FINAL Informe Fibras 2009-05-04

Espectrometra L.A.S.E.R. e Infrarroja.
1
Universidad Tecnolgica Nacional
Facultad Regional Baha Blanca
Departamento de Ing. Electrnica
Ctedra: Fibras pticas para comunicaciones
Ao 2009.
Espectrometra L.A.S.E.R. e Infrarroja
ALUMNO:
Galasso Christian L.
christian_galasso81@yahoo.com.ar
Resumen: Determinar la distribucin de tamao de micropartculas es un problema que est
adquiriendo cada vez una importancia mayor para la industria en general y la de procesos en particular,
ya que impacta directamente en las tecnologas de separacin de fase y en especial en las tecnologas
medioambientales. La espectroscopia es una rama de la Ciencia Fsico-Qumica que se ocupa del
estudio de los "espectros" para conocer la forma de obtenerlos, la forma de medirlos y la aplicacin al
anlisis qumico. En el presente informe se vern dos tcnicas utilizadas para la obtencin de los
espectros de los distintos materiales, ambas involucran el uso del lser; una de ellas es la
espectrometra de masas MALDI y la otra es la espectrometra infrarroja, tambin conocida como
espectroscopa infrarroja.
Espectrometra L.A.S.E.R. e Infrarroja. 2
ndice de contenido
1. Espectroscopia y Espectrometra, Que son?.................................5
1.1.Mtodos espectromtricos ...............................................5
1.1.1.Segn la naturaleza de la excitacin medida.........................5
1.1.2.Segn el proceso de medida..........................................6
2. Introduccin a la Espectrometra L.A.S.E.R.................................7
2.1.Que es la Espectrometra de Masas?.....................................7
2.2.Principios de la tcnica................................................7
2.3.Implementacin..........................................................8
2.4.Algunas definiciones....................................................9
3. Descripcin general del espectrmetro.....................................12
3.1.Sobre los procesos asociados a la espectrometra.......................12
4. Entrada de la muestra.....................................................14
4.1.Entrada por sonda directa..............................................14
4.2.Sistemas de entrada cromatogrficos[4,5]...............................15
4.2.1.Cromatografa de gases/Espectrometra de masas.....................15
4.2.2.Cromatografa HPLC/Espectrometra de masas.........................16
5. Fuente de ionizacin......................................................17
5.1.Descripcin de las mltiples fuentes de ionizacin.....................17
5.2.Introduccin Desorcin/Ionizacin Lser Asistida por Matriz(MALDI).....18
5.3.La matriz..............................................................19
5.4.El lser...............................................................20
5.5.MALDI a presin atmosfrica (AP-MALDI).................................21
6. Analizador de masa........................................................22
6.1.Introduccin a los analizadores de masas...............................22
6.2.Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight - TOF)...................22
6.2.1.Analizador TOF Lineal..............................................23
6.2.2.Analizador TOF Reflector...........................................24
6.2.3.Analizador TOF / TOF...............................................24
6.3.Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)..........24
7. Detector..................................................................26
7.1.Detector de copa de Faraday ...........................................26
7.2.Multiplicador de electrones secundarios................................27
7.3.Detector "Channeltron".................................................27
7.4.Detector de conversin fotnica (Detector "Daly" o de centelleo).......28
7.4.1.Detectores de centelleo y termoluminiscencia.......................28
7.4.2.Descripcin de los detectores Daly.................................29
7.5.Detectores multicanal o microcanal.....................................29
7.6.Sintona y calibracin de los espectrmetros de masas..................30
8. Espectros moleculares.....................................................31
9. Introduccin a la Espectroscopa Infrarroja...............................33
9.1.La Espectroscopa......................................................33
9.2.Espectrometra infrarroja..............................................33
9.3.Sobre las vibraciones moleculares......................................34
9.4.Modelos vibracionales..................................................35
10. El espetrmetro infrarrojo...............................................37
10.1.Funcionamiento y descripcin..........................................37
10.2.Fuente de radiacin...................................................40
10.3.Sistema ptico de dispersin..........................................40
10.4.Sistemas de deteccin.................................................40
10.5.Preparacin de las muestras. Cubetas portamuestras....................41
11. Aplicaciones analticas del espetrmetro infrarrojo......................43
12. Bibliografa y Agradecimientos...........................................45
12.1.Bibliografa..........................................................45
12.2.Agradecimientos.......................................................45
Acrnimos
RMN: Resonancia magntica nuclear.
Da: Daltons (unidad de masa).
