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FINAL Informe Fibras 2009-05-04

FINAL Informe Fibras 2009-05-04

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Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja.

1
Universidad Tecnológica Nacional
Facultad Regional Bahía Blanca
Departamento de Ing. Electrónica
Cátedra: Fibras Ópticas para comunicaciones
Año 2009.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja
ALUMNO:
Galasso Christian L.
christian_galasso81@yahoo.com.ar
Resumen: Determinar la distribución de tamaño de micropartículas es un problema que está
adquiriendo cada vez una importancia mayor para la industria en general y la de procesos en particular,
ya que impacta directamente en las tecnologías de separación de fase y en especial en las tecnologías
medioambientales. La espectroscopia es una rama de la Ciencia Físico-Química que se ocupa del
estudio de los "espectros" para conocer la forma de obtenerlos, la forma de medirlos y la aplicación al
análisis químico. En el presente informe se verán dos técnicas utilizadas para la obtención de los
espectros de los distintos materiales, ambas involucran el uso del láser; una de ellas es la
espectrometría de masas MALDI y la otra es la espectrometría infrarroja, también conocida como
espectroscopía infrarroja.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 2
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 3
Índice de contenido
1. Espectroscopia y Espectrometría, ¿Que son?.................................5
1.1.Métodos espectrométricos ...............................................5
1.1.1.Según la naturaleza de la excitación medida.........................5
1.1.2.Según el proceso de medida..........................................6
2. Introducción a la Espectrometría L.A.S.E.R.................................7
2.1.¿Que es la Espectrometría de Masas?.....................................7
2.2.Principios de la técnica................................................7
2.3.Implementación..........................................................8
2.4.Algunas definiciones....................................................9
3. Descripción general del espectrómetro.....................................12
3.1.Sobre los procesos asociados a la espectrometría.......................12
4. Entrada de la muestra.....................................................14
4.1.Entrada por sonda directa..............................................14
4.2.Sistemas de entrada cromatográficos[4,5]...............................15
4.2.1.Cromatografía de gases/Espectrometría de masas.....................15
4.2.2.Cromatografía HPLC/Espectrometría de masas.........................16
5. Fuente de ionización......................................................17
5.1.Descripción de las múltiples fuentes de ionización.....................17
5.2.Introducción Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz(MALDI).....18
5.3.La matriz..............................................................19
5.4.El láser...............................................................20
5.5.MALDI a presión atmosférica (AP-MALDI).................................21
6. Analizador de masa........................................................22
6.1.Introducción a los analizadores de masas...............................22
6.2.Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight - TOF)...................22
6.2.1.Analizador TOF Lineal..............................................23
6.2.2.Analizador TOF Reflector...........................................24
6.2.3.Analizador TOF / TOF...............................................24
6.3.Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)..........24
7. Detector..................................................................26
7.1.Detector de copa de Faraday ...........................................26
7.2.Multiplicador de electrones secundarios................................27
7.3.Detector "Channeltron".................................................27
7.4.Detector de conversión fotónica (Detector "Daly" o de centelleo).......28
7.4.1.Detectores de centelleo y termoluminiscencia.......................28
7.4.2.Descripción de los detectores Daly.................................29
7.5.Detectores multicanal o microcanal.....................................29
7.6.Sintonía y calibración de los espectrómetros de masas..................30
8. Espectros moleculares.....................................................31
9. Introducción a la Espectroscopía Infrarroja...............................33
9.1.La Espectroscopía......................................................33
9.2.Espectrometría infrarroja..............................................33
9.3.Sobre las vibraciones moleculares......................................34
9.4.Modelos vibracionales..................................................35
10. El espetrómetro infrarrojo...............................................37
10.1.Funcionamiento y descripción..........................................37
10.2.Fuente de radiación...................................................40
10.3.Sistema óptico de dispersión..........................................40
10.4.Sistemas de detección.................................................40
10.5.Preparación de las muestras. Cubetas portamuestras....................41
11. Aplicaciones analíticas del espetrómetro infrarrojo......................43
12. Bibliografía y Agradecimientos...........................................45
12.1.Bibliografía..........................................................45
12.2.Agradecimientos.......................................................45
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 4
Acrónimos
RMN: Resonancia magnética nuclear.
Da: Daltons (unidad de masa).
UMA: Unidades de masa atómica.
MALDI: Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz, del inglés: Matrix-
assisted laser desorption.
TOF: Analizador de tiempo de vuelo, del inglés: Time-of-flight
ppm: Partes por millón.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 5
1.Espectroscopia y Espectrometría, ¿Que son?
La espectroscopia surgió con el estudio de la interacción entre la radiación y la materia como
función de la longitud de onda (λ). En un principio se refería al uso de la luz visible dispersada según su
longitud de onda, por ejemplo por un prisma. Más tarde el concepto se amplió enormemente para
comprender cualquier medida en función de la longitud de onda o de la frecuencia. Una extensión
adicional del alcance de la definición añadió la energía (E) como variable, al establecerse la relación
E=hν para los fotones. El análisis espectral en el cual se basa, permite detectar la absorción o emisión
de radiación electromagnética a ciertas longitudes de onda, y relacionar éstas con los niveles de energía
implicados en una transición cuántica.
El espectro se define como una representación gráfica o fotográfica de la distribución de
intensidades de la radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia, en función de la
longitud de onda de dicha radiación. Los espectros son debidos a transiciones entre estados de energía
característicos de la materia. Los espectros pueden ser de emisión, que se obtienen excitando
adecuadamente la materia para que emita radiación electromagnética y de absorción, obtenidos
sometiendo a la materia a una radiación electromagnética continua y representando la proporción de
radiación absorbida por la misma en función de la frecuencia o longitud de onda.
La espectrometría es la técnica espectroscópica para tasar la concentración o la cantidad de
especies determinadas. En estos casos, el instrumento que realiza tales medidas es un espectrómetro o
espectrógrafo. La espectrometría a menudo se usa en física y química analítica para la identificación de
sustancias mediante el espectro emitido o absorbido por las mismas. También se usa mucho en
astronomía y detección remota. La mayoría de los grandes telescopios tienen espectrómetros, que son
usados para medir la composición química y propiedades físicas de los objetos astronómicos, o para
medir sus velocidades a partir del efecto Doppler de sus líneas espectrales.
Figura 1-1: Dispersión de luz en un prisma triangular.
1.1.Métodos espectrométricos
1.1.1.Según la naturaleza de la excitación medida
El tipo de espectrometría depende de la cantidad física medida que normalmente es una
intensidad de energía absorbida o producida. La naturaleza de la excitación puede ser:
Electromagnética: Basada en interacciones de la materia con radiación electromagnética como la
luz.
De electrones: Utiliza interacciones con haces de electrones. La espectroscopia Auger implica
inducir el efecto homónimo mediante la incidencia de un haz de electrones. En este caso la
medida considera la energía cinética del electrón como variable.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 6
De masa: la interacción de especies cargadas con campos magnéticos y/o eléctricos, dando lugar
a un espectro de masas. El término "espectroscopia de masas" no resulta representativo, ya que
la técnica se emplea principalmente como una forma de medida de la energía cinética de la
partícula, aunque produzca realmente un espectro para la observación y tenga a la masa (m)
como variable.
Acústica: La energía es provista por ondas de sonido.
Dieléctrica: Mediante un campo eléctrico externo se ponen en evidencia las propiedades
dieéctricas del material en función de la frecuencia.
Mecánica: Emplea la energía de un estrés mecánico externo, por ejemplo una torsión aplicada a
un trozo de material.
1.1.2.Según el proceso de medida
La mayoría de los métodos espectroscópicos se diferencian en atómicos o moleculares según si
se aplican a átomos o moléculas. Junto con esta diferencia, se pueden distinguir los siguientes tipos de
espectrometría según la naturaleza de su interacción:
● De absorción. Usa el rango de los espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia
absorbe. Incluye la espectrometría de absorción atómica y varias técnicas moleculares, como la
espectrometría infrarroja y la resonancia magnética nuclear (RMN).
● De emisión. Usa el rango de espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia irradia
(emite). La sustancia primero debe absorber la energía. Esta energía puede provenir de una
variedad de fuentes, que determina el nombre de la emisión subsiguiente, como la
luminescencia. Las técnicas de luminescencia moleculares incluyen la espectrofluorimetría.
● De dispersión. Mide la cantidad de luz que una sustancia dispersa en ciertas longitudes de onda,
ángulos de incidencia y ángulos de polarización. El proceso de dispersión es mucho más rápido
que el proceso de absorción/emisión. Una de las aplicaciones más útiles es la espectroscopia
Raman.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 7
2.Introducción a la Espectrometría L.A.S.E.R.
2.1.¿Que es la Espectrometría de Masas?
La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica microanalítica usada para identificar
compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y
propiedades químicas de moléculas. La detección de compuestos puede ser llevada a cabo con
cantidades realmente pequeñas (algunos pico-moles = 1*10
-12
moles) de muestra y provee información
característica como el peso y algunas veces la estructura del analito. En todos los casos, alguna forma
de energía es transferida a las moléculas a analizar para efectuar la ionización. En la técnica clásica de
impacto electrónico (electrón ionization: EI), algunas de las moléculas ionizadas del analito
“explotan” en una variedad de fragmentos ionizados. Tanto el patrón de fragmentación resultante así
como los iones residuales determinan el espectro de masas. El espectro de masas de cada compuesto
es único y puede ser usado como su “huella química” para caracterizar el analito. Para muestras
grandes, tales como biomoléculas, las masas moleculares pueden ser medidas con una precisión de
0,01% del total de la masa molecular de la muestra. Por ejemplo: para una muestra de 40.000 [Da] o
unidades de masa atómica (UMA), tendríamos un error de 4 [Da]. Esto es suficiente para permitir que el
menor cambio de masa, sea detectado; por ejemplo: la sustitución de un aminoácido por otro o una
modificación post-traslacional. Para el caso de moléculas orgánicas pequeñas, la masa molecular puede
ser medida con una precisión de 5 [ppm] o menos; dicha precisión es a menudo suficiente para
confirmar la fórmula molecular del compuesto, y también es un requisito estándar para la publicación en
una revista de química a nivel científico. La información estructural puede obtenerse usando cierto tipo
de espectrómetros de masa, generalmente de aquellos con múltiples analizadores, los cuales son
conocidos como espectrómetros de masas en tándem. Esto se consigue mediante la fragmentación de
la muestra en el interior del instrumento y el análisis de los productos generados.
Figura 2-1: Esquema de la espectrometría de masas.
2.2.Principios de la técnica
El proceso de análisis por espectrometría de masas comienza llevando el compuesto a analizar a
fase gaseosa. La muestra debe tener una presión de vapor de 10
-4
a 10
-5
[torr], debido a que las
moléculas deben migrar por difusión desde el sistema de entrada hacia la cámara de ionización. Las
muestras pueden ser introducidas al espectrómetro de masas usando una sonda directa o por entrada
en lote (batch) para sólidos puros o líquidos volátiles. Ya que las moléculas neutras difunden en
forma aleatoria por la fuente de ionización, solo una porción es ionizada. El proceso de ionización
más común en análisis en fase gaseosa es el de ionización electrónica (EI). En este se transfiere energía
a la molécula neutra en estado de vapor, para lograr la expulsión de uno de sus electrones y de ese
modo tener un ion con carga positiva y un electrón libre. La molécula ionizada puede recibir excesiva
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 8
energía provocando la rotura de varios enlaces químicos y la consecuente producción de fragmentos
ionizados cuya masa es igual a la suma de las masas atómicas de un grupo de átomos que retienen la
carga positiva durante el proceso de fragmentación.
Para compuestos no volátiles, iones de la molécula intacta son producidos al pasar la solución
por un campo eléctrico (electrospray ionization) o por bombardeo de partículas (fast atom
bombardment) o por interacción con especies fotoexcitadas (matrix-assisted laser desorption). Después
de producir los iones, el siguiente paso es su análisis en el analizador de iones de acuerdo a
su relación masa/carga (m/z). La carga eléctrica de los iones permite controlarlos por medio de campos
eléctricos y separarlos por su valor m/z en el analizador de masas. Existen diferentes tipos de
analizadores de masas: magnéticos, trampa de iones magnética, cuadrupolar, trampa de iones
cuadrupolar, tiempo de vuelo (time-of-flight). Los iones son analizados de acuerdo a su abundancia (o
sea, de acuerdo a su mayor o menor cantidad, véase figura 2-3) a lo largo de la escala m/z. Durante el
proceso de adquisición de datos provenientes del detector, los datos pueden ser organizados en
forma tabular o en formato de gráfica de barras para dar finalmente el espectro de masas de la muestra
analizada.
Figura 2-2: Esquema de un espectrómetro de masas por impacto electrónico (EM-IE).
En Resumen: En un espectrómetro de masa se convierte a las macromoléculas (analito) en iones
gaseosos y éstos son diferenciados por el analizador según su relación m/z (z, carga del ion; m, masa
molar o peso molecular del ion), obteniéndose así información de su peso molecular.
2.3.Implementación
Los Espectrómetros de masas se utilizan en la industria y en los ambientes académicos con fines
de investigación. La siguiente lista es solo un breve resumen de las principales aplicaciones:
Biotecnología: Análisis de proteínas, péptidos, oligonuclótidos.
Farmacéutica: Descubrimiento de fármacos, química combinatoria, farmacocinética, metabolismo
de drogas.
Clínica: neonatal, análisis de hemoglobina, análisis de drogas.
Medio ambiente: PAHs, PCBs, calidad de agua, contaminación de alimentos
Geológica: composición del petróleo.
Otros: Análisis elementales de semiconductores, biosensores y cadenas poliméricas complejas.
A continuación se presenta una lista de implementaciones específicas de la espectrometría de masas,
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orientada al uso cotidiano de la misma:
● Monitorear los gases de la respiración en pacientes durante cirugía.
● Determinar la composición de materiales provenientes del espacio exterior.
● Determinar la adulteración en la miel de abeja.
● Localizar depósitos petroleros (midiendo precursores del petróleo en rocas).
● Monitorear fermentaciones en linea (industria biotecnológica).
● Detectar contaminantes orgánicos en aire, agua, suelo y alimentos.
● Determinar algunos tipos de envenenamiento (criminalística).
Figura 2-3: Ejemplo de resultados obtenidos de la espectrometría de masas.
2.4.Algunas definiciones
Como se vio en la sección 2.3, el uso de la espectrometría de masas abarca áreas relacionadas a
la química, muy específicas, por lo que a continuación definiremos algunas palabras que se suelen
encontrar íntimamente ligadas a la espectrometría.
Genoma: Información genética completa constituída por la codificación de las cuatro bases
químicas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Secuencia que produce 3000
millones de letras de código o pares de bases en el genoma humano.
Proteoma: Término sugerido en 1994 por Marc. R. Wilkins, de Proteoma Systems en Sydney,
para designar la totalidad de las proteínas codificadas por un genoma.
Proteómica (Proteomics):La proteómica es el estudio y caracterización de todo el conjunto de
proteínas expresadas de un genoma (proteoma). Las técnicas de proteómica abordan el estudio
de este conjunto de proteínas. La Proteómica permite identificar, categorizar y clasificar las
proteínas con respecto a su función y a las interacciones que establecen entre ellas. De este
modo, se pueden caracterizar las redes funcionales que establecen las proteínas y su dinámica
durante procesos fisiológicos y patológicos. La proteómica se está aplicando en la identificación
de nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades, la identificación de nuevos
fármacos, la determinación proteínas involucradas en al patogenia de enfermedades y el análisis
de procesos de transducción de señales.
Glucómica, Lipómica y Metabolómica (Glycomics, Lipidics y Metabolomics): De la
aplicación de las espectrometría de masa al análisis de otras familias de macromoléculas
biológicas tales como hidratos de carbono, lípidos y metabolitos secundarios han surgido nuevas
áreas de investigación denominadas “Glucómica”, “Lipómica” y “Metabolómica”.
Analito: Muestra de un elemento formada por macromoléculas, separada para su estudio con un
espectrómetro de masas.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 10
Relación masa/carga: Esta expresión, abreviada m/z, es la relación del número de masa (m) de
una partícula dada entre el número (z) de unidades cargadas electrostáticamente (e) que posee
la partícula. Así, m/z es una relación adimensional que es el parámetro medido por el analizador
de masas. La masa de una partícula dada es igual a la suma de sus masas atómicas (en Daltons)
de todos los elementos que componen la partícula. El símbolo para las unidades masa es u, y
corresponde a 1/12 de la masa del 12C, al que se la ha asignado un valor de 12.000000 por
convención.
Iones doblemente cargados: Es posible para una molécula perder dos electrones durante el
proceso de ionización. Estos iones que están doblemente cargados producirán un pico en el
espectro de masas en un valor m/z numéricamente igual a la mitad de la masa molecular del ion.
Los iones doblemente cargados son insignificantes en el espectro de masa para la mayoría de los
compuestos. Sin embargo, para aquellas moléculas que los produzcan en forma estable, los picos
correspondientes en el espectro de masas pueden ser usados en la interpretación de datos.
Ion molecular: El ion molecular resulta de la ionización de la molécula a analizar. Este ion
representa la molécula intacta y es el último precursor de todos los iones fragmentados que
componen el espectro de masas. El pico del ión molecular aparece a un valor m/z
numéricamente igual al peso molecular del compuesto.
Pico base: Es el pico más intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar
las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una intensidad relativa de 100%.
Intensidad relativa: La intensidad relativa de un pico representa su intensidad en comparación
con el pico base. Se representa como un porcentaje respecto al pico base que es 100%. Por
convención, este dato se indica en la izquierda del espectro de masas.
Porcentaje total de ionización: Este término expresa la abundancia de un ion individual
comparado con la suma de las abundancias de todos los iones en un rango de masa especifico.
La escala de porcentaje total de ionización esta representada a la derecha del espectro de masas
con el símbolo (%Sn), este dato puede ser utilizado para comparar diferentes espectros de
masas de diferentes compuestos.
Espectro de masas: Un espectro de masas es una gráfica de intensidad relativa del ion como
función de la relación masa/carga (m/z). El espectro de masas es frecuentemente representado
como un histograma simple. Esta forma de registro de iones y sus intensidades sirven para
establecer el peso molecular y estructura del compuesto a ser analizado. Debido a que ocurre la
fragmentación del analito, las fracciones del ion aparecen en el espectro a valores m/z menores
que la molécula completa ionizada (ion molecular) a partir de es tos datos se deduce la
estructura y peso molecular de la molécula completa.
Desorción: (Del inglés “Desorption”), Desabsorción. Emisión de sustancia previamente
absorbida; Emisión de la pared de la cámara de vacío de combustible o impurezas, previamente
absorbidas. Para el caso del sistema MALDI, se refiere a los iones que son arrancados de la
muestra de materia por el láser, es decir, los iones que son desabsorbidos del analito por la
acción del láser.
Figura 2-4: Desorción, moléculas de analito previamente absorbidas por la matriz son des-absorbidas por efecto del láser.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 11
Espectrometría de masas en tándem: Un instrumento utilizado en laboratorios médicos que
consta de dos espectrómetros de masa en serie conectado por una cámara conocida como célula
de colisión. La muestra que va a ser examinada es esencialmente clasificada y pesada en el
primer espectrómetro de masas, luego es rota en pedazos en la celda de colisión, para ser
nuevamente clasificada/s y pesada/s en el segundo espectrómetro de masa. La espectrometría
de masas en tándem se utiliza en análisis de recién nacidos para detectar moléculas como los
aminoácidos (los componentes básicos de las proteínas) y ácidos grasos. Espectrometría de
masas en tándem puede ser abreviado como tándem MS o MS / MS.
Cromatografía: La cromatografía de gases y líquidos, es una técnica separativa que tiene la
cualidad de conseguir la separación de mezclas muy complejas.
Fotoionización: Ionización (extracción de electrones)por medio de la interacción de radiación
electromagnética.
Péptidos: Los péptidos están formados por la unión de aminoácidos mediante un enlace
peptídico. Este es un enlace covalente que se establece entre el grupo carboxilo de un
aminoácido y el grupo amino del siguiente, dando lugar al desprendimiento de una molécula de
agua[2,6,7].
Protonación: Aumento del número de protones o de átomos de hidrógeno en una molécula.
Deprotonación: Reducción del número de protones o de átomos de hidrógeno en una molécula.
Scintillator[2]: Es un material que exhibe la propiedad de luminiscencia cuando es excitado por
radiación ionizante. Los materiales luminiscentes cuando son impactados por una partícula,
absorben la energía de la misma para luego emitirla en forma de fotón en el rango de luz visible.
El Scintillator se utiliza en investigación en física para detectar ondas electromagnéticas o
partículas. Allí convierte la energía en luz de una longitud de onda que se pueda detectar por
detectores tales como tubos fotomultiplicadores.
Efecto Auger (o electrón Auger): Cuando un electrón es arrancado de una de las capas
internas de un átomo, dejando una vacante o hueco, un electrón de un nivel de energía externo
puede caer en esta vacante, resultando en un exceso de energía. Este exceso de energía es
frecuentemente liberada por la emisión de un fotón (flourescencia de rayos x), aunque también
puede ser transferida a otro electrón, el cual es emitido del átomo. La energía del electrón Auger
corresponde a la diferencia entre la energía de la transición electrónica primaria y la energía de
ionización para la capa de la cual el electrón Auger fue emitido. Esos niveles electrónicos
dependen del tipo de átomo y del ambiente químico en el cual se encontraba el átomo.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 12
3.Descripción general del espectrómetro
Un Espectrómetro de Masas es un instrumento que mide las masas de moléculas individuales
que han sido convertidas en iones. No mide la masa molecular directamente, sino que mide la relación
masa/carga de los iones formados a partir de las moléculas. Los espectrómetros de masas tienen siete
componentes mayores: un sistema de entrada, una fuente de iones, un analizador de masas, un
detector, un sistema de vacío, un sistema de control y un sistema de datos. El sistema de entrada, junto
con la fuente de iones y el tipo de analizador de masas definen el tipo de espectrómetro y las
capacidades del sistema. El diagrama de bloques de la Figura 3-1 muestra los componentes principales
de los espectrómetros de masas. El objetivo del sistema de entrada es, el de introducir una pequeña
cantidad de muestra (un micromol o menos) en el espectrómetro de masas, donde sus componentes se
convierten en iones gaseosos. A menudo, el sistema de entrada contiene un medio para la volatilización
de muestras sólidas o líquidas. La fuente de iones de un espectrómetro de masas convierte los
componentes de una muestra en iones por bombardeo con electrones, iones, moléculas o fotones.
Alternativamente, la ionización se lleva a cabo por energía térmica o eléctrica. En muchos casos el
sistema de entrada y la fuente de iones están combinadas en un único componente. En ambos casos, lo
que se obtiene es un haz de iones positivos o negativos (frecuentemente positivos) que es entonces
acelerado en el analizador de masas. La función del analizador de masas es parecida a la de la rejilla de
un espectrómetro óptico. En el primero, sin embargo, la dispersión está basada en las relaciones
carga/masa de los iones del analito en vez de en la longitud de onda de los fotones. Existen diversos
tipos de espectrómetros de masas, dependiendo de la naturaleza del analizador de masas. A1 igual que
en un espectrómetro óptico, un espectrómetro de masas contiene un detector (para iones) que
convierte el haz de iones en una señal eléctrica que puede ser entonces procesada, almacenada en la
memoria de un ordenador y mostrada o registrada de varias maneras. Un hecho característico de los
espectrómetros de masas, que no es común con los instrumentos ópticos (pero que se encuentra en los
espectrómetros de electrones), es la necesidad de un sistema de vacio adecuado para mantener bajas
presiones (10
-4
a 10
-8
[torr]) en todos los componentes del instrumento excepto el procesador de señal y
dispositivo de lectura.
Figura 3-1: Diagrama en bloques de un espectrómetro de masas.
3.1.Sobre los procesos asociados a la espectrometría
Los procesos básicos asociados con la espectrometría de masas abarcan desde la generación de
iones en fase gaseosa de un analito hasta la medición de las relaciones masa/carga (m/z) de estos
iones. La formación de iones de la muestra en fase gaseosa es un prerrequisito esencial en el proceso
de verificación de masas moleculares o análisis. Aunque los primeros espectrómetros de masas
requerían que la muestra estuviera en forma gaseosa, nuevos desarrollos han permitido incluir
muestras en soluciones líquidas o en una matriz sólida. Dependiendo del tipo de entrada y técnica de
ionización usada, la muestra puede ya estar en forma de iones en solución, o puede ser ionizada en
conjunto con su volatilización por otros métodos en la fuente de iones. El hecho de estudiar el analito a
través de iones en fase gaseosa le da a la espectrometría dos características fundamentales:
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 13
La primera es que el movimiento de los iones en fase gaseosa puede ser controlado en forma
precisa por campos electromagnéticos . El hecho de que la movilidad de los iones es proporcional
a la relación m/z del ion, nos permite la medición de la m/z y por lo tanto de la masa del analito.
Los detalles concernientes a diferentes tipos de técnicas de análisis de masas y técnicas de
ionización utilizadas determinan factores tales como la precisión y exactitud de la medición de
m/z, la resolución, y el rango de m/z del analizador.

La segunda es que el uso de iones en fase gaseosa incrementa la sensibilidad del espectrómetro
de masas. El movimiento preciso de iones en campos electromagnéticos que permiten medir m/z
también les provee contención y enfoque.
Durante el proceso de medida de m/z, los iones son transmitidos con gran eficiencia a los
detectores de partículas que registran la llegada de estos iones. Estas llegadas son detectadas con gran
sensibilidad debido a una combinación de señales de bajo fondo y la eficiente generación de electrones
secundarios que pueden subsecuentemente ser multiplicados por factores de 10
5
o mayores. El
mantenimiento de la precisión y exactitud de estos movimientos y por lo tanto de la sensibilidad
del análisis requiere operación experta del sistema de espectrometría de masas. Algunas desventajas
del uso de iones en fase gaseosa es la dificultad de la generación de los iones y de llevarlos a la fase
gaseosa, además de la complejidad de los instrumentos utilizados en este tipo de experimentos. Dicha
complejidad se traduce en altos precios de adquisición y mantenimiento de los mismos. Sin embargo,
por un lado el desarrollo de la ionización por electrospray y MALDI han aportado dos importantes
métodos para la producción de iones de péptidos y proteínas en fase gaseosa; y por otro, la
sofisticación, productividad y reproducibilidad de los experimentos desarrollados puede justificar el
costo de la espectrometría de masas que resulta proporcional a los costos asociados con otros
componentes involucrados en los proyectos de investigación o desarrollo que requieren este tipo de
análisis.
Nota: En las siguientes secciones se realizará una descripción de los componentes fundamentales que
forman y, en algunos casos, dan nombre a los espectrómetros de masas.
COMPONENTE VARIANTES
Sistema de entrada a) Directo.
b) Columna capilar cromatografía líquida.
Fuente de iones a) Impacto electrónico.
b) Ionización Química.
c) Ionización de campo.
d) Deserción de campo.
e) Bombardeo con Átomos Rápidos.
f) Electrospray, incluyendo nanospray y
microspray.
g) Matrix-assisted laser desorption (MALDI)
Analizador de masas a) Cuadrupolo.
b) Trampa de iones (Ion-trap).
c) Tiempo de vuelo (Time-of-flight TOF).
d) Analizador FT-ICR
Tabla 3-1: Variantes de componentes del sistema de espectrometría de masas.
Nota: En el presente informe nos avocaremos a estudiar los métodos de espectrometría que
implementan L.A.S.E.R. Para mayor información sobre los demás métodos se recomienda ver la
bibliografía[3].
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4.Entrada de la muestra
La finalidad del sistema de entrada es la de permitir la introducción de una muestra
representativa en la fuente de iones con la mínima pérdida de vacío. Los espectrómetros de masas más
modernos están equipados con dos tipos de entradas, la de sonda directa y las cromatográficas, con lo
que son capaces de acomodar diversos tipos de muestras.
4.1.Entrada por sonda directa
Para sólidos razonablemente puros, la muestra es colocada sobre la punta de una barra o sonda
que es introducida dentro del espectrómetro a través de un sistema de vacío (cámara intermedia). La
cámara intermedia está diseñada para limitar el volumen de aire que puede entrar en la región de
ionización durante la inserción de la sonda. Las sondas se utilizan también cuando la cantidad de
muestra es limitada. Por tanto, los espectros de masas se pueden obtener a menudo con una cantidad
de muestra tan pequeña como unos pocos nanogramos. En una sonda, la muestra se pone
generalmente en la superficie de un vidrio o en un tubo capilar de aluminio, un alambre fino o una copa
pequeña y la sonda se coloca a unos pocos milímetros de la fuente de ionización y de la rendija que
conduce al espectrómetro. La muestra es entonces evaporada o sublimada en una fase gaseosa,
usualmente por medio de calor. Gases y líquidos pueden ser introducidos a través de sistemas de
entrada diseñados especialmente con un control de flujo, llamados sondas directas (direct probes),
estos dispositivos transfieren la muestra desde el exterior a través de un sistema de vacío hacia la
fuente de ionización que esta a alta presión; Figura 4-1 y 4-2. Estas sondas pueden ser diseñadas para
soportar muestras para ser ionizadas por distintos métodos. Una vez que la muestra está es fase
gaseosa es ionizada y frecuentemente fragmentada para proceder al análisis de masas. En algunas
técnicas especializadas, la volatilización y la ionización de la muestra ocurren al mismo tiempo.
Figura 4-1: Esquema de un sistema de introducción de muestra por
sonda para introducir una muestra en la fuente de iones (DIP).
Figura 4-2: Sondas directas (direct probes).
La baja presión del área de ionización y la proximidad de la muestra a la fuente de ionización a
menudo hace posible la obtención de espectros de compuestos inestables térmicamente antes que se
descompongan. La baja presión proporciona también una mayor concentración de compuestos
relativamente no volátiles en el área de ionización, de modo que, la sonda permite el estudio de
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 15
materiales no volátiles tales como carbohidratos, esteroides, especies organometálicas y sustancias
poliméricas de bajo peso molecular. El requisito principal de la muestra es que alcance una presión
parcial de al menos 10
-8

[torr] antes que empiece a descomponerse.
4.2.Sistemas de entrada cromatográficos[4,5]
Para obtener el espectro de masas de un compuesto simple de una mezcla, los componentes
individuales deben ser separados antes del análisis de espectrometría de masas. La separación de los
compuestos es necesaria para tener certeza de la identificación, ya que dos o más compuestos
presentes en la muestra pueden crear espectros que se superpongan o mezclen, dificultando así el
análisis de los datos obtenidos. Desde que en la década de los 60´s se acopló la cromatografía de gases
(GC) a la espectrometría de masas, esta conexión permitó separar compuestos ya en fase gaseosa para
su entrada al espectrómetro. Al entrar las distintas fracciones en diferentes tiempos en forma continua
permite un análisis secuencial de las muestras. Recientemente, equipos de cromatografía de líquidos
(LC), cromatografía de fluidos supercríticos, HPLC y electroforesis capilar, utilizados para separar
compuestos, se han comenzado a acoplar a espectrómetros de masas para análisis de muestras
complejas. El acoplamiento de una columna cromatográfica a un espectrómetro de masas requiere la
utilización de sistemas de entrada especiales, algunos de los cuales se describen a continuación.
Figura 4-3: Columnas de cromatografía.
4.2.1.Cromatografía de gases/Espectrometría de masas
Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen equipos de cromatografía de gases que pueden
acoplarse directamente con distintos tipos de espectrómetros de masas de barrido rápido. El caudal de
las columnas capilares en general es suficientemente bajo como para que la salida de la columna pueda
introducirse directamente en la cámara de ionización de un espectrómetro de masas. Desde finales de
los años setenta han aparecido en el mercado diversos espectrómetros de masas diseñados
específicamente como detectores para cromatografía de gases.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 16
4.2.2.Cromatografía HPLC/Espectrometría de masas
Un problema fundamental del acoplamiento de la cromatografía de líquidos con la
espectrometría de masas es el enorme contraste que existe entre los volúmenes relativamente grandes
de disolvente de la primera y los requerimientos de vacío de la última. Para resolverlo se han
desarrollado diversas interfaces. Las técnicas que se usan rutinariamente en la actualidad para la
introducción y análisis de muestras líquidas, pueden clasificarse en dos grupos: las que solo introducen
la muestra líquida en la fuente iónica del instrumento tales como las de haz de partículas (PB, Particle
Beam) y las que además consiguen la ionización de la misma (TSP = Thermospray o termonebulización,
LC-FAB = Liquid chromatography - Fast Atom Bombardment, ESI= Electrospray Ionization). En la Tabla 4-
1, se muestran algunas de las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas.
Tipo Límite de
detección
Rango de flujo
del LC
Tipos de
disolventes
Muestras
semivolátiles
Muestras no
volátiles /
termovolátiles
Rango de
pesos
moleculares
DLI XX X XXX XXXX XX XX
Cinta XX XXXXX XXXXX XXXXX X X(X)
TSP XX(XX) XXXXX XXXX XXXXX XXX(X) XXX(X)
LC/FAB XX(XX) X XXX XXXX XXXXX XXXX
PB XX XXX(X) XXXX XXXXX X(X) X(X)
ESI XXXX(X) X XX(X) XXXX XXXXX XXXXX
Tabla 4-1: Ventajas e inconvenientes de las interfaces LC/MS. Mayor número de X
indica mayor rendimiento. Entre paréntesis se indica el rango de la respuesta.
Figura 4-4: Métodos cromatográficos.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 17
5.Fuente de ionización
5.1.Descripción de las múltiples fuentes de ionización
Históricamente, los iones para análisis de masas se producían por bombardeo de los
componentes de muestras gaseosas con electrones de elevada energía. A pesar de ciertas desventajas,
esta técnica todavía tiene una gran importancia y es en la que se basan la mayor parte de las
bibliotecas de espectros. Sin embargo, durante las dos últimas décadas se han desarrollado varias
nuevas fuentes de iones que ofrecen ciertas ventajas sobre la clásica fuente de haz de electrones. La
Tabla 5-1 da un listado de éstas.
Normalmente, la mayoría de los espectrómetros de masas comerciales están equipados con
accesorios que permiten el uso de varias de estas fuentes, intercambiables. Nótese que las fuentes que
se indican en la Tabla 4-1 pertenecen a dos categorías. La primera corresponde a las fuentes de fase gas
en las que la muestra es primero volatilizada y a continuación los componentes gaseosos son ionizados
de diversas maneras. La segunda categoría de fuentes es la de fuentes de desorción en la que se
prescinde de la vaporización de la muestra y en consecuencia, esta técnica requiere siempre la
utilización de una sonda de muestra. En este caso, la energía se transmite a la muestra sólida o líquida,
de maneras muy diversas produciendo la ionización y la transferencia directa de iones de la fase
condensada al estado gaseoso iónico. La mayor ventaja de la ionización por desorción es que permite el
examen de moléculas no volátiles y térmicamente inestables tales como las que se encuentran
normalmente en bioquímica.
Las fuentes de iones se clasifican a menudo en duras o blandas. La fuente dura más importante
es la fuente de impacto de electrones (para más detalles remítase a la bibliografía [3]). Estas fuentes
duras comunican energías elevadas a los iones formados de manera que se encuentran en estados
vibracionales y rotacionales excitados. La relajación de estos iones produce una gran cantidad de
fragmentación y resultan espectros de masas complejos. Por el contrario, las fuentes blandas, tales
como las fuentes de ionización química y la de desorción, producen relativamente poca excitación de los
iones, de modo que, tiene lugar poca fragmentación, y los espectros son sencillos. Ambos tipos de
espectros son útiles.
Los espectros sencillos de las fuentes blandas permiten la determinación exacta del peso
molecular del analito, mientras que los modelos espectrales más complejos de las fuentes duras a
menudo permiten una identificación inequívoca del mismo. El método de ionización que se utilizará
dependerá del tipo de la muestra, objeto de la investigación y el espectrómetro de masa disponible. A
continuación se presenta una lista de los métodos de ionización:
Electron Impact (EI) - Ionización por impacto de electrones.
Fuentes de ionización química - (CI = Chemical ionisation).
Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) – Ionización química por presión atmosférica.
Fuentes de ionización a presión atmosférica (API).
Fuentes de ionización de campo (FI = Field ionisation).
Fuentes de desorción de campo (FD = Field desorption).
Fuentes de bombardeo por átomos rápidos (FAB=Fast Atom Bombardment) o iones (SIMS =
Secondary ion MS).
Ionización por Electrospray (Electrospray Ionization ESI).
Thermospray Ionisation (TSP) – Ionización por termo spray.
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) – Desorción / ionización láser asistida por
matriz.
Nota: En el presente informe nos concentraremos en el método de espectrometría que usa ionizador
láser.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 18
Nombre Abreviatura Tipo Agente ionizante
Ionización por electrones EI Fase gas Electrones energéticos
Ionización química CI Fase gas Iones reactivos
Ionización por campo FI Fase gas Electrodo de elevado
potencial
Desorción por campo FD Desorción Electrodo de elevado
potencial
Bombardeo con átomos
rápidos
FAB Desorción Átomos energéticos
Espectrometría de masas
de iones secundarios
SIMS Desorción Iones energéticos
Desorción por láser LD Desorción Haz láser
Desorción por plasma PD Desorción Fragmentos de fisión de
elevada energía
Desorción térmica Desorción Calor
Ionización
electrohidrodinámica
EHMS Desorción Campo elevado
Ionización por
termovaporización
ES Cargas positivas aplicadas
sobre finas gotitas de la
disolución de la muestra
Tabla 5-1: Fuentes de ionización.
5.2.Introducción Desorción/Ionización Láser Asistida por
Matriz(MALDI)
La ionización MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, desorción/ionización mediante
láser asistida por matriz), es una técnica de ionización suave, la misma permite el análisis de
biomoléculas(biopolímeros, como proteínas, péptidos y azúcares), y de grandes moléculas orgánicas
(como los polímeros, dendrímeros y otras macromoléculas), que tienden a ser frágiles y fragmentar
cuando son ionizadas por los métodos convencionales de ionización. En lo que se refiere a su suavidad y
a los iones producidos MALDI es muy similar a la ionización por electrospray. La ionización es provocada
por un rayo láser (normalmente un láser de nitrógeno).
Figura 5-1: Esquema de la espectrometría de masas MALDI.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 19
5.3.La matriz
En este método de ionización los analitos son disueltos en una solución de un compuesto que
absorbe UV, llamado matriz (matrix), y colocado dentro del espectrómetro de masas. Debido a que los
solventes se van secando, los compuestos de la matriz se cristalizan y los analitos quedan contenidos
dentro de la matriz de cristales (se dice que el analito se co-cristaliza con la matríz).
Figura 5-2: Matriz.
La matriz se utiliza para proteger a la biomolécula de ser destruida por el impacto directo del
rayo láser y para facilitar la vaporización y la ionización; la misma actúa como intermediaria en el
proceso de transferencia de energía del haz láser a los analitos. En el proceso de conversión de las
moléculas neutras de analito a especies cargadas o iones (generalmente protonados), la matriz juega un
papel fundamental al ceder protones (H+) a los analitos. Una solución para una matriz se hace, a
menudo en una mezcla de agua muy purificada y un disolvente orgánico (normalmente acetonitrilo
(ACN) o etanol). Ácido trifluoroacético (TFA) puede ser también añadido. Un buen ejemplo de una
solución para matriz sería de 20 mg / ml de ácido sinapinic en ACN: agua: TFA (50:50:0.1). En la figura
5-2 se pueden observar los distintos compuestos utilizados en las matrices MALDI.
Figura 5-3: Distintos compuestos utilizados en matrices MALDI.
consideraciones:
Los compuestos utilizados son de bajo peso molecular (para permitir la fácil vaporización), pero
son lo suficiente mente grandes (con una presión de vaporización lo suficientemente baja) para
que no se evapore durante la preparación de la muestra o mientras están en el espectrómetro.
Son ácidos, por lo tanto, actúan como una fuente de protones para fomentar la ionización del
analito.
Tienen una fuerte absorción óptica en la gama de los UV, para absorber rápida y eficientemente
la radiación del láser.
Son fusionados con grupos polares, lo que permite su uso en soluciones acuosas.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 20
La solución (analito-ácido) es colocada sobre un plato MALDI (generalmente una placa metálica
diseñada para éste propósito). Los platos son de acero pulido, plata o cromo plateado
Figura 5-4: Contenedor de plata para 10 muestras, cada pozo mide 23 mm de diámetro(Izq.). Detalle del pozo 10 del contenedor;
(Der.) el rectángulo muestra el lugar donde impactará el láser. La línea blanca es un rasguño. La muestra aplicada es una solución
en acetona que formó una capa cristalina. Se necesitan entre 10-100 disparos del láser para evaporar la capa completamente.
Los solventes se vaporizan dejando solo la matriz recristralizada, pero ahora las moléculas del analito se
han propagado por todos los cristales. Se dice entonces que la matriz y el analito se han co-cristalizado
en la placa MALDI.
5.4.El láser
Pulsos de láser de luz UV son utilizados para vaporizar pequeñas cantidades de la matriz, donde
se incluyen los iones del analito, y llevarlos a la fase gaseosa en el proceso (Figura 5-5).
Figura 5-5: Esquema de la Desorción/Ionización Láser.
La ionización del analito se puede dar por deprotonación (protonación), al aceptar o ceder un
electrón, por unión de cationes o fotoionización, por lo que los iones generados por MALDI son de una
amplia variedad de moléculas, ya que dependiendo de la combinación entre el analito y la matriz será el
tipo de iones predominantes en el espectro obtenido. Comúnmente la ionización ocurre por protonación
en el ambiente ácido producido por los compuestos de la matriz y por la adición de ácido diluido en la
muestra. La protonación de péptidos es particularmente eficiente en ambientes ácidos, haciendo de
MALDI, un método efectivo para producir péptidos protonados. Debido a que con la desorción por láser
la producción de iones es discreta y en pequeños paquetes, el MALDI esta comúnmente combinado con
un analizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un sistema de alta sensibilidad. Mientras que ESI es
afectado por especies contaminantes, MALDI puede tolerar niveles variables de algunos contaminantes.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 21
Cada pulso láser genera una pequeña cantidad de plasma que se expande en vacío, del cual se extraen
los iones (positivos o negativos) del analito que son acelerados por un potencial de 10-30 kV y
controlados por medio de campos electromagnéticos.
El tipo de láser más común en ésta clase de espectrómetros es el de nitrógeno. Este es un láser
de fácil montaje y numerosas aplicaciones. Debido a sus componentes de bajo coste y la abundancia del
medio activo (N
2
o simplemente aire), el láser de nitrógeno puede ser construido con pocos recursos y
con básicos conocimientos técnicos. Desde su descubrimiento en 1963, el láser de Nitrógeno molecular
ha sido optimizado hasta obtener pulsos ultracortos y de gran potencia. En la actualidad se han
registrado emisiones de pulsos ultravioleta del orden de 5ns, centrados en los 337.1nm y con potencias
que van desde unas centenas de kW hasta los 5MW. Mejoras como el bombeo por descarga o por un haz
de electrones han hecho que el láser de nitrógeno molecular sea hoy en día una herramienta versátil
tanto en la industria como en la investigación. Las características diferenciales de la radiación láser son:
Alta direccionalidad (la desviación respecto a un haz exactamente paralelo es de sólo algunos
miliradianes). Ello se debe al estricto alineamiento de los dos espejos situados en ambos
extremos de la cavidad.
Monocromaticidad, debido a los límites impuestos por la ley de Planck y la condición de que la
longitud de la cavidad láser debe ser un múltiplo entero de semilongitudes de onda.
Brillo extremadamente elevado, ya que el ángulo sólido en el que se distribuye la radiación es
muy pequeño.
Coherencia espacial y temporal, debido a que las ondas asociadas a todos los fotones están en
fase.
En el láser de nitrógeno se aplica un pulso de alto voltaje (20 kV de C.A.), disparado por un descargador
o tiratrón, que atraviesa la cavidad.
Figura 5-6: Láser de nitrógeno.
5.5.MALDI a presión atmosférica (AP-MALDI)
MALDI a presión atmosférica es una técnica de ionización que, en contraste con MALDI en vacío,
opera en condiciones de presión atmosférica. Los iones en MALDI en vacío se forman a una presión de
10 mTorr o menos, mientras que en la AP-MALDI, los iones se forman a presión atmosférica. La
desventaja de este método es la limitación de la sensibilidad y del rango de masa. AP-MALDI se utiliza
en una variedad de aplicaciones de la espectrometría de masa, que va desde la proteómica hasta el
campo del descubrimiento de fármacos. La fuente de iones AP-MALDI es fácilmente acoplable a un
espectrómetro de masas de trampa de iones o cualquier otro sistema de espectrometría equipado con
ESI (ionización por electrospray) o fuente nano ESI.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 22
6.Analizador de masa
6.1.Introducción a los analizadores de masas
Los analizadores de masas llevan a cabo la separación de los iones producidos por diferentes
métodos en una fuente de iones, de acuerdo a su relación masa/carga (m/z) para que puedan llegar al
detector. La unidad para m/z es el Thomson (Th). En los experimentos de espectrometría de masas
aparecen dos clases principales de iones, el ion molecular, que es la molécula completa del analito, y
fragmentos iónicos, los cuales contienen solo una parte de la estructura. El peso molecular de una
molécula puede ser calculado de la m/z del ion molecular, si la carga (z) es conocida, la información
estructural se obtiene a partir de las m/z de los fragmentos del ion. Una variedad de analizadores de
masas están disponibles para realizar estas mediciones, incluyendo cuadrupolo (quadrupole), trampa de
iones (ion-trap), tiempo de vuelo (time-of-flight), sector magnético (magnetic sector), ciclotrón (ion
cyclotron resonance) y otros. Cada tipo de analizador posee características y aplicaciones especiales, así
como beneficios y limitaciones. La selección del tipo de analizador a utilizar es en base a que aplicación
se le dará, el costo y el rendimiento deseado, ya que el analizador determina varias características del
resultado del experimento, entre estas la resolución y el rango de m/z de los iones que pueden ser
medidos.
Nota: En el presente informe nos limitaremos a los analizadores utilizados en los equipos de
espectrometría láser.
6.2.Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight - TOF)
El principio de operación del analizador de tiempo de vuelo (time-of-flight: TOF) involucra la
medición del tiempo requerido por un ion para viajar desde la fuente de iones hasta el detector
localizado a 1 o 2 mts. de la fuente. Todos los iones reciben la misma energía cinética durante la
aceleración instantánea (3000 eV), pero debido a que tienen diferentes valores de m/z, se separan en
grupos de acuerdo a su velocidad (por lo tanto m/z) como van recorriendo la región libre de campo entre
la fuente de iones y el detector. Los iones chocan secuencialmente en el detector en forma de un
incremento de m/z. Los iones de baja m/z llegan al detector antes que aquellos con m/z alta debido a
que entre mas m/z tengan los iones tendrán una velocidad menor (Figura 6-1).
Figura 6-1: analizador TOF.
La energía cinética de un ion se define por:
Ec = eV =
m∗v
2
2
; Ec6-1
La velocidad del ion:
v =
2 z eV
1/2
m
; Ec 6-2
Debido a que es impráctico medir directamente la velocidad del ion; el tiempo de vuelo desde la fuente
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 23
de iones hasta el detector (separados por una distancia L) provee la información necesaria:
tof =
L
v
=
Lm
2 z eV
1/2
; Ec6-3
El valor de m/z para un ion es determinado por su “tof” (tiempo de vuelo) al detector calibrado
con los tof de al menos 2 iones de m/z conocida. El tiempo de tránsito de un ion de 3000 eV de 800 m/z
es aproximadamente 30 µseg a través de un tubo de 1m de vuelo, el ciclo de producción de iones,
aceleración y detección es completado en un periodo de aproximadamente 100 µseg para un rango
mayor de 1000 m/z. Los iones que parten de la fuente de iones en un espectrómetro de masas TOF no
tienen los mismos tiempos de partida ni exactamente la misma energía cinética, por lo que estos
aparatos han sido diseñados para compensar estas diferencias. El analizador TOF es el analizador de
masas más rápido, tiene alta transmisión de iones y el rango de masas más grande de todos los
analizadores de masas. Algunas limitaciones son que en muchas ocasiones requieren exclusivamente de
un método de ionización por pulsos y que la selectividad de los iones puede limitarse en algunos
experimentos. Casi todos los sistemas MALDI están en conjunto con un analizador de TOF, los sistemas
GC/MS con TOF poseen una alta velocidad de análisis.
Figura 6-2: Espectrómetro MALDI-TOF.
6.2.1.Analizador TOF Lineal
A la salida de la fuente de ionización los iones son acelerados en un campo eléctrico (30 kV de
C.A) y conducidos a una zona de deriva libre de campos. Este voltaje de aceleración proporciona a todos
los iones la misma energía cinética y, por lo tanto, distintas velocidades en función de sus relaciones
masa-carga. Los iones más livianos viajarán a mayor velocidad a lo largo de la zona de deriva y llegarán
antes al detector, el cual registra los “tiempos de vuelo” de los distintos iones. Dichos tiempos son del
orden de entre 1 a 30 µs. A partir de los tiempos de vuelo pueden derivarse las relaciones masa-carga
de los iones.
Figura 6-2: Analizador TOF lineal.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 24
6.2.2.Analizador TOF Reflector
La principal limitación de los analizadores TOF lineales es la relativamente baja resolución que
alcanzan debido a la dispersión energética del paquete de iones generado y otros factores como la
formación diferida de iones (iones que se forman en diferentes momentos) y los efectos espacio-carga.
Se consigue una notable mejora añadiendo al dispositivo un reflectrón o espejo iónico que, mediante un
campo electrostático, refleja los iones hacia un segundo detector. De esta manera, iones con la misma
relación masa carga pero con energías cinéticas mayores penetran más profundamente en el reflectrón,
retrasándose su tiempo de llegada al detector reflector respecto al de los iones de menor energía. Si un
paquete de iones de una m/z dada contiene iones con diferentes energías cinéticas, el reflectrón
disminuirá la dispersión de los tiempos de vuelo de los iones, mejorando la resolución del
espectrómetro.
Figura 6-3: Analizador TOF Reflector.
6.2.3.Analizador TOF / TOF
Los analizadores TOF/TOF proporcionan un mejor enfoque de los iones y, por tanto, mayor
resolución y precisión másica. En una primera etapa (TOF 1), los iones son acelerados a bajo voltaje (ca.
7 kV) en condiciones que favorecen la fragmentación metaestable. Un pulsador temporal permite
seleccionar un determinado ion padre y sus iones fragmento y este paquete de iones es a continuación
acelerado a un potencial mayor (ca. 20 kV). El analizador TOF 2 permite separar los iones que
componen el paquete, ricos en energía pero con una distribución energética estrecha.
Figura 6-5: Analizador TOF-TOF.
6.3.Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron
Resonance)
El analizador FT-ICR (Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) es probablemente el método
más complejo de análisis de masas. Esta técnica fue desarrollada en los 50´s, es altamente sensible,
pero tiene limitaciones de resolución de masas (>106 Da). Este tipo de espectrómetros consisten
principalmente de tres secciones, la primera es la fuente de iones (ESI y MALDI son las más comunes),
después la región de transferencia de iones donde los iones producidos son captados, enfocados y
transferidos a una región de alto vacío antes de entrar al analizador, y finalmente el analizador. El
arreglo estándar para el analizador FT-ICR, es una trampa de iones localizada dentro de un campo
magnético especialmente uniforme de una fuerza B
0
. El efecto del campo magnético es obligar a los
iones incidentes a circular en una órbita (Figura 6-5), la frecuencia es determinada por la masa (m), la
carga (z) y velocidad (v) del ion, por acción de la ley de Lorentz. El ion es llevado a una trayectoria
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 25
circular en un plano perpendicular al campo magnético. La frecuencia angular de los iones (wc) se
define por la ecuación 2. El sentido contrario de rotación es experimentado por iones de carga opuesta.
F = z
i
v B
0
; Ec 6-4
u
c
=
z
i
B
0
2¬m
i
; Ec 6-5
m
i
=
B
0
2 z
i
¬u
c
; Ec6-6
Donde :
F=fuerza de lorentz
B
0
=campo magnético
m
i
=masa del ion
z
i
=carga del ion
v=velocidad incidente del ion
u
c
= frecuencia rotacional inducida(ciclotrón)
Figura 6-5: Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance).
La presencia de iones entre el par de electrodos (en la trampa) no producirá ninguna señal
medible, por lo que es necesario excitar los iones de una m/z dada como un paquete a un radio orbital
mayor al aplicar barrido de potencial RF de milisegundos. Una frecuencia excitará una m/z particular (la
transformación de Fourier permite medir simultáneamente todas las frecuencias). La medición de la
frecuencia angular (ω
c
) lleva a valores de m/z y al espectro de masas. Debido a que la frecuencia puede
ser medida más exactamente que otras propiedades físicas, esta técnica de análisis tiene una gran
resolución. Después de la excitación, los iones regresan a su estado normal. Este tipo de analizadores
poseen la resolución de masas mas alta, alta capacidad, y acoplamiento a métodos de ionización por
pulsos (MALDI); es un método no destructivo, pero posee un rango de masa limitado, puede sufrir
efectos por cargas y por reacciones entre los iones, se deben cuidar muchos parámetros para tener
buenas mediciones. Se acopla bien a MALDI y ESI.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 26
7.Detector
Comercialmente son asequibles varios tipos de detectores para espectrómetros de masas. En los
primeros años predominaban los multiplicadores de electrones de detección puntual situados en el
ambiente de alto vacío del espectrómetro. Estos mediante un proceso de avalancha, transforman las
partículas incidentes en señales eléctricas mensurables. Mas tarde fueron apareciendo nuevos
desarrollos para detección puntual, como los detectores "Channeltron" de bajo coste y uso general, y los
sistemas de conversión fotónica mas sofisticados, sensibles y duraderos. También han aparecido
sistemas de detección simultánea, tales como baterías de micromultiplicadores multicanal
(Microchannel Plate o Multichannel Multiplier Array Detector), combinadas normalmente con posterior
centelleo o conversión fotónica, cuya aportación a los nuevos desarrollos instrumentales en
espectrometría de masas ha sido importante. La sensibilidad, precisión, y tiempo de respuesta son
criterios importantes que distinguen los diferentes sistemas de detección de iones. Alta precisión y
rápido tiempo de respuesta son características mutuamente excluyentes. Idealmente, la sensibilidad
debe definir explícitamente la corriente de ion recibida por el detector. La definición debe incluir: (1) el
nombre del compuesto de calibración, (2) el valor m/z del ion medido, (3) el poder de
resolución del instrumento, (4) la cantidad de compuesto de calibración consumido por minuto, (5) la
intensidad de la corriente de electrones y presión de la fuente de iones (para CI: ionización
química), (6) la corriente del ion que llego al detector. Estas unidades de sensibilidad permiten
comparar instrumentos, que en ocasiones es difícil ya que las diferentes compañías usan diferentes
criterios.
7.1.Detector de copa de Faraday
Este es un detector eléctrico convencional, iones positivos que impactan sobre el colector son
neutralizados por electrones después de pasar a través de una resistencia. La caída de voltaje en la
resistencia de acuerdo a un estándar es la medición de la corriente del ion. La señal del voltaje de la
resistencia es entonces amplificada por un amplificador DC o por un electrómetro. La mínima corriente
detectable es del orden de 10
-14
A. El pequeño electrodo de metal que intercepta los iones positivos esta
montado en una jaula de Faraday (Figura 7-1). La corriente del ion medida y amplificada es
directamente proporcional al número de iones y al número de cargas de los iones. La respuesta de la
copa faraday es independiente de la energía, la masa, o la naturaleza química de los iones. Este tipo de
detector es simple, barato, resistente y fiable. Posee alta precisión, sensibilidad y produce poco ruido de
salida. La principal desventaja es que tiene un gran retraso inherente a la simplificación del sistema. Por
esto es que se utiliza para mediciones precisas o de corrientes de iones poco cargados y no debe ser
usado para realizar examinaciones rápidas (por ejemplo en sistemas GC/MS). Se utiliza principalmente
en sistemas para análisis de gases permanentes, en muestras ambientales, reactores, gases residuales,
etc., normalmente combinado con un SEM (Multiplicador de Electrones Secundarios = Secondary
Electron Multiplier), usándose uno u otro según la sensibilidad requerida y el vacío disponible. También
tiene aplicación en los espectrómetros de masas para medida de Relaciones Isotópicas (IRMS = Isotopic
Ratio Mass Spectrometer). En estos equipos se utilizan colectores múltiples, formados por una batería
de copas de Faraday, cada una de las cuales se dedica a la detección de una única masa.
Figura 7-1: Diagrama esquemático del detector Copa de Faraday.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 27
7.2.Multiplicador de electrones secundarios
El multiplicador de electrones (electron multiplier) utiliza el principio de emisión secundaria de
electrones para afectar la amplificación. En el dinodo discreto (discrete-dynode) los iones provenientes
del analizador de masas son enfocados sobre un dinodo que emite electrones en proporción directa al
número de iones bombardeados hacia él. Los electrones secundarios emitidos por el dinodo (convierte
iones en electrones) son acelerados y enfocados hacia un segundo dinodo, el cual también emite
electrones secundarios (multiplicación de electrones). De este modo, la amplificación es llevada a cabo
a través de un “efecto cascada” de electrones secundarios de dinodo a dinodo, ya que el número de
electrones que llegan a un dinodo es menor al que sale del mismo (Figura 7-2). Cada etapa es un
dinodo de cobre-berilio conectado a un potencial sucesivamente mayor por un divisor de voltaje.
Pueden llegar a tener de 10 a 20 etapas amplificando la señal en un orden de hasta 10
7
. Es un detector
mucho más sensible que el de copa de Faraday, con una señal mínima detectable del orden de 10
-18
A.
Requiere alta tensión y un mayor vacío para operar, del orden de 10
-6
[torr] o mejor. Es un detector de
vida limitada, pues se va desgastando con el uso, por lo que su ganancia va cambiando con el tiempo y
requiere calibración frecuente. Es muy sensible a subidas de presión, pudiendo destruirse prácticamente
si se produce una ruptura o accidente de vacío. La velocidad de respuesta del multiplicador de
electrones, típicamente inferior a 50 ns, es mucho más rápida que la del detector Faraday, lo que
permite mayores velocidades de barrido en el espectrómetro de masas.
Figura 7-2: Multiplicador de electrones de dinodo discreto (discrete-dynodo).
Esta clase de detector lleva asociado sistemas electrónicos y mecánicos simples, aunque pueden
no ser tan sensibles (al no tener amplificación de señal) y un tiempo de respuesta lento debido a alta
impedancia en el amplificador. Es decir que si el amplificador de salida no es lo suficientemente bueno
puede echar por tierra todas las ventajas que este tipo de detectores presenta.
7.3.Detector "Channeltron"
Este detector es uno de los más utilizados hoy en día en espectrometría de masas para uso
general. Es similar al multiplicador de electrones clásico, con la principal diferencia de que no tiene
múltiples dinodos discretos, sino que está formado por un tubo de vidrio en forma de corneta, a veces
terminado en forma de espiral o caracol (figura 7-3), cuyo interior está recubierto por un óxido de plomo
semiconductor de composición y características especiales. Si se desea detectar iones positivos, se
aplica un potencial negativo en la boca del detector para que los iones procedentes del espectrómetro
de masas, desviados de su trayectoria por una placa repulsora con potencial positivo sean atraídos a su
interior y choquen con la cara interna, produciendo la emisión de un cierto número de electrones. El
final del tubo del detector se sitúa a un potencial cercano a tierra, con lo que existirá un gradiente
continuo de potencial desde la boca al fondo del detector. Debido a esto, los electrones arrancados en el
impacto inicial del ion volarán en la dirección de los potenciales menos negativos, hacia potencial cero,
produciéndose una gran cantidad de impactos en el camino, en cada uno de los cuales se multiplicará el
número de electrones, con lo que se puede conseguir un efecto multiplicador del orden de 10
8
. A1 final
del recorrido del tubo multiplicador se encuentran un cono colector con la electrónica de
preamplificación y amplificación asociada. Si se desean detectar iones negativos, en principio basta con
cambiar el signo de los potenciales aplicados a la placa repulsora y a la boca del channeltron. Por tanto,
este detector es susceptible de ser empleado tanto para detectar iones positivos como negativos. El
hecho de situar el detector fuera del "eje óptico" del espectrómetro, produce una ventaja importante,
además de permitir la detección selectiva de iones positivos o negativos, como es la de evitar que
alcancen el detector partículas o radiaciones no deseadas, tales como fragmentos neutros o fotones
procedentes del filamento de la fuente, que podrían incrementar el ruido de fondo y originar señales
parásitas. Otra ventaja de los "Channeltron" es que pueden exponerse a presión atmosférica sin ningún
problema, siempre que el alto voltaje haya sido desconectado, lo que permite romper vacío en el
sistema sin complicaciones. Requieren un vacío mínimo de trabajo del orden de 5 x 10
-5
[torr], lo que no
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 28
debe ser problema en espectroscopia de masas donde es habitual trabajar con vacíos mejores que 10
-6
[torr] en el analizador. La vida de un detector "Channeltron", aunque superior a la de los multiplicadores
de dinodos discretos, es también limitada y depende de la carga total acumulada, es decir, del voltaje
aplicado y del número de iones detectados. A medida que la superficie interior se va agotando, se va
haciendo necesario incrementar el alto voltaje aplicado para conseguir una señal adecuada. Cuando
este fenómeno se acelera, es síntoma evidente de que el final de la vida útil del detector se acerca.
Figura 7-3: Channeltron.
7.4.Detector de conversión fotónica (Detector "Daly" o de
centelleo)
Primero veremos una breve descripción de los elementos particulares que esta clase de
detectores utiliza.
7.4.1.Detectores de centelleo y termoluminiscencia
Los detectores de centelleo y de termoluminiscencia (tld) son dos tipos de detectores que, si bien
tienen un modo de funcionamiento y unas aplicaciones diferentes, poseen un principio básico de
detección semejante. Existen unas sustancias cristalinas denominadas luminiscentes, a las que la
radiación ionizante provoca unos defectos reversibles en la red cristalina. Se provoca por tanto un
estado de mayor energía y, al volver espontáneamente a la configuración de equilibrio, se emiten
fotones en el rango de la luz visible. En las sustancias utilizadas en detectores de centelleo, por ejemplo
sulfuro de cinc dopado con plata —ZnS(Ag)— o yoduro de sodio dopado con talio —NaI(Tl)— la vuelta al
equilibrio de la red cristalina es casi instantánea, lo que los hace útiles para detección y medida de la
radiación. En las sustancias utilizadas en los dosímetros de termoluminiscencia, como el fluoruro de litio,
la vuelta al equilibrio es un proceso extremadamente lento a temperatura ambiente, lo que hace que a
efectos prácticos la red no presente efectos de reparación en períodos del orden del mes. Sin embargo,
frente a un calentamiento del material hasta temperaturas de 300◦C, el material vuelve rápidamente al
equilibrio, emitiendo súbitamente todos los fotones correspondientes al cambio de la estructura
cristalina. Esta propiedad lo hace muy útil como dosímetro, i.e., como sistema capaz de medir la dosis
acumulada durante un período de tiempo y revelarla en un único proceso de lectura que, además,
produce la recuperación del material para un nuevo uso. Durante el proceso de medida se produce una
cantidad reducida de fotones, ya sea durante el proceso de irradiación en los detectores de centelleo o
en el calentamiento para el caso de tld. Es pues necesario recogerlos en un sistema amplificador
denominado fotomultiplicador. La recogida debe realizar en un ambiente de oscuridad total para no
enmascarar las medidas. En el fotomultiplicador los fotones son convertidos a una señal eléctrica
mediante un fotocátodo, material metálico compuesto usualmente por aleaciones de cesio-plata o
semiconductores, con un potencial de ionización muy bajo, de modo que los fotones sean capaces de
arrancar electrones de la red cristalina. Los electrones provenientes del fotocátodo son acelerados en
etapas sucesivas contra electrodos intermedios llamados dinodos, buscando un efecto multiplicativo
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 29
al arrancar más electrones de éstos. En el último electrodo, el ánodo, se recoge una carga eléctrica
proporcional a la inicialmente generada en el fotocátodo, pero amplificada por un factor del orden del
millón.
7.4.2.Descripción de los detectores Daly
Este detector es uno de los más eficientes, sensibles y de más larga vida disponibles para
detección puntual. Los iones procedentes del tubo de vuelo del espectrómetro de masas son desviados
de su trayectoria mediante un potencial eléctrico. El voltaje aplicado es de signo contrario a la carga de
los iones que se quieran detectar, para provocar su atracción y choque sobre el dinodo inicial. Este
choque produce múltiples electrones que son atraídos, a su vez, por un voltaje más positivo que el del
dinodo, y aplicado sobre una pantalla fosforescente.
Figura 7-4: Esquema del detector Daly.
A1 recibir el impacto de los electrones, la pantalla de centelleo emite un gran número de fotones,
los cuales se dirigen a un fotomultiplicador convencional sellado a vacío, produciéndose la consiguiente
cascada de electrones que multiplica la señal. La señal es detectada al final de su recorrido por el
interior del tubo fotomultiplicador, siendo posteriormente de nuevo amplificada, digitalizada y elaborada
mediante circuitos electrónicos, para su manipulación por el sistema de tratamiento de datos del
espectrómetro de masas. Una ventaja de este detector sobre los clásicos "Channeltron", aparte de su
mayor sensibilidad y estabilidad, es su extraordinaria duración, ya que el elemento que envejece
principalmente es el fotomultiplicador, que sufre en todo caso menos deterioro, pues recibe el impacto
de fotones y electrones que causan menor daño que el impacto directo de los iones. Además, la
sustitución del multiplicador no es nada costosa, ya que se trata de un componente normal, disponible
en el mercado a bajo precio.
7.5.Detectores multicanal o microcanal
Existen varios tipos de detectores que pueden incluirse en esta denominación de multicanales.
Se basan en un arreglo de capilares de vidrio huecos (de 10-25mm de diámetro), recubiertos
internamente de un material semiconductor, emisor de electrones, formando microcanales.
Manteniendo estos microcanales a un alto voltaje se obtiene la expulsión de electrones al golpear el
material con iones, esto causa una avalancha, creando electrones secundarios con una ganancia de
entre 10
3
-10
4
(Figura 7-5). Cada microcanal actúa como multiplicador de electrones independiente y el
conjunto se conecta eléctricamente en paralelo. Estos detectores son útiles en señales de baja
intensidad. Luego de una o dos capas de baterías de micromultiplicadores, se coloca un sistema de
detección mas o menos sofisticado y eficiente, encargado de detectar simultáneamente todas las
señales. Este tipo de detectores reúnen la ventaja de los antiguos sistemas de fotoplacas, de ser
capaces de detectar simultáneamente una amplia zona espectral, lo que aumenta enormemente el
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 30
tiempo de observación de cada ion. Ello conduce a una sensibilidad aumentada en muchos órdenes de
magnitud. Los detectores de placas de microcanales pueden detectar tanto señales pequeñas como
grandes con mínimos niveles de saturación y su tiempo de respuesta para la generación de voltajes de
salida es muy corto en comparación con otros tipos de detectores. Existen distintas denominaciones de
este tipo de detectores tales como: Multiple Channel Detector, Multiplier Array Detector, Microchannel
Multipliers, Multichannel Photo Diode Array, ect.
Figura 7-5: Principio de funcionamiento del detector de microcanales.
Los microcanales pueden también emitir electrones a través de pantallas fosforescentes. Un
detector de arreglo de fotodiodo es usado para convertir los fotones liberados en señales eléctricas.
(Véase la figura 7-6).
Figura 7-6: Detector de arreglo de fotodiodo.
7.6.Sintonía y calibración de los espectrómetros de masas
Con el fin de disponer de picos de masas conocidas se utilizan sustancias de referencia, de
espectro bastante complejo pero muy bien conocido, para realizar la calibración de la escala de masas
del espectrómetro. Lo que se hace es ajustar las distintas lentes y rendijas de la fuente para conseguir
los valores óptimos de los iones fragmento del compuesto de referencia de los cuales se conoce su
masa exacta así como las abundancias relativas de cada uno. A este proceso se le denomina “TUNE”
(sintonía). Las sustancias de referencia más utilizadas son heptacosa (perfluorterbutilamina) para la
calibración de las masas en equipos de baja resolución y el PFK (perfluorkeroseno) para los de alta.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 31
8.Espectros moleculares
Los espectros de masas obtenidos por ionización API o MALDI-TOF son totalmente diferentes a los
conseguidos por otras técnicas de ionización, y consiste en una serie de señales discretas a lo largo de
todo el dominio espectral, que corresponden, cada una de ellas, a una molécula intacta cargada con
diferente número de cargas, y con un cierto número de protones añadidos. A modo de ejemplo en la
figura 8-1, se muestra el espectro de masas del poliestireno.
Figura 8-1: Espectro de masas del poliestireno 7,600 obtenido por MALDI-TOF.
Los siguientes son otros espectros de masas de diferentes materiales, también obtenidos por
espectrometría MALDI o MALDI-TOF:
Figura 8-2: Espectro de un peptido usando ionización positiva MALDI y ácido alpha-cyano-4-hydroxycinnamic como matríz.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 32
Figura 8-3: Espectro de MALDI-TOF de los oligosacáridos liberados por hidrólisis parcial de un polisacárido del liquen L.
pustulata[10]. Recordemos que el eje vertical es abundancia relativa y el horizontal es valor de la relación m/z.
Figura 8-4: Espectro MALDI-TOF del poliestireno.
Figura 8-5: Espectro MALDI-TOF del Poly(Propylene Glycol).
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 33
9.Introducción a la Espectroscopía Infrarroja
9.1.La Espectroscopía
La espectroscopia es una rama de la Ciencia Físico-Química que se ocupa del estudio de los
"espectros" para conocer la forma de obtenerlos, la forma de medirlos y la aplicación al análisis químico.
El espectro se define como una representación gráfica o fotográfica de la distribución de intensidades
de la radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia, en función de la longitud de onda
de dicha radiación. Los espectros son debidos a transiciones entre estados de energía característicos de
la materia. Los espectros pueden ser de emisión, que se obtienen excitando adecuadamente la materia
para que emita radiación electromagnética y de absorción, obtenidos sometiendo a la materia a una
radiación electromagnética continua y representando la proporción de radiación absorbida por la misma
en función de la frecuencia o longitud de onda.
9.2.Espectrometría infrarroja
La principal utilización de la espectrometría infrarroja ha sido la identificación de compuestos
orgánicos, ya que los espectros correspondientes suelen ser complejos y contienen numerosos máximos
y mínimos que pueden servir para realizar comparaciones. Con excepción de los isómeros ópticos, no
existen teóricamente dos compuestos que absorban exactamente en la misma forma. Igualmente, la
espectroscopía infrarroja se emplea cada vez más en el análisis cuantitativo. En este caso, su enorme
ventaja reside en la gran selectividad, lo que posibilita a veces cuantificar una sustancia en una mezcla
compleja sin realizar mucho trabajo previo de separación. Para absorber radiación infrarroja, una
molécula debe experimentar un cambio neto en el momento dipolar como consecuencia de su
movimiento vibratorio y rotatorio. Sólo en estas circunstancias puede interaccionar con la molécula el
campo eléctrico alternante de la radiación y causar cambios en su movimiento. Si la frecuencia de la
radiación iguala a la frecuencia de una vibración natural de la molécula, ocurre una transferencia neta
de energía que da por resultado un cambio en la amplitud de la vibración molecular; la consecuencia es
la absorción de la radiación. Análogamente, la rotación de moléculas asimétricas alrededor de sus
centros de masa produce una fluctuación dipolar periódica; nuevamente, es posible la interacción con la
radiación. La energía requerida para causar un cambio en el nivel rotatorio es muy pequeña. Los niveles
de energía vibratoria están igualmente cuantizadas y las diferencias de energía entre estados cuánticos
corresponden a las regiones fácilmente accesibles del infrarrojo de 13000 a 675 cm-1.
Figura 9-1: Zonas espectrales. Origen de la radiación electromagnética. Técnicas instrumentales
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 34
El espectro infrarrojo de un gas consiste por lo general en una serie de líneas muy próximas entre
sí debido a que existen varios estados energéticos rotatorios para cada estado vibratorio. Por otra parte
en el estado líquido y sólido la rotación esta muy restringida, y desaparecen las líneas rotacionales
discretas, dejando sólo picos vibracionales algo ensanchados. Una molécula puede ser modelada como
un sistema de osciladores acoplados, descritos aproximadamente por un movimiento armónico
cuántico, en consecuencia por compleja que sea una molécula‚ su modelo vibracional es una
combinación de sus modos normales de vibración. En la figura 9-1 se muestran las regiones del
espectro que se emplean con fines analíticos, los nombres de las técnicas espectroscópicas y las
transiciones moleculares o atómicas a las que se debe la absorción o emisión de radiación en cada
región.
9.3.Sobre las vibraciones moleculares
En moléculas sencillas es posible definir el tipo de vibraciones que tienen lugar entre los distintos
átomos enlazados e identificar la radiación electromagnética que es absorbida para modificar su estado
vibracional. En moléculas complejas esta posibilidad es más difícil tanto por el elevado número de
vibraciones como por las interacciones entre los distintos centros vibracionales que se producen. Hay
dos clases de vibraciones básicas o fundamentales, de tensión o alargamiento y de deformación o
flexión, (figura 9-2). Las vibraciones de tensión producen un cambio continuo de la distancia entre los
átomos sin abandonar el eje de enlace. Las vibraciones de deformación o flexión se caracterizan por un
cambio en el ángulo de dos enlaces y se clasifican en cuatro tipos, de tijera, de oscilación en el plano o
balanceo, de sacudida fuera del plano o cabeceo y de torsión fuera del plano o trenzado. En la
moléculas de más de tres átomos, además de las vibraciones descritas, puede producirse interacciones
o acoplamientos que dan lugar a cambios en las características de las vibraciones.
Figura 9-2: Tipos de vibraciones moleculares. + indica movimiento desde el plano de la página hacia el lector;
- indica movimiento desde el plano de la página alejándose del lector.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 35
9.4.Modelos vibracionales
Las características de una vibración atómica de tensión en una molécula biatómica son, en principio,
similares a un modelo mecánico consistente en dos masas unidas por un muelle, (oscilador armónico).
Para iniciar el desarrollo se considera la vibración de una masa unida a un resorte que cuelga de un
objeto inmóvil, la energía potencial para un desplazamiento de la masa sobre su posición de equilibrio
es, La curva de energía potencial para una oscilación armónica simple, obtenida a partir de la ecuación
anterior, es una parábola, figura 9-3. En la posición de equilibrio, d=0, la energía potencial es nula y
alcanza el valor máximo cuando el resorte está extendido o comprimido a máxima amplitud.
E
potencial
=
(
1
2
)
k d
2
Donde :
k :cte de fuerza
d : distancia recorrida por la masa
Figura 9-3: Curva de energía potencial en un oscilador armónico.
La frecuencia de esta vibración, en ciclos por segundo, tiene la expresión,
v =
1
2¬ .
k
m
Donde :
k :cte de fuerza
m: masa del objeto
Esta expresión de la frecuencia de vibración se puede aplicar a un oscilador armónico, formado por dos
bolas de masas m1, m2; y a dos átomos unidos por un enlace y en movimiento vibratorio,
v =
1

.
k
m
1
m
2
m
1
+m
2
Donde :
m
1
y m
2
: masa delas bolas o delos átomos
µ: masareducida=(m
1
m
2
/ m
1
+m
2
)
k :constante de fuerza del muelle odel enlace químico
Sin embargo, el movimiento vibratorio de dos átomos unidos por un enlace químico difiere del sistema
de dos masas unidas por un muelle, debido a que la energía vibracional de los átomos en una molécula
está cuantificada, figura 9-4, y solamente son permitidos ciertos niveles energéticos, según la siguiente
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 36
expresión,
v =
(
1
2
+V
)
hv =
(
1
2
+V
)
h
2¬ .
k
µ
Donde :
V : es el nº cuánticovibracional , toma valores de( 0,1, 2, 3, etc)
h: es la cte. Planck ,(h=6,625210
-27
erg seg)
v : frecuencia devibración de enlace
µ: masareducida
La transición entre dos niveles energéticos vibracionales consecutivos corresponde a un ∆Evib,
A E
vid
=
h
2¬ .
k
µ
La absorción de radiación con energía igual a esta diferencia da lugar a la transición vibracional que
queda reflejada en el espectro. Las radiaciones electromagnéticas con esta energía se encuentra en la
región infrarroja del espectro electromagnético. La cuantificación de la energía vibracional en un
sistema molecular, no es la única diferencia existente entre 2 átomos unidos por un enlace (vibraciones
moleculares) y un oscilador armónico definido por dos masas unidas por un muelle (mecánica clásica).
Cuando 2 átomos se acercan entre sí, en el movimiento vibratorio, se produce una repulsión entre los
dos núcleos con una fuerza que actúa en la misma dirección que la fuerza restauradora del enlace. Este
efecto hace que en el extremo en el que los átomos se acercan, la energía potencial se eleve
rápidamente; mientras que en el extremo, en el que los átomos se alejan al máximo, se produce una
disminución de la fuerza restauradora y por tanto de la energía potencial, figura 9-4. Las curvas de
energía potencial correspondientes a un oscilador armónico (dos masas unidas por un muelle) y un
oscilador no armónico (vibraciones moleculares) son muy parecidas, sobre todo a energías potenciales
bajas.
Figura 9-4: Curvas de energía potencial en un oscilador armónico (1) y oscilador no armónico (2).
La transición desde el nivel v=0 al primer estado excitado v=1 absorbe intensamente la radiación
electromagnética exterior dando lugar a bandas espectrales fundamentales. La absorción de luz entre
niveles separados por dos o más unidades, ∆v=±2 ó ±3, origina bandas débiles, conocidas como
sobretonos, a frecuencias dos o tres veces mayores que la frecuencia de la vibración fundamental.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 37
10.El espetrómetro infrarrojo
10.1.Funcionamiento y descripción
Con el fin de hacer medidas en una muestra, se transmite un rayo monocromo de luz infrarroja a
través de la muestra, y se registra la cantidad de energía absorbida. Repetiendo esta operación en un
rango de longitudes de onda de interés (por lo general, 4000-400 cm
-1
) se puede construir un gráfico. Al
examinar el gráfico de una sustancia, un usuario experimentado puede obtener información sobre la
misma. Esta técnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes, y se usa mucho en química,
en especial en química orgánica. Se pueden generar gráficos bien resueltos con muestras de una sola
sustancia de gran pureza. Sin embargo, la técnica se utiliza habitualmente para la identificación de
mezclas complejas. La zona de radiación infrarroja del espectro electromagnético está limitada por las
regiones del espectro visible y del microondas. Como se muestra en la tabla 9.1, se distinguen tres
zonas, siendo la del infrarrojo medio la que hasta el momento actual tiene mayor aplicación analítica.
DENOMINACION INTERVALO ν (cm
-1
) INTERVALO λ (µm)
INFRARROJO PROXIMO 12500-4000 0,8-2,5
INFRARROJO MEDIO 4000-660 2,5-15,15
INFRARROJO LEJANO 660-50 15,15-200
Tabla 10-1: Zonas espectrales infrarrojas.
Dos son los tipos de espectrofotómetros más utilizados, dispersivos de red, y con transformada de
Fourier. Como se verá a continuación, existen claras diferencias entre los dos equipos; los
espectrofotómetros con transformada de Fourier es un equipo más moderno que el espectrofotómetro
dispersivo y presenta una serie de ventajas como las que se citan seguidamente:

● Los espectros se obtienen con gran rapidez, porque se miden simultáneamente la energía
absorbida por la molécula a todas las longitudes de onda, en la zona espectral del infrarrojo
medio.
● Esta rapidez permite hacer múltiples barridos espectrales para una misma muestra y calcular,
posteriormente, la media de todos ellos; con lo que se mejora la relación (señal/ruido).
● La identificación de la longitud de onda que incide sobre la muestra es mucho más exacta,
porque se utiliza un láser para el calibrado de la misma.
● El equipo tiene menos elementos a través de los cuales pasa la radiación electromagnética, por
lo que la pérdida de intensidad de la radiación en su recorrido hacia la muestra es menor. Esto
permite poder detectar absorciones de energía más débiles.
Espectrofotómetros dispersivo: La figura 10-1 muestra un esquema de un espectrofotómetro
convencional de doble haz, cuyo funcionamiento se indica a continuación:
● La radiación procedente de la fuente se divide en dos haces; uno se dirige a la célula muestra, y
el otro a la célula referencia (vacía o con disolvente).
● El haz de referencia pasa por un atenuador y se dirige al divisor periódico.
● El divisor periódico es un disco impulsado por un motor que deja pasar alternativamente el haz
de muestra y el de referencia.
● Se produce la dispersión de la radiación por el prisma (monocromador).
● Los haces llegan alternativamente al detector y dan lugar a una señal eléctrica.
● La señal se amplifica y pasa al rectificador sincrónico, aparato que está acoplado mecánica o
eléctricamente al divisor periódico de forma que el interruptor del rectificador y el haz que
abandona el divisor periódico cambien simultáneamente.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 38
● Si los dos haces son idénticos en potencia, la señal del rectificador es una corriente continua; si
los haces difieren en potencia se produce una corriente fluctuante o alterna cuya polaridad viene
dada por el haz que sea más intenso.
● La señal del rectificador es filtrada, modulada y amplificada para impulsar el motor sincrónico en
una dirección u otra según la polaridad de la señal. El motor sincrónico está conectado al
atenuador y a la pluma del registro, y hace que ambos se muevan hasta alcanzar la anulación.
● El atenuador del haz es el mecanismo por el cual la potencia del haz de referencia se reduce
para igualarse a la del haz que pasa por la muestra. El mecanismo consiste en un peine de
dientes finos que se estrecha hacia las puntas. Este peine se opone a la radiación eliminando una
fracción del haz de la misma. El peine se pone en movimiento cuando el detector percibe una
diferencia de potencial entre la muestra y referencia.
● Otro motor sincrónico impulsa el papel y varía la longitud de onda.
Figura 10-1: Diagrama de un espectrofotómetro dispersivo de doble haz. Línea oscura gruesa indica enlace mecánico; línea
delgada enlace eléctrico; línea de trazos trayectoria de la radiación.
Espectrofotómetro con transformada de Fourier: En la figura 10-2 se muestra un esquema óptico
de un espectrofotómetro basado en la transformada de Fourier. En él se observa que el rayo infrarrojo es
generado en la fuente A y, posteriormente, colimado y dirigido hacia el interferómetro C por medio de
un espejo fijo toroidal B.
● El rayo del láser de Helio-Neón sigue a la radiación infrarroja a través del interferómetro con
objeto de determinar el desplazamiento del espejo móvil y para conocer la longitud de onda a la
que se produce la absorción de radiación.
● A la izquierda del compartimento de la muestra se encuentra un espejo toroidal ajustable D que
conduce el rayo procedente del interferómetro a la muestra. Desde el compartimento de la
muestra el rayo llega, a través de una rendija, a un detector térmicamente estable de tantalato
de litio.
El interferómetro, que sustituye al tradicional monocromador, es la parte esencial de este
aparato, pues es el encargado de modular cada frecuencia del infrarrojo con el fin de realizar la
transformada de Fourier.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 39
Figura 10-2: Diagrama de un espectrofotómetro por transformada de Fourier.
El esquema de un interferómetro se muestra en la figura 10-3 y consta de un divisor de haz B
que refleja la radiación infrarroja hacia un espejo fijo C y hacia otro móvil D. Los dos haces reflejados se
recombinan de nuevo en el divisor de haz, interfiriendo constructiva o destructivamente según cual sea
el valor de la diferencia de camino óptico entre el divisor y cada uno de los espejos. Por ejemplo, para
un desfase δ=0, λ, 2λ,... los dos rayos interfieren constructivamente y si δ=λ/2, 3λ/2, 5λ/2,...
destructivamente; así, si se va cambiando el valor del desfase suavemente desde cero; se detecta una
señal de intensidad modulada como una función cosenoidal. La señal de salida del interferómetro se
denomina interferograma que es la suma de todas las ondas cosenoidales moduladas.
Figura 10-3: Esquema del interferómetro.
Los componentes básicos de que consta un espectrofotómetro de IR, que permite medir la
absorción de radiación infrarroja por parte de las moléculas, son la fuente de radiación, el sistema óptico
de dispersión (monocromador), el sistema de detección, el registrador del espectro y las cubetas
portamuestras. En las subsecciones siguientes se hace una breve descripción de estos elementos
concluyendo con el funcionamiento del espectrofotómetro.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 40
10.2.Fuente de radiación
La fuente de radiación es un sólido inerte calentado eléctricamente a temperatura comprendida
entre 1.500 y 2.000 K. Se produce una radiación continua que se aproxima a la de un cuerpo negro. El
cuerpo ideal capaz de emitir el máximo de intensidad de radiación para una temperatura y longitud de
onda determinada, recibe el nombre de cuerpo negro; se destacan las siguientes:
● Emisor incandescente de Nernst, es un cilindro de un diámetro 1 a 2 mm y 20 mm de longitud,
construido de óxido de zirconio y pequeñas cantidades de óxidos de ytrio y torio. En los extremos
del cilindro se alojan las resistencias de platino para el paso de la corriente eléctrica; lo que
permite alcanzar temperaturas de 2.200 K, y una emisión de un 60 % con respecto al cuerpo
negro. La máxima intensidad de radiación se produce entre 1 y 10 µm (10.000-1.000 cm
-1)
.
● Fuente Globar, es una barra de carburo de silicio de 5 cm de longitud y 0,5 cm de diámetro. Se
calienta eléctricamente hasta temperaturas de 1.500 K. Tiene una radiación estable entre 1 y 40
µm (10.000-250 cm
-1
) con una emisión del 75% respecto al cuerpo negro. Es semejante al emisor
de Nerst excepto en la región inferior a 2.000 cm
-1
donde el Globar tiene mejor rendimiento.
● Fuente de filamento incandescente, es una espiral de alambre de níquel-cromo calentado por el
paso de la corriente eléctrica hasta una temperatura de 1.900 K. Produce menor intensidad que
los anteriores pero tiene una vida más larga.
● El láser sintonizable de dióxido de carbono es una fuente infrarroja para monitorear algunos
contaminantes atmosféricos y para determinar las especies de absorción en soluciones acuosas.
10.3.Sistema óptico de dispersión

Tiene por objeto seleccionar haces estrechos de radiación de pequeños intervalos de frecuencias
y hacerlos incidir sobre el detector una vez que han pasado por la muestra. Como agentes dispersantes
de la radiación se emplean prismas y redes de difracción. Los primeros han de ser construidos de un
material transparente a la radiación infrarroja, considerándose desechable cuando la absorción es
superior al 50 %. Los materiales más usados son el cuarzo fundido, solo aplicable a radiaciones del IR
cercano, el cloruro sódico cristalizado cuando la radiación corresponde al IR normal (2.000-660 cm
-1
)
ampliable hasta 4.000 cm
-1
; el bromuro potásico y el bromuro de cesio se emplean en el IR lejano. Las
sales metálicas, de las cuales se construyen estos materiales, son higroscópicas por lo que es necesario
mantener una atmósfera ausente de humedad. Las redes de difracción, como sistema óptico
dispersante de la radiación, pueden ser construidas de material estable como vidrio o plástico,
recubierto de aluminio. Ofrecen un mayor poder de resolución.
10.4.Sistemas de detección
Las radiaciones infrarrojas no se pueden medir con detectores eléctricos, similares a los
utilizados para detectar radiaciones UV-Vis., debido a la insuficiente energía del fotón correspondiente.
En los espectrofotómetros de dispersión los detectores son térmicos y térmicos piroeléctricos; en
espectrofotómetros con transformada de Fourier los detectores pueden ser piroeléctricos o
fotoconductores. En los detectores térmicos, la respuesta se produce por el efecto de calentamiento que
sufre un cuerpo negro al incidir sobre él la radiación IR. El elemento sensible del detector ha de ser lo
más reducido posible y tener una capacidad calorífica pequeña con el fin de que la diferencia de
temperatura que se produzca sea lo mayor posible (del orden de 10-6 C). Asimismo, han de estar
aislados de la radiación térmica que puedan emitir otros objetos próximos, dentro del equipo. A
continuación se describen algunos detectores cuyo uso esta restringido a espectrofotómetros clásicos o
dispersivos.
● Bolómetro, es un tipo de termómetro de resistencia construido de platino o níquel, denominado
también, termistor. Estos materiales presentan cambios relativamente grandes en la resistencia
al paso de la corriente eléctrica en función de la temperatura. Consiste en una cinta de platino o
níquel, como elemento sensible, pintado de negro y montado sobre un puente de Wheatstone
por el que pasa la corriente eléctrica; al incidir la radiación cambia la resistencia y varía la
diferencia de potencial; el puente se desequilibra y la corriente que pasa por el galvanómetro es
proporcional a la intensidad de la radiación.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 41
● Detector de Golay, es un termómetro de gas que contiene xenón en una pequeña cámara
cilíndrica con una membrana negra. En un extremo del cilindro hay una ventana transparente al
infrarrojo y en el otro un diafragma flexible que está plateado por la parte exterior. En la
superficie plateada se refleja un haz de luz hacia el cátodo de un fototubo. Al incidir la radiación
de infrarrojos la membrana negra, que hay en el interior del cilindro, se calienta y calienta al
xenón; el resultado es un aumento de presión en el cilindro que hace variar la posición del
diafragma plateado. Esto modifica la fracción de radiación que incide en el cátodo del fototubo y
la detección del mismo.
● Termopares, consisten en uniones termoeléctricas de dos piezas metálicas diferentes (platino-
paladio, antimonio-bismuto, etc.). Entre las dos uniones se produce un potencial que varía con la
diferencia de temperatura, entre dichas uniones, al encontrarse dentro de un circuito eléctrico.
Una de las uniones (soldadura fría) se apantalla cuidadosamente y se mantiene a temperatura
constante, exponiéndose la soldadura caliente a la radiación infrarroja con lo que aumenta su
temperatura. La diferencia de potencial entre los extremos depende de la diferencia de
temperatura entre las soldaduras y por tanto de la cantidad de radiación IR que incide sobre la
soldadura caliente. El termopar es capaz de responder a diferencias de temperatura de 10-6 C.
● Detectores piroeléctricos, se construyen con láminas cristalinas de materiales piroeléctricos,
como sulfato de triglicina. Situado el cristal piroeléctrico entre dos electrodos se produce una
capacitancia que es sensible a la temperatura. Por tanto, al incidir la radiación infrarroja el cristal
polielétrico se calienta y se modifica la distribución de cargas a través del cristal, que provoca
una corriente en un circuito eléctrico externo. La intensidad de la corriente depende, entre otras
cosas, de la velocidad de cambio de polarización con la temperatura. Una característica de este
detector es que tiene respuestas muy rápidas; lo que permite medir las señales procedentes de
un interferómetro instalados en equipos con transformada de Fourier.
● Detectores fotoconductores, son detectores de telururo de cadmio y mercurio y tienen una
respuesta más rápida que los detectores polieléctricos; por lo que tienen una amplia aplicación
en espectrofotómetros con trasformada de Fourier. Consisten en una delgada película de un
material semiconductor colocada sobre una superficie de vidrio y sellada en una cámara al vacío.
La absorción de radiación infrarroja hace que electrones de valencia no conductores pasen a ser
conductores, disminuyendo la resistencia eléctrica del semiconductor. Se colocan en serie un
fotoconductor, una fuente de voltaje y una resistencia; el descenso de voltaje en la resistencia
está relacionada con la intensidad de la radiación electromagnética.
10.5.Preparación de las muestras. Cubetas portamuestras
En espectroscopia infrarroja no existen buenos disolventes que sean transparentes a todas las
radiaciones espectrales, lo que entraña una dificultad para determinar con exactitud la absorbancia de
radiación por parte de las moléculas. Se pueden analizar compuestos en estado sólido, líquido y
gaseoso; el recipiente de la muestra será distinto según se presente la misma y ha de estar construido
de un material transparente a la radiación.
Figura 10-4 y 5: Recipientes de las muestras a analizar (cuvettes). Gases Izq. Líquidos Der.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 42
● Muestras de Gas: El espectro de gas puede obtenerse al permitir que la muestra se expanda en
una celda, también llamada cuvette.
● Soluciones: Las celdas de solución infrarroja constan de dos ventanas selladas y separadas por
dos juntas delgadas de Teflón, cobre o plomo previamente humedecidas con mercurio. Las
ventanas comúnmente están hechas de cloruro de sodio, cloruro de potasio o bromuro de cesio.
Las muestras que son líquidas a temperatura ambiente son generalmente analizadas en forma
pura o en solución. Los solventes más comunes son tetracloruro de carbono (CCl4) y disulfuro de
carbono (CS2). Cloroformo, cloruro de metileno, acetonitrilo y acetona son solventes comunes
para materiales polares.
● Sólidos: Polvos o sólidos reducidos a partículas pequeñas pueden examinarse como una pasta
delgada o mullita. La mullita se forma triturando algunos miligramos de la muestra en presencia
de una o dos gotas de aceite de hidrocarburo. La mullita resultante se examina luego entre dos
placas de sal. Se coloca una ventana del mismo grosor en la trayectoria del haz. Otra técnica
para sólidos es triturar un miligramo o menos de la muestra con alrededor de 100 miligramos de
bromuro de potasio. La mezcla luego se presiona en una molde para crear un disco transparente.
Se coloca un disco de bromuro de potasio puro en el trayecto del haz correspondiente.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 43
11.Aplicaciones analíticas del espetrómetro infrarrojo
La espectroscopia infrarroja tiene aplicaciones en análisis cualitativo y cuantitativo. Su principal
utilización ha sido en la identificación de compuestos orgánicos, debido a que no existen, teóricamente,
dos compuestos que absorban exactamente en las mismas frecuencias.La espectroscopia de IR está
más centrada en el estudio de compuestos orgánicos. Si no se aplica a los compuestos inorgánicos se
debe a que la mayoría de las vibraciones de estos compuestos están por debajo de la frecuencia de
400 cm
-1
. A continuación se mostrarán diagramas obtenidos con espectrómetros infrarrojos.
Figura 11-1: Espectro infrarrojo de una muestra de pintura. Material identificado como “goma laca”.
Figura 11-2: Espectro del CO2.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 44
Figura 11-3: Espectro infrarrojo de compuesto químico
Figura 11-4: Espectro de ácido carboxílico.
Figura 11-5: Dominio de tiempo versus dominio de frecuencia: la transformada de Fourier (FT-IR).
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 45
12.Bibliografía y Agradecimientos
12.1.Bibliografía
1. An Introduction to Mass Spectrometry. Dr Alison E. Ashcroft, Mass Spectrometry Facility Manager,
Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Astbury Building, The University of Leeds.
2. http://es.wikipedia.org
3. MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS - CURSO DE MÉTODOS - ESPECTROMETRÍA DE MASAS de
GERMÁN PLASCENCIA VILLA. Instituto de Biotecnología – UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE
MÉXICO.
4. IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS VOLÁTILES POR CG-MS. M.C. Gutiérrez, M. Droguet.
5. CROMATOGRAFIA PRINCIPIOS Y APLICACIONES. Rafael Gómez - Ullate Ricón - Alonso Serrano Álvarez.
6. www.monografias.com - Síntesis de péptidos.
7. http://macromoleculas.unq.edu.ar/Unidades/Qu%EDmica_prote%EDnas_A_2U1.doc
8. Fundamentos de Ingeniería Nuclear. Miguel Moro Vallina.
9. http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/MassSpec/mspec.htm#ms2
10. http://www.cib.csic.es/es/index.php (Centro de investigaciones biológicas)
11. http://www.espectrometria.com/
12.2.Agradecimientos
Al Altísimo Dios, Creador del cielo y de la tierra, fuente de toda
razón y justicia, y mi inspiración. A mi profe de Fibra Ópticas para las
comunicaciones, Nestor H. Mata, por su gran paciencia y por su dirección
para la realización de este informe ... y por aprobarme. A Diego y Patri,
esos amigos y críticos, que en este y en mis otros informes han aportado
esa muy necesaria realimentación, tomando tiempo para leerlos y corregir
mis incontables errores; agradezco a Dios el haberlos puesto en mi camino
para ayudarme a ser cada día mejor. A todos muchas pero muchas
GRACIAS!!!
Dios les re bendiga!!!

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