM

1. Abrir el kit de ProInsertTM y retire el tubo de centrfuga que contiene el ProInsertTM. 2. Con una pipeta con punta estril, agregar 2 mL de PureSperm80 por el canal exterior en la parte superior del ProInsertTM. El gradiente bajara por la cmara del ProInsertTM a travs de un agujero, ubicado en la parte inferior de la misma y se deslizara por la pared del tubo para formar una capa en la parte inferior del tubo. 3. Repita el paso nmero 2, usando una nueva punta de pipeta estril y el PureSperm 40, de nuevo a travs del canal exterior. 4. Una vez ms, utilice otra punta de pipeta estril y con cuidado, deposite el semen en estado de licuefaccin (hasta 1,5 ml) de nuevo a travs del canal exterior sobre el gradiente de densidad. Tenga mucho cuidado de no tocar los bordes del canal central con el semen. 5. Tape el tubo, centrifugar a 300 x g durante 20 minutos. No use el freno de la centrfuga. Calcular las correctas RPM de la centrfuga. 6. Aadir 5 mL PureSperm Wash al segundo tubo de centrfuga (no en el grfico).
3 4 5 6

7. Coloque PRP Pipeta de Recuperacin del Pelet del ProInsertTM Kit a una jeringa de 1-2 mL, (no en el grfico). 8. Pase la pipeta (PRP) lentamente por el ProInsertTM a travs del canal central, hasta el pellet de esperma (ver grfico). Tenga cuidado de no perturbar el pellet. Mediante la jeringa, aspirar slo el pellet de esperma. Retirar la pipeta hasta que la punta de la pipeta esta por encima de la superficie del lquido, aspirar un poco de aire y entonces retraer la pipeta del canal central. (Este procedimiento garantizar que no se pierde contenidos en la pipeta durante la transferencia al PureSperm Wash). Transfiera el pellet al tubo que contiene el PureSperm Wash. 9. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilice el freno de la centrifuga. 10. Aspirar el sobrenadante PureSperm Wash, dejando un mnimo posible de liquido por encima del pellet. Si no se ve el pellet, deje 0,25 mL de lquido del fondo. 11. Vuelva a suspender el pellet de esperma en un volumen adecuado de medio de cultivo para transferencia (por ejemplo, PureSperm Wash) para obtener la concentra10 11 12 9 cin de espermatozoides necesarios para FIV, ICSI o IUI. La muestra de semen est lista para su anlisis y/o uso. 8 9 10 11

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Swim-up

PureSperm Wash Fundamentos

Para la mayora de situaciones Nidacon recomienda el uso de gradientes de densidad discontinua para la preparacin del semen. Sin embargo, muchos clientes en algn momento necesitan utilizar la tcnica de swim-up y el producto ms idneo para este propsito es PureSperm Wash. PureSperm Wash es una solucin salina equilibrada y ajustada para la nutricin y larga supervivencia de los espermatozoides humanos. Funciona excelentemente bien para este propsito.

Recomendaciones
PureSpermWash no contiene ninguna clase de antibiticos y la tcnica de swim-up no garantiza la eliminacin de contaminacin por bacterias, por lo tanto es recomendable adicionar antibiticos cuando use la tcnica swim-up en la preparacin del semen para ART. Recomendamos que utilice Penicilina en una concentracin de 100 U/mL.

Reactivos y Equipos
PureSperm Wash Tubos para centrifugacin de fondo redondo Tubos desechables estriles para centrifugacin de fondo cnico Pipetas estriles CO2 incubadora Centrifuga con rotor basculante

Procedimiento
1. Transferir 1mL de semen en estado de licuefaccin a un tubo estril para centrifugacin de fondo redondo. Si la muestra es demasiado viscosa, trate antes de diluir la muestra con PureSperm Buffer. 2. Utilizar una pipeta nueva estril, y con cuidado deposite una capa de 1,5 mL de PureSperm Wash sobre el semen. 3. Sin perturbar las capas, coloque el tubo en un ngulo de 45 en la incubadora de CO2 a 37C durante 60 minutos. 4. Retire con cuidado la capa superior (0,5-1,0 mL) 2 1 de 1 medio que contine los espermatozoides motiles 2 usando una pipeta estril. 2 1 1 2 5. Coloque este lquido en un tubo estril de fondo cnico que contiene previamente 5 mL PureSperm Wash. 6. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilice el freno. 7. Aspirar el sobrenadante, dejando no ms de 2 mm de profundidad de lquido sobre el pellet. 8. Re-suspender el pelle de esperma en un volumen adecuado de medio para obtener la concentracin de espermatozoides requeridos. La muestra est lista para su anlisis o su uso.4 3 4
3 4

Trucos
G

5 5

5 5

6
6

6 6

7
7

7 7

8 8
8
8

Si tiene una muestra muy viscosa, tenga cuidado al remover la capa superior despus de la incubacin. Es muy fcil que la muestra de semen se pegue y perturbar las capas.

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Congelacin de espermatozoides

Sperm CryoProtecTMII Fundamentos

El crio protector de Sperm CryoProtectII es el glicerol en una proporcin reducida en la medida de lo posible para minimizar la toxicidad en el esperma sin dejar de proporcionar la crioproteccin. Por otra parte una alta concentracin de glucosa est presente como agente osmtico para reducir el agua intracelular, lo que disminuye los daos debido a la formacin de cristales de hielo.

Recomendaciones
Es posible congelar semen sin preparacin, pero recomendamos que prepare el eyaculado usando el mtodo de gradientes de densidad PureSperm. Este mtodo elimina el plasma seminal a si como ROS y sus fuentes, lo que garantiza una recuperacin ptima de espermatozoides motiles despus de la descongelacin.

Reactivos y Equipos
Sperm CryoProtecTMII y PureSperm Wash Pipetas estriles Tubos desechables estriles para centrifugacin (ejemplo Falcon 2075) Viales desechables estriles para criopreservacin o pajillas. Tijeras CryoFloaterTM (Nidacon)

Tabla de dilucin
Muestra de semen (L) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 SCPII (L) 33 67 100 133 167 200 233 267 300 333 Muestra de semen (L) 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 SCPII (L) 367 400 433 467 500 533 567 600 633 667 Muestra de semen (L) 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000 SCPII (L) 700 733 767 800 833 867 900 933 967 1000

Para otros volmenes diferentes a los listados anteriormente, calcular: Volumen de la muestra de semen/3=Volumen SCPII Ejemplo: 300 L muestra de semen / 3 = 100 L SCPII

Trucos
G

Para evitar el shock osmtico de los espermatozoides, es importante mezclar lentamente CryoProtectII con la muestra de semen, pero no por ms de 5 minutos ya que el glicerol es txico para las clulas a temperatura ambiente.

El tiempo de incubacin antes de la congelacin se puede reducir a 15 minutos, pero lo recomendable son 60 minutos.

19

Congelacin de espermatozoides

Eyaculado procesado
1. Cuando utilice semen preparado, re-suspender el pellet de esperma en un volumen pequeo de PureSperm Wash para obtener la concentracin deseada de esperma. 2. Aadir gota a gota 1 parte de Sperm CryoProtectTMII a 3 partes de muestra (ver tabla de dilucin) asegurece de mezclar muy bien despus de agregar cada gota.
2

4. Equilibre las pajillas o viales en el refrigerador durante 30-60 minutos. 5. Coloque las pajillas horizontalmente en vapor de nitrgeno lquido, 1 cm encima de la superficie de nitrgeno lquido en un pedazo de espuma de polietileno (CryoFloater). Dejar durante 30 minutos.
3 5 4 Transfiera rpidamente las pajillas en el nitrgeno 6.

3. Rellene las pajillas con la suspensin de esperma o alcuotas en los viales.

lquido y posteriormente, almacenar en nitrgeno lquido. No toque la pajilla con sus manos.

LN2

Eyaculado sin procesar

1. Mida el volumen del eyaculado. 2. Mescle el eyaculado con el SCPII, en una dilucin 1:3 (Ver tabla), asegrese de mezclar muy bien despus de agregar cada gota para evitar el shock. 5. Congele los viales horizontalmente en el congelador o en vapor de nitrgeno sobre la superficie de nitrgeno lquido en un pedazo de espuma de polietileno (CryoFloater). Mantngalo por 30 minutos. 6. Almacene en nitrgeno liquido.

H2 a crio 3. Transfiera 0,8-1,8 mL de la mezcla O viales de 2 mL.

4. Coloque los viales en le refrigerador (4-5C) por 30 minutos.
1 2 3

LN2

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H2O

Congelacin de espermatozoides

Procedimiento de descongelacin eyaculado procesado

1. Retire las pajillas del tanque de nitrgeno lquido. 2. Coloque las pajillas en agua a 37C por 30 segundos. 3. Seque muy bien la superficie de la pajilla. 4. Corte un extremo de la pajilla. 5. Sujete la pajilla contra el tubo previamente preparado con 5 mL de PureSpermWash y corte el otro extremo de la pajilla. Cualquier resto de la suspensin con espermatozoides puede ser expulsado con una pipeta. 6. Centrifugar a 500 x g durante 10 minutos. No utilizar el freno. 7. Aspirar el sobrenadante de PureSpermWash dejando tanto lquido como se requiera para la concentracin deseada. Si no se ve el pellet, deje 0,10 mL de lquido del fondo. 8. La muestra esta lista para su uso.

H2O

Procedimiento de descongelacin eyaculado sin procesar

1. Retirar los viales del tanque de nitrgeno.
1

5. Centrifugar a 300xg por 20 minutos. 6. Aspire todo excepto el pellet 6y unos 4-6 mm del 5 PureSperm 80%. 7. Use una nueva pipeta para aspirar el pellet. Transfiera a un nuevo tubo que contenga 4ml PureSperm Wash. 8. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. 9. Aspire el sobrenadante de PureSperm Wash y la muestra esta lista para su uso.

2. Colocar los viales en2 agua a 37C hasta que los cris3 tales de hielo hayan desaparecido, aproximadamente 2-3 minutos. 3. Diluir el material descongelado con 0,5 mL de PureSperm Wash. 4. Preparar el material descongelado en un gradiente de densidad 40% y 80%. Use 1 mL de cada gradiente y depostelos en un tubo para centrifuga y adicione no mas de 1 mL del eyaculado descongelado en el gradiente.

LN2
1 2 3 4 5 6 7

H2O

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ICSI

SpermCatchTM Fundamentos
SpermCatchTM es una alternativa al PVP (polivinilpirrolidona) que hoy es la sustancia ms comnmente usada para la desaceleracin de los espermatozoides antes de ICSI. Sin embargo, se ha reportado que el PVP causa problemas, como el dao de la membrana plasmtica del espermatozoide y tambin puede interferir con la descondensacin espermtica del ncleo. SpermCatchTM es una solucin sin PVP que contiene cido hialurnico que es un componente natural. Varios estudios han demostrado que SpermCatchTM da los mismo resultados o incluso mejores, que el PVP. Ya que el SpermCatchTM es una solucin que contiene cido hialurnico, consulte la siguiente referencia para sus ventajas (Ref. 21).

Reactivos y Equipos
SpermCatchTM NidOilTM Medio de Inyeccin Pipetas estriles Equipos de ICSI Caja de petri

Procedimiento
1. Coloque una gota de 10 L de SpermCatchTM en el centro del caja de petri. 2. Coloque el medio de inyeccin en 4 gotas de 10 L cada una al rededor de la caja de petri. 3. Cubra inmediatamente las gotas con NidOil. 4. Incubar durante 30 minutos en medio ambiente de CO2 a 37C. 5. Aadir 1 L de la suspensin preparada de espermatozoides en el medio de la gota de SpermCatchTM. 6. Incubar durante 10 minutos en medio ambiente de CO2 a 37C. 7. Llene la pipeta de inyeccin con SpermCatchTM para evitar que el esperma se pegue en el interior de la pipeta. Tambin la ayudara a hacer una inyeccin controlada. 8. Inmovilizar el espermatozoide usando la pipeta de inyeccin para fracturar la cola del espermatozoide. 9. Aspirar el espermatozoide inmvil. 10. Dirigirse a una de las gotas de los ovocitos. Enfquese en el ovocito y mantenga el ovocito con la pipeta (holding). Lleve hacia bajo las pipetas de inyeccin y inserte el espermatozoide. Asegrese que la zona pelucida este rota antes de expulsar el espermatozoide.

1 4

5 6

7 9

SpermCatch

SpermCatch

Trucos
G

Las cajas para ICSI deben prepararse muy rpidamente para evitar el cambio de la osmolaridad en el medio. Solamente prepare 2 al mismo tiempo.

Es conveniente tener dos cajas por paciente.

22

NidOil

NidOil

TM

Fundamentos
El aceite mineral se ha venido utilizando muy ampliamente en los laboratorios de IVF para la superposicin de cultivos. NidOilTM contiene aceite de parafina que ha sido especficamente elegido y luego tratado en nuestros laboratorios de produccin para asegurar que su pureza y caractersticas de manejo sean adecuadas para usar en la superposicin cuando se hacen los cultivos de gametos y embriones. NidOilTM no requiere de lavado antes de su uso, y no es ni demasiado pegajoso ni demasiado viscoso para facilitar el pipeteado. Controles estrictos de garanta de calidad se llevan a cabo en cada uno de los lotes para asegurar la ausencia de agentes contaminantes microbiolgicos y bajos niveles de endotoxina. Varios informes indican que los aceites de parafina pueden ser embrio-txicos despus de estar expuestos a la luz en la mesa de trabajo en el laboratorio. Como medida de precaucin contra cualquier posible cambio inducido por la luz, NidOilTM se envasa en botellas mbar con tapn de rosca.

Estudio prospectivo aleatorio para comparar cuatro aceites minerales diferentes usados en el cultivo de embriones humanos IVF/ICSIOI terapia. Presentado en ESHRE 2008 por Dr. Sifer, Paris. Comparacin entre; 1. Mineral Oil (CryoBioSystem) No 2. Liquido de parafina (MediCult) 3. NidOil (Nidacon) 4. Ovoil (Vitrolife) GQE dia 3 Tasa Impl. % Emb. Clin. 2,1 22,1 31 1,6 21,7 29 2,2 30,0 38 2,6 24,6 36 129 126 126 119 Grupo 1 2 3 4

Recomendaciones antes de su uso

Antes de su uso, NidOilTM debe equilibrarse de la misma forma que los medios de cultivo para evitar las diferencias en temperatura y contenido de gases entre los componentes del sistema de cultivo.

Nuevo test de calidad

Se han planteado ltimamente muchas preguntas sobre si el aceite que se utiliza para la cobertura en el cultivo de embriones en realidad puede daar el embrin. Hoy en da todos los lotes de aceites de distintos fabricantes se someten a pruebas de esterilidad, endotoxinas y ensayo de embriones de ratn para mostrar el desarrollo del blastocisto. Esto aparentemente no es suficiente ya que se ha observado daos en los cultivos con lote de aceites aprobados. Una respuesta podra ser la peroxidacin del aceite, que se ha reportado en varias investigaciones publicadas y han determinado que es perjudicial para la fertilizacin y desarrollo embrionario, cuando se alcanza cierto nivel. Tambin se ha demostrado que el nivel de peroxidasa en el aceite puede aumentar con el tiempo, debido a la exposicin a la luz o altas temperaturas. La prueba de peroxidasa se incluye tanto en el certificado de garanta de calidad que viene con cada lote como en el de materia prima antes de realizar el pedido. De este forma le ofrecemos un aceite para su cultivo seguro de usar y confiable con la larga vida y almacenamiento a temperatura ambiente antes de su apertura.

Si usted tiene alguna pregunta acerca de nuestras pruebas, por favor hganoslo saber.

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Vitricacin y calentamiento de blastocistos

VitriBlast Kit ThermoBlastKit Fundamentos

El problema principal cuando se congelan clulas es la formacin de cristales de hielo intracelular, tanto en el enfriamiento como en el calentamiento, ya que estos cristales de hielo tienen un efecto perjudicial en la supervivencia celular. La vitrificacin es una tcnica de congelacin ultra rpida de material celular, que permite congelar las clulas sin que se formen cristales de hielo dentro de la clula. El resultado de la vitrificacin es una estructura homognea y cristalina amorfa.

Recomendaciones
VitriBlast puede ser utilizado con diferentes tipos de dispositivos para vitrificacin como, el cryotop, cryoloop, o el HSV (pajilla de alta seguridad). El mtodo descrito a continuacin es con el cryoloop, pero el mismo protocolo puede ser utilizado para los otros dispositivos. Trabaje los blastocistos en un escenario caliente en todo momento. No deje que los blastocistos sean expuestos a la luz del microscopio durante su incubacin.

Reactivos y Equipos
VitriBlast y ThermoBlast Kit Pipetas estriles Dispositivo para vitrificacin Incubadora de CO2 Cronmetro o temporizador Depsito de nitrogeno lquido Nitrogeno Lquido Plato de cultivo (NUNC 4-pozos) Platina de calentamiento Microscopio invertido

Blastocisto vitrificado y calentado con excelente morfologa.

Blastocistos Hatching. Despus de la vitrificacin y el calentamiento.

Procedimiento de vitricacin usando el cryoloop

Equipo Adicional: Cnula de criopreservacin para el almacenamiento de los tubos de crio preservacin Crystalwand Pinzas para sostener el tubo de criopreservacin Cryoloop 2. Pipetear los medios de vitrificacin como se describe a continuacin. Cuando agregue el DMSO y el etilenglicol (EG) que est incluido en el Kit, a la solucin 2 y 3 pipetear las dos sustancias, arriba y abajo un par veces para obtener una mezcla ptima del medio. Pozo 1 VitriBlast1 Nota: Si las sustancias adicionales se almacenan en el refrigerador, retrelas con el tiempo suficiente antes de su uso. El DMSO se solidifica por debajo de los +18C. Las sustancias adicionales pueden ser almacenadas fuera del refrigerador en su caja, incluso despus de abierta. El DMSO se puede calentar en la mano si es urgente. Pozo 2 VitriBlast2 DMSO: EG: Pozo 3 1. Etiquetar el plato de NUNC con la identificacin del paciente y con nmero en cada pozo por cada solucin es decir 1, 2, 3. VitriBlast3 DMSO: EG: 700 L 150 L 150 L 850 L 75 L 75 L 3 1000 L 1 2

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Vitricacin y calentamiento de blastocistos

Procedimiento de vitricacin usando el cryoloop

3. Incubar a 37C en 5-6% de CO2 durante 30 minutos (mximo 1 hora, ya que por ms tiempo, dificulta la creacin de la pelcula en el loop). 5. Retire el plato de NUNC de la incubadora y colquelo en la platina de calentamiento (asegrese que el control de calentamiento este lo suficientemente alto para alcanzar 37C en los medios) 6. Coloque el blastocisto puncionado y colapsado en la solucin nmero 1. Inicie el cronmetro.

4. Durante la incubacin en el plato por 30 minutos, colapse el blastocisto. Esto se puede hacer de dos formas, ya sea por laser (Fertilase, red, 5 ver fotos de abajo) o usando una pipeta de ICSI. Laser Si utiliza el laser, dispare lo ms alejado posible de la masa celular interna (ICM). El lser dispara verticalmente como se ilustra a continuacin. . Asegrese de crear un agujero en la zona y el trofoectodermo.

7. Despus de 1.5 a 2 minutos, aspire solucin 2 en la punta de la pipeta, coger el blastocisto de la solucin 1 y transfiralo en la solucin 2 ( pozo 2)

Pipeta de ICSI Si se utiliza una pipeta de ICSI o cualquier otro instrumento afilado, puncione la capa de clulas trofoblstica en el blastocele, asegrese de puncionar lo ms lejos posible de la ICM. . La pipeta se debe insertar en la posicin uno en punto por el blastocisto a las once en punto.

8. Incubar en la platina de calentamiento por EXACTAMENTE 2 minutos. Ponga en marcha el cronmetro y preste atencin cuando se est acercando a los 2 minutos (es ms fcil iniciar el cronmetro y dejar que corra a los 2 minutos que ponerlo en cuenta regresiva ya que evita el estrs del sonido cuando termina la cuenta regresiva) mientras se incuba, contine con el paso 9 abajo.

No deje que el blastocisto este expuesto a la luz del microscopio cuando se est incubando.

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Vitricacin y calentamiento de blastocistos

Procedimiento de vitricacin usando el cryoloop

9. Durante la incubacin de 2 minutos, preparar 2 x 10 L gotas de solucin 3 en el centro de la caja (ver diagrama abajo). Las gotas se evaporan rpidamente; preprelas lo ms tarde posible. 10. Adjuntar el loop al Crystalwand. 11. Despus de los 2 minutos, aspire solucin del pozo 3 con la punta de la pipeta y transfiera el blastocisto que esta en solucin 2 a la solucin 3 - 10 L. El blastocisto debe permanecer en la solucin 3 EXACTAMIENTE 30 segundos, incluyendo el tiempo en el loop. No ms ni menos tiempo. 14. Fije el tubo de criopreservacin a la pinza y sumerja el tubo en el nitrgeno lquido dejando que se llene. Inserte con mucho cuidado el loop en el tubo Mantenga el loop en nitrgeno lquido durante todo el procedimiento. Use la crystalwand para cerrar el tubo. 13. Sumerja en nitrgeno lquido.

12. Cubra el loop con la solucin con los otros 10ul y coloque el blastocisto en el loop Nota: El uso de gotas reduce el riesgo de perder el blastocisto. El blastocisto tiende a flotar en el medio viscoso 3. Tambin es importante incubar la solucin 3 en las mismas condiciones que las otras dos soluciones. De ah el uso de 1 mL.

15. Fije el tubo a la cnula de cryopreservacin para almacenar en nitrgeno lquido.

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Vitricacin y calentamiento de blastocistos

Proceso de calentamiento
1. Etiquetar el plato NUNC con la identificacin del paciente, as como cada nmero de la solucin, es decir 4, 5, 6 y 6 respectivamente. 2. Pipetear los medios de calentamiento 4,5 y 6 como se describe a continuacin. Pozo 1 ThermoBlast4: 1000 L Pozo 2 ThermoBlast5: 1000 L Pozo 3 3 1 2 5. Sumergir el loop en la superficie de la solucin 4. Deje que el blastocisto caiga. Identificar su presencia en el pozo e incubar durante 2 minutos en la platina de calentamiento. ( 2 minutos incluido el tiempo utilizado para localizar el blastocisto).

ThermoBlast6: 1000 L 6. Aspire solucin 5 en la punta de la pipeta, coger el blastocisto de la solucin 4 y transferirlo a la solucin 5. Incubar durante 3 minutos en la solucin 5. 7. Mueva el blastocisto aspirando solucin 6 en la punta de la pipeta, recoger el blastocisto de la solucin 5 y transferirlo a la solucin 6. Mueva el blastocisto al rededor para enjuagar y luego trasldelo al segundo pozo que contiene solucin 6. 8. Incubar durante 5 minutos. 9. Transfiera el blastocisto al medio de cultivo y dele tiempo para que el blastocisto se reexpanda. Espere de 1 a 4 horas antes de su anlisis. Si el blastocisto no se ha reexpandido despus de 4 horas, la probabilidad que se reexpanda es casi nula.

3. Incubar a 37C en 5-6% en CO2 por 30 minutos. 4. Separe con cuidado el loop del tubo de criopreservacin, asegrese de no tocar el interior del tubo con el loop (el blastocisto se puede perder). Desenroscar la parte superior y mover el loop del tubo son los momentos de ms riesgo del procedimiento.

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Tincin de vitalidad

Sperm VitalStainTM Fundamentos

La vitalidad espermtica se debe determinar en muestras de semen con el 50% o ms de espermatozoides inmviles de acuerdo con el manual de laboratorio de la OMS para el examen de esperma humano. Sperm VitalStain utiliza la tcnica de eosina-nigrosina, mtodo de un solo paso para establecer el porcentaje de espermatozoides vivos. Se basa en el principio por el cual las clulas muertas (es decir aquellas con dao en la membrana plasmtica) van a incorporar la eosina y teir de rojo. La nigrosina proporciona el fondo para facilitar la visualizacin de las clulas vivas no teidas (Blanco).

Reactivos y equipos
Microscopio con Luz (40-100 x aumento) Lminas Pipetas Probeta

Procedimiento
1. Agite la botella de Sperm VitalStainTM antes de su uso. 2. Tome la misma cantidad de Sperm VitalStainTM como de la muestra de semen (por ejemplo 50 L SVS + 50 L muestra). Utilizar por ejemplo un tubo de eppendorf. 3. Mezclar muy bien. 4. Dejar a temperatura ambiente por 30 segundos. 5. Prepare las lminas usando un mtodo convencional o use el mtodo recomendado por Nidacon. 6. Transferir una gota 20 L en una lamina etiquetada, con una pipeta, haciendo una lnea de lquido en el medio de la lmina. 7. Cubra la lmina con una segunda lmina y cuando la gota se distribuya uniformemente entre las dos lminas, seprelas una de la otra en posicin horizontal, como resultado tendr dos buenas lminas para examinar. 8. Seque al aire las dos lminas y examinar. Si desea almacenar para uso posterior, montar las lminas con DPX o medio de montaje equivalente y cbralas. 9. Examine usando un campo brillante 40 x objetivo o un objetivo de 100 con aceite de inmersin. 10. Cuente 200 espermatozoides, los blancos (sin tincin) son clasificados como vivos y los rojos o rosados son clasificados como muertos. Espermatozoides con tincin nicamente en la regin del cuello son clasificados como vivos.

Trucos
G

El objetivo 100 x con aceite de inmersin, le dar una clara visin entre espermatozoides teidos y no teidos.

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Morphology Staining

Sperm MorfoStainTM Fundamentos

La tcnica se basa en el principio que los espermatozoides con diferentes caractersticas se tien por lo que se pueden diferenciar. El nmero estimado de espermatozoides anormales en el eyaculado, ayuda en el juicio si se requiere y qu tipo de tratamiento de fertilidad es necesario. El esperma se teir de un color ms oscuro (azul) y el fondo ser ms claro. En consecuencia, la forma, el tamao y la integridad de los espermatozoides se puede determinar fcilmente con el uso del objetivo 100 x, en inmersin de aceite.

Reactivos y equipos
Tarro de Coplin o similar Lminas Microscopio con luz (40-100 x objetivo) Pipetas

Procedimiento
1. Haga un frotis con el semen en una lmina con un mtodo convencional o con el mtodo recomendado por Nidacon. 2. Transferir con una pipeta, una gota de 20 L en una lmina etiquetada haciendo una lnea en el medio de la lmina. 3. Cubra esta lmina con una segunda lmina y cuando la gota se distribuya uniformemente entre las dos lminas, seprelas una de la otra en posicin horizontal. Como resultado tendr dos buenas lminas para examinar. 4. Deje secar al aire los frotis. 5. Sumergir los frotis secos en la solucin de tincin por 8 segundos. 6. Enjuague con agua destilada, cambiando el agua 3 veces. Acueste la lmina y deje que se seque por completo. 7. Monte las lminas con cubreobjetos y DPX o lquido equivalente de montaje, y deje que se seque completamente antes del examen. 8. Examine usando un campo brillante con objetivo 100 x con aceite de inmersin. 9. Clasificar por lo menos 200 espermatozoides, clasificacin de acuerdo con el manual de NAFA de 2002 y ESHRE SIGA o los principios bsicos de anlisis de semen.

2 3

Trucos
G

Use lpiz en vez de marcador para marcar las lminas ya que la tincin remueve la tinta de marcadores permanentes.

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Referencias

Referencias
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