UMA: Unidades de masa atmica.
MALDI: Desorcin/Ionizacin Lser Asistida por Matriz, del ingls: Matrix-
assisted laser desorption.
TOF: Analizador de tiempo de vuelo, del ingls: Time-of-flight
ppm: Partes por milln.
1.Espectroscopia y Espectrometra, Que son?
La espectroscopia surgi con el estudio de la interaccin entre la radiacin y la materia como
funcin de la longitud de onda (). En un principio se refera al uso de la luz visible dispersada segn su
longitud de onda, por ejemplo por un prisma. Ms tarde el concepto se ampli enormemente para
comprender cualquier medida en funcin de la longitud de onda o de la frecuencia. Una extensin
adicional del alcance de la definicin aadi la energa (E) como variable, al establecerse la relacin
E=h para los fotones. El anlisis espectral en el cual se basa, permite detectar la absorcin o emisin
de radiacin electromagntica a ciertas longitudes de onda, y relacionar stas con los niveles de energa
implicados en una transicin cuntica.
El espectro se define como una representacin grfica o fotogrfica de la distribucin de
intensidades de la radiacin electromagntica emitida o absorbida por la materia, en funcin de la
longitud de onda de dicha radiacin. Los espectros son debidos a transiciones entre estados de energa
caractersticos de la materia. Los espectros pueden ser de emisin, que se obtienen excitando
adecuadamente la materia para que emita radiacin electromagntica y de absorcin, obtenidos
sometiendo a la materia a una radiacin electromagntica continua y representando la proporcin de
radiacin absorbida por la misma en funcin de la frecuencia o longitud de onda.
La espectrometra es la tcnica espectroscpica para tasar la concentracin o la cantidad de
especies determinadas. En estos casos, el instrumento que realiza tales medidas es un espectrmetro o
espectrgrafo. La espectrometra a menudo se usa en fsica y qumica analtica para la identificacin de
sustancias mediante el espectro emitido o absorbido por las mismas. Tambin se usa mucho en
astronoma y deteccin remota. La mayora de los grandes telescopios tienen espectrmetros, que son
usados para medir la composicin qumica y propiedades fsicas de los objetos astronmicos, o para
medir sus velocidades a partir del efecto Doppler de sus lneas espectrales.
Figura 1-1: Dispersin de luz en un prisma triangular.
1.1.Mtodos espectromtricos
1.1.1.Segn la naturaleza de la excitacin medida
El tipo de espectrometra depende de la cantidad fsica medida que normalmente es una
intensidad de energa absorbida o producida. La naturaleza de la excitacin puede ser:
Electromagntica: Basada en interacciones de la materia con radiacin electromagntica como la
luz.
De electrones: Utiliza interacciones con haces de electrones. La espectroscopia Auger implica
inducir el efecto homnimo mediante la incidencia de un haz de electrones. En este caso la
medida considera la energa cintica del electrn como variable.
De masa: la interaccin de especies cargadas con campos magnticos y/o elctricos, dando lugar
a un espectro de masas. El trmino "espectroscopia de masas" no resulta representativo, ya que
la tcnica se emplea principalmente como una forma de medida de la energa cintica de la
partcula, aunque produzca realmente un espectro para la observacin y tenga a la masa (m)
como variable.
Acstica: La energa es provista por ondas de sonido.
Dielctrica: Mediante un campo elctrico externo se ponen en evidencia las propiedades
diectricas del material en funcin de la frecuencia.
Mecnica: Emplea la energa de un estrs mecnico externo, por ejemplo una torsin aplicada a
un trozo de material.
1.1.2.Segn el proceso de medida
La mayora de los mtodos espectroscpicos se diferencian en atmicos o moleculares segn si
se aplican a tomos o molculas. Junto con esta diferencia, se pueden distinguir los siguientes tipos de
espectrometra segn la naturaleza de su interaccin:
De absorcin. Usa el rango de los espectros electromagnticos en los cuales una sustancia
absorbe. Incluye la espectrometra de absorcin atmica y varias tcnicas moleculares, como la
espectrometra infrarroja y la resonancia magntica nuclear (RMN).
De emisin. Usa el rango de espectros electromagnticos en los cuales una sustancia irradia
(emite). La sustancia primero debe absorber la energa. Esta energa puede provenir de una
variedad de fuentes, que determina el nombre de la emisin subsiguiente, como la
luminescencia. Las tcnicas de luminescencia moleculares incluyen la espectrofluorimetra.
De dispersin. Mide la cantidad de luz que una sustancia dispersa en ciertas longitudes de onda,
ngulos de incidencia y ngulos de polarizacin. El proceso de dispersin es mucho ms rpido
que el proceso de absorcin/emisin. Una de las aplicaciones ms tiles es la espectroscopia
Raman.
2.Introduccin a la Espectrometra L.A.S.E.R.
2.1.Que es la Espectrometra de Masas?
La Espectrometra de Masas es una poderosa tcnica microanaltica usada para identificar
compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y
propiedades qumicas de molculas. La deteccin de compuestos puede ser llevada a cabo con
cantidades realmente pequeas (algunos pico-moles = 1*10
-12
moles) de muestra y provee informacin
caracterstica como el peso y algunas veces la estructura del analito. En todos los casos, alguna forma
de energa es transferida a las molculas a analizar para efectuar la ionizacin. En la tcnica clsica de
impacto electrnico (electrn ionization: EI), algunas de las molculas ionizadas del analito
explotan en una variedad de fragmentos ionizados. Tanto el patrn de fragmentacin resultante as
como los iones residuales determinan el espectro de masas. El espectro de masas de cada compuesto
es nico y puede ser usado como su huella qumica para caracterizar el analito. Para muestras
grandes, tales como biomolculas, las masas moleculares pueden ser medidas con una precisin de
0,01% del total de la masa molecular de la muestra. Por ejemplo: para una muestra de 40.000 [Da] o
unidades de masa atmica (UMA), tendramos un error de 4 [Da]. Esto es suficiente para permitir que el
menor cambio de masa, sea detectado; por ejemplo: la sustitucin de un aminocido por otro o una
modificacin post-traslacional. Para el caso de molculas orgnicas pequeas, la masa molecular puede
ser medida con una precisin de 5 [ppm] o menos; dicha precisin es a menudo suficiente para
confirmar la frmula molecular del compuesto, y tambin es un requisito estndar para la publicacin en
una revista de qumica a nivel cientfico. La informacin estructural puede obtenerse usando cierto tipo
de espectrmetros de masa, generalmente de aquellos con mltiples analizadores, los cuales son
conocidos como espectrmetros de masas en tndem. Esto se consigue mediante la fragmentacin de
la muestra en el interior del instrumento y el anlisis de los productos generados.
Figura 2-1: Esquema de la espectrometra de masas.
2.2.Principios de la tcnica
El proceso de anlisis por espectrometra de masas comienza llevando el compuesto a analizar a
fase gaseosa. La muestra debe tener una presin de vapor de 10
-4
a 10
-5
[torr], debido a que las
molculas deben migrar por difusin desde el sistema de entrada hacia la cmara de ionizacin. Las
muestras pueden ser introducidas al espectrmetro de masas usando una sonda directa o por entrada
en lote (batch) para slidos puros o lquidos voltiles. Ya que las molculas neutras difunden en
forma aleatoria por la fuente de ionizacin, solo una porcin es ionizada. El proceso de ionizacin
ms comn en anlisis en fase gaseosa es el de ionizacin electrnica (EI). En este se transfiere energa
a la molcula neutra en estado de vapor, para lograr la expulsin de uno de sus electrones y de ese
modo tener un ion con carga positiva y un electrn libre. La molcula ionizada puede recibir excesiva
energa provocando la rotura de varios enlaces qumicos y la consecuente produccin de fragmentos
ionizados cuya masa es igual a la suma de las masas atmicas de un grupo de tomos que retienen la
carga positiva durante el proceso de fragmentacin.
Para compuestos no voltiles, iones de la molcula intacta son producidos al pasar la solucin
por un campo elctrico (electrospray ionization) o por bombardeo de partculas (fast atom
bombardment) o por interaccin con especies fotoexcitadas (matrix-assisted laser desorption). Despus
de producir los iones, el siguiente paso es su anlisis en el analizador de iones de acuerdo a
su relacin masa/carga (m/z). La carga elctrica de los iones permite controlarlos por medio de campos
elctricos y separarlos por su valor m/z en el analizador de masas. Existen diferentes tipos de
analizadores de masas: magnticos, trampa de iones magntica, cuadrupolar, trampa de iones
cuadrupolar, tiempo de vuelo (time-of-flight). Los iones son analizados de acuerdo a su abundancia (o
sea, de acuerdo a su mayor o menor cantidad, vase figura 2-3) a lo largo de la escala m/z. Durante el
proceso de adquisicin de datos provenientes del detector, los datos pueden ser organizados en
forma tabular o en formato de grfica de barras para dar finalmente el espectro de masas de la muestra
analizada.
Figura 2-2: Esquema de un espectrmetro de masas por impacto electrnico (EM-IE).
En Resumen: En un espectrmetro de masa se convierte a las macromolculas (analito) en iones
gaseosos y stos son diferenciados por el analizador segn su relacin m/z (z, carga del ion; m, masa
molar o peso molecular del ion), obtenindose as informacin de su peso molecular.
2.3.Implementacin
Los Espectrmetros de masas se utilizan en la industria y en los ambientes acadmicos con fines
de investigacin. La siguiente lista es solo un breve resumen de las principales aplicaciones:
Biotecnologa: Anlisis de protenas, pptidos, oligonucltidos.
Farmacutica: Descubrimiento de frmacos, qumica combinatoria, farmacocintica, metabolismo
de drogas.
Clnica: neonatal, anlisis de hemoglobina, anlisis de drogas.
Medio ambiente: PAHs, PCBs, calidad de agua, contaminacin de alimentos
Geolgica: composicin del petrleo.
Otros: Anlisis elementales de semiconductores, biosensores y cadenas polimricas complejas.
A continuacin se presenta una lista de implementaciones especficas de la espectrometra de masas,
orientada al uso cotidiano de la misma:
Monitorear los gases de la respiracin en pacientes durante ciruga.
Determinar la composicin de materiales provenientes del espacio exterior.
Determinar la adulteracin en la miel de abeja.
Localizar depsitos petroleros (midiendo precursores del petrleo en rocas).
Monitorear fermentaciones en linea (industria biotecnolgica).
Detectar contaminantes orgnicos en aire, agua, suelo y alimentos.
Determinar algunos tipos de envenenamiento (criminalstica).
Figura 2-3: Ejemplo de resultados obtenidos de la espectrometra de masas.
2.4.Algunas definiciones
Como se vio en la seccin 2.3, el uso de la espectrometra de masas abarca reas relacionadas a
la qumica, muy especficas, por lo que a continuacin definiremos algunas palabras que se suelen
encontrar ntimamente ligadas a la espectrometra.
Genoma: Informacin gentica completa constituda por la codificacin de las cuatro bases
qumicas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Secuencia que produce 3000
millones de letras de cdigo o pares de bases en el genoma humano.
Proteoma: Trmino sugerido en 1994 por Marc. R. Wilkins, de Proteoma Systems en Sydney,
para designar la totalidad de las protenas codificadas por un genoma.
Protemica (Proteomics):La protemica es el estudio y caracterizacin de todo el conjunto de
protenas expresadas de un genoma (proteoma). Las tcnicas de protemica abordan el estudio
de este conjunto de protenas. La Protemica permite identificar, categorizar y clasificar las
protenas con respecto a su funcin y a las interacciones que establecen entre ellas. De este
modo, se pueden caracterizar las redes funcionales que establecen las protenas y su dinmica
durante procesos fisiolgicos y patolgicos. La protemica se est aplicando en la identificacin
de nuevos marcadores para el diagnstico de enfermedades, la identificacin de nuevos
frmacos, la determinacin protenas involucradas en al patogenia de enfermedades y el anlisis
de procesos de transduccin de seales.
Glucmica, Lipmica y Metabolmica (Glycomics, Lipidics y Metabolomics): De la
aplicacin de las espectrometra de masa al anlisis de otras familias de macromolculas
biolgicas tales como hidratos de carbono, lpidos y metabolitos secundarios han surgido nuevas
reas de investigacin denominadas Glucmica, Lipmica y Metabolmica.
Analito: Muestra de un elemento formada por macromolculas, separada para su estudio con un
espectrmetro de masas.
Relacin masa/carga: Esta expresin, abreviada m/z, es la relacin del nmero de masa (m) de
una partcula dada entre el nmero (z) de unidades cargadas electrostticamente (e) que posee
la partcula. As, m/z es una relacin adimensional que es el parmetro medido por el analizador
de masas. La masa de una partcula dada es igual a la suma de sus masas atmicas (en Daltons)
de todos los elementos que componen la partcula. El smbolo para las unidades masa es u, y
corresponde a 1/12 de la masa del 12C, al que se la ha asignado un valor de 12.000000 por
convencin.
Iones doblemente cargados: Es posible para una molcula perder dos electrones durante el
proceso de ionizacin. Estos iones que estn doblemente cargados producirn un pico en el
espectro de masas en un valor m/z numricamente igual a la mitad de la masa molecular del ion.
Los iones doblemente cargados son insignificantes en el espectro de masa para la mayora de los
compuestos. Sin embargo, para aquellas molculas que los produzcan en forma estable, los picos
correspondientes en el espectro de masas pueden ser usados en la interpretacin de datos.
Ion molecular: El ion molecular resulta de la ionizacin de la molcula a analizar. Este ion
representa la molcula intacta y es el ltimo precursor de todos los iones fragmentados que
componen el espectro de masas. El pico del in molecular aparece a un valor m/z
numricamente igual al peso molecular del compuesto.
Pico base: Es el pico ms intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar
las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una intensidad relativa de 100%.
Intensidad relativa: La intensidad relativa de un pico representa su intensidad en comparacin
con el pico base. Se representa como un porcentaje respecto al pico base que es 100%. Por
convencin, este dato se indica en la izquierda del espectro de masas.
Porcentaje total de ionizacin: Este trmino expresa la abundancia de un ion individual
comparado con la suma de las abundancias de todos los iones en un rango de masa especifico.
La escala de porcentaje total de ionizacin esta representada a la derecha del espectro de masas
con el smbolo (%Sn), este dato puede ser utilizado para comparar diferentes espectros de
masas de diferentes compuestos.
Espectro de masas: Un espectro de masas es una grfica de intensidad relativa del ion como
funcin de la relacin masa/carga (m/z). El espectro de masas es frecuentemente representado
como un histograma simple. Esta forma de registro de iones y sus intensidades sirven para
establecer el peso molecular y estructura del compuesto a ser analizado. Debido a que ocurre la
fragmentacin del analito, las fracciones del ion aparecen en el espectro a valores m/z menores
que la molcula completa ionizada (ion molecular) a partir de es tos datos se deduce la
estructura y peso molecular de la molcula completa.
Desorcin: (Del ingls Desorption), Desabsorcin. Emisin de sustancia previamente
absorbida; Emisin de la pared de la cmara de vaco de combustible o impurezas, previamente
absorbidas. Para el caso del sistema MALDI, se refiere a los iones que son arrancados de la
muestra de materia por el lser, es decir, los iones que son desabsorbidos del analito por la
accin del lser.
Figura 2-4: Desorcin, molculas de analito previamente absorbidas por la matriz son des-absorbidas por efecto del lser.
Espectrometra de masas en tndem: Un instrumento utilizado en laboratorios mdicos que
consta de dos espectrmetros de masa en serie conectado por una cmara conocida como clula
de colisin. La muestra que va a ser examinada es esencialmente clasificada y pesada en el
primer espectrmetro de masas, luego es rota en pedazos en la celda de colisin, para ser
nuevamente clasificada/s y pesada/s en el segundo espectrmetro de masa. La espectrometra
de masas en tndem se utiliza en anlisis de recin nacidos para detectar molculas como los
aminocidos (los componentes bsicos de las protenas) y cidos grasos. Espectrometra de
masas en tndem puede ser abreviado como tndem MS o MS / MS.
Cromatografa: La cromatografa de gases y lquidos, es una tcnica separativa que tiene la
cualidad de conseguir la separacin de mezclas muy complejas.
Fotoionizacin: Ionizacin (extraccin de electrones)por medio de la interaccin de radiacin
electromagntica.
Pptidos: Los pptidos estn formados por la unin de aminocidos mediante un enlace
peptdico. Este es un enlace covalente que se establece entre el grupo carboxilo de un
aminocido y el grupo amino del siguiente, dando lugar al desprendimiento de una molcula de
agua[2,6,7].
Protonacin: Aumento del nmero de protones o de tomos de hidrgeno en una molcula.
Deprotonacin: Reduccin del nmero de protones o de tomos de hidrgeno en una molcula.
Scintillator[2]: Es un material que exhibe la propiedad de luminiscencia cuando es excitado por
radiacin ionizante. Los materiales luminiscentes cuando son impactados por una partcula,
absorben la energa de la misma para luego emitirla en forma de fotn en el rango de luz visible.
El Scintillator se utiliza en investigacin en fsica para detectar ondas electromagnticas o
partculas. All convierte la energa en luz de una longitud de onda que se pueda detectar por
detectores tales como tubos fotomultiplicadores.
Efecto Auger (o electrn Auger): Cuando un electrn es arrancado de una de las capas
internas de un tomo, dejando una vacante o hueco, un electrn de un nivel de energa externo
puede caer en esta vacante, resultando en un exceso de energa. Este exceso de energa es
frecuentemente liberada por la emisin de un fotn (flourescencia de rayos x), aunque tambin
puede ser transferida a otro electrn, el cual es emitido del tomo. La energa del electrn Auger
corresponde a la diferencia entre la energa de la transicin electrnica primaria y la energa de
ionizacin para la capa de la cual el electrn Auger fue emitido. Esos niveles electrnicos
dependen del tipo de tomo y del ambiente qumico en el cual se encontraba el tomo.
3.Descripcin general del espectrmetro
Un Espectrmetro de Masas es un instrumento que mide las masas de molculas individuales
que han sido convertidas en iones. No mide la masa molecular directamente, sino que mide la relacin
masa/carga de los iones formados a partir de las molculas. Los espectrmetros de masas tienen siete
componentes mayores: un sistema de entrada, una fuente de iones, un analizador de masas, un
detector, un sistema de vaco, un sistema de control y un sistema de datos. El sistema de entrada, junto
con la fuente de iones y el tipo de analizador de masas definen el tipo de espectrmetro y las
capacidades del sistema. El diagrama de bloques de la Figura 3-1 muestra los componentes principales
de los espectrmetros de masas. El objetivo del sistema de entrada es, el de introducir una pequea
cantidad de muestra (un micromol o menos) en el espectrmetro de masas, donde sus componentes se
convierten en iones gaseosos. A menudo, el sistema de entrada contiene un medio para la volatilizacin
de muestras slidas o lquidas. La fuente de iones de un espectrmetro de masas convierte los
componentes de una muestra en iones por bombardeo con electrones, iones, molculas o fotones.
Alternativamente, la ionizacin se lleva a cabo por energa trmica o elctrica. En muchos casos el
sistema de entrada y la fuente de iones estn combinadas en un nico componente. En ambos casos, lo
que se obtiene es un haz de iones positivos o negativos (frecuentemente positivos) que es entonces
acelerado en el analizador de masas. La funcin del analizador de masas es parecida a la de la rejilla de
un espectrmetro ptico. En el primero, sin embargo, la dispersin est basada en las relaciones
carga/masa de los iones del analito en vez de en la longitud de onda de los fotones. Existen diversos
tipos de espectrmetros de masas, dependiendo de la naturaleza del analizador de masas. A1 igual que
en un espectrmetro ptico, un espectrmetro de masas contiene un detector (para iones) que
convierte el haz de iones en una seal elctrica que puede ser entonces procesada, almacenada en la
memoria de un ordenador y mostrada o registrada de varias maneras. Un hecho caracterstico de los
espectrmetros de masas, que no es comn con los instrumentos pticos (pero que se encuentra en los
espectrmetros de electrones), es la necesidad de un sistema de vacio adecuado para mantener bajas
presiones (10
-4
a 10
-8
[torr]) en todos los componentes del instrumento excepto el procesador de seal y
dispositivo de lectura.
Figura 3-1: Diagrama en bloques de un espectrmetro de masas.
3.1.Sobre los procesos asociados a la espectrometra
Los procesos bsicos asociados con la espectrometra de masas abarcan desde la generacin de
iones en fase gaseosa de un analito hasta la medicin de las relaciones masa/carga (m/z) de estos
iones. La formacin de iones de la muestra en fase gaseosa es un prerrequisito esencial en el proceso
de verificacin de masas moleculares o anlisis. Aunque los primeros espectrmetros de masas
requeran que la muestra estuviera en forma gaseosa, nuevos desarrollos han permitido incluir
muestras en soluciones lquidas o en una matriz slida. Dependiendo del tipo de entrada y tcnica de
ionizacin usada, la muestra puede ya estar en forma de iones en solucin, o puede ser ionizada en
conjunto con su volatilizacin por otros mtodos en la fuente de iones. El hecho de estudiar el analito a
travs de iones en fase gaseosa le da a la espectrometra dos caractersticas fundamentales:
La primera es que el movimiento de los iones en fase gaseosa puede ser controlado en forma
precisa por campos electromagnticos . El hecho de que la movilidad de los iones es proporcional
a la relacin m/z del ion, nos permite la medicin de la m/z y por lo tanto de la masa del analito.
Los detalles concernientes a diferentes tipos de tcnicas de anlisis de masas y tcnicas de
ionizacin utilizadas determinan factores tales como la precisin y exactitud de la medicin de
m/z, la resolucin, y el rango de m/z del analizador.

La segunda es que el uso de iones en fase gaseosa incrementa la sensibilidad del espectrmetro
de masas. El movimiento preciso de iones en campos electromagnticos que permiten medir m/z
tambin les provee contencin y enfoque.
Durante el proceso de medida de m/z, los iones son transmitidos con gran eficiencia a los
detectores de partculas que registran la llegada de estos iones. Estas llegadas son detectadas con gran
sensibilidad debido a una combinacin de seales de bajo fondo y la eficiente generacin de electrones
secundarios que pueden subsecuentemente ser multiplicados por factores de 10
5
o mayores. El
mantenimiento de la precisin y exactitud de estos movimientos y por lo tanto de la sensibilidad
del anlisis requiere operacin experta del sistema de espectrometra de masas. Algunas desventajas
del uso de iones en fase gaseosa es la dificultad de la generacin de los iones y de llevarlos a la fase
gaseosa, adems de la complejidad de los instrumentos utilizados en este tipo de experimentos. Dicha
complejidad se traduce en altos precios de adquisicin y mantenimiento de los mismos. Sin embargo,
por un lado el desarrollo de la ionizacin por electrospray y MALDI han aportado dos importantes
mtodos para la produccin de iones de pptidos y protenas en fase gaseosa; y por otro, la
sofisticacin, productividad y reproducibilidad de los experimentos desarrollados puede justificar el
costo de la espectrometra de masas que resulta proporcional a los costos asociados con otros
componentes involucrados en los proyectos de investigacin o desarrollo que requieren este tipo de
anlisis.
Nota: En las siguientes secciones se realizar una descripcin de los componentes fundamentales que
forman y, en algunos casos, dan nombre a los espectrmetros de masas.
COMPONENTE VARIANTES
Sistema de entrada a) Directo.
b) Columna capilar cromatografa lquida.
Fuente de iones a) Impacto electrnico.
b) Ionizacin Qumica.
c) Ionizacin de campo.
d) Desercin de campo.
e) Bombardeo con tomos Rpidos.
f) Electrospray, incluyendo nanospray y
microspray.
g) Matrix-assisted laser desorption (MALDI)
Analizador de masas a) Cuadrupolo.
b) Trampa de iones (Ion-trap).
c) Tiempo de vuelo (Time-of-flight TOF).
d) Analizador FT-ICR
Tabla 3-1: Variantes de componentes del sistema de espectrometra de masas.
Nota: En el presente informe nos avocaremos a estudiar los mtodos de espectrometra que
implementan L.A.S.E.R. Para mayor informacin sobre los dems mtodos se recomienda ver la
bibliografa[3].
4.Entrada de la muestra
La finalidad del sistema de entrada es la de permitir la introduccin de una muestra
representativa en la fuente de iones con la mnima prdida de vaco. Los espectrmetros de masas ms
modernos estn equipados con dos tipos de entradas, la de sonda directa y las cromatogrficas, con lo
que son capaces de acomodar diversos tipos de muestras.
4.1.Entrada por sonda directa
Para slidos razonablemente puros, la muestra es colocada sobre la punta de una barra o sonda
que es introducida dentro del espectrmetro a travs de un sistema de vaco (cmara intermedia). La
cmara intermedia est diseada para limitar el volumen de aire que puede entrar en la regin de
ionizacin durante la insercin de la sonda. Las sondas se utilizan tambin cuando la cantidad de
muestra es limitada. Por tanto, los espectros de masas se pueden obtener a menudo con una cantidad
de muestra tan pequea como unos pocos nanogramos. En una sonda, la muestra se pone
generalmente en la superficie de un vidrio o en un tubo capilar de aluminio, un alambre fino o una copa
pequea y la sonda se coloca a unos pocos milmetros de la fuente de ionizacin y de la rendija que
conduce al espectrmetro. La muestra es entonces evaporada o sublimada en una fase gaseosa,
usualmente por medio de calor. Gases y lquidos pueden ser introducidos a travs de sistemas de
entrada diseados especialmente con un control de flujo, llamados sondas directas (direct probes),
estos dispositivos transfieren la muestra desde el exterior a travs de un sistema de vaco hacia la
fuente de ionizacin que esta a alta presin; Figura 4-1 y 4-2. Estas sondas pueden ser diseadas para
soportar muestras para ser ionizadas por distintos mtodos. Una vez que la muestra est es fase
gaseosa es ionizada y frecuentemente fragmentada para proceder al anlisis de masas. En algunas
tcnicas especializadas, la volatilizacin y la ionizacin de la muestra ocurren al mismo tiempo.
Figura 4-1: Esquema de un sistema de introduccin de muestra por
sonda para introducir una muestra en la fuente de iones (DIP).
Figura 4-2: Sondas directas (direct probes).
La baja presin del rea de ionizacin y la proximidad de la muestra a la fuente de ionizacin a
menudo hace posible la obtencin de espectros de compuestos inestables trmicamente antes que se
descompongan. La baja presin proporciona tambin una mayor concentracin de compuestos
relativamente no voltiles en el rea de ionizacin, de modo que, la sonda permite el estudio de
materiales no voltiles tales como carbohidratos, esteroides, especies organometlicas y sustancias
polimricas de bajo peso molecular. El requisito principal de la muestra es que alcance una presin
parcial de al menos 10
-8

[torr] antes que empiece a descomponerse.
4.2.Sistemas de entrada cromatogrficos[4,5]
Para obtener el espectro de masas de un compuesto simple de una mezcla, los componentes
individuales deben ser separados antes del anlisis de espectrometra de masas. La separacin de los
compuestos es necesaria para tener certeza de la identificacin, ya que dos o ms compuestos
presentes en la muestra pueden crear espectros que se superpongan o mezclen, dificultando as el
anlisis de los datos obtenidos. Desde que en la dcada de los 60s se acopl la cromatografa de gases
(GC) a la espectrometra de masas, esta conexin permit separar compuestos ya en fase gaseosa para
su entrada al espectrmetro. Al entrar las distintas fracciones en diferentes tiempos en forma continua
permite un anlisis secuencial de las muestras. Recientemente, equipos de cromatografa de lquidos
(LC), cromatografa de fluidos supercrticos, HPLC y electroforesis capilar, utilizados para separar
compuestos, se han comenzado a acoplar a espectrmetros de masas para anlisis de muestras
complejas. El acoplamiento de una columna cromatogrfica a un espectrmetro de masas requiere la
utilizacin de sistemas de entrada especiales, algunos de los cuales se describen a continuacin.
Figura 4-3: Columnas de cromatografa.
4.2.1.Cromatografa de gases/Espectrometra de masas
Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen equipos de cromatografa de gases que pueden
acoplarse directamente con distintos tipos de espectrmetros de masas de barrido rpido. El caudal de
las columnas capilares en general es suficientemente bajo como para que la salida de la columna pueda
introducirse directamente en la cmara de ionizacin de un espectrmetro de masas. Desde finales de
los aos setenta han aparecido en el mercado diversos espectrmetros de masas diseados
especficamente como detectores para cromatografa de gases.
4.2.2.Cromatografa HPLC/Espectrometra de masas
Un problema fundamental del acoplamiento de la cromatografa de lquidos con la
espectrometra de masas es el enorme contraste que existe entre los volmenes relativamente grandes
de disolvente de la primera y los requerimientos de vaco de la ltima. Para resolverlo se han
desarrollado diversas interfaces. Las tcnicas que se usan rutinariamente en la actualidad para la
introduccin y anlisis de muestras lquidas, pueden clasificarse en dos grupos: las que solo introducen
la muestra lquida en la fuente inica del instrumento tales como las de haz de partculas (PB, Particle
Beam) y las que adems consiguen la ionizacin de la misma (TSP = Thermospray o termonebulizacin,
LC-FAB = Liquid chromatography - Fast Atom Bombardment, ESI= Electrospray Ionization). En la Tabla 4-
1, se muestran algunas de las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas.
Tipo Lmite de
deteccin
Rango de flujo
del LC
Tipos de
disolventes
Muestras
semivoltiles
Muestras no
voltiles /
termovoltiles
Rango de
pesos
moleculares
DLI XX X XXX XXXX XX XX
Cinta XX XXXXX XXXXX XXXXX X X(X)
TSP XX(XX) XXXXX XXXX XXXXX XXX(X) XXX(X)
LC/FAB XX(XX) X XXX XXXX XXXXX XXXX
PB XX XXX(X) XXXX XXXXX X(X) X(X)
ESI XXXX(X) X XX(X) XXXX XXXXX XXXXX
Tabla 4-1: Ventajas e inconvenientes de las interfaces LC/MS. Mayor nmero de X
indica mayor rendimiento. Entre parntesis se indica el rango de la respuesta.
Figura 4-4: Mtodos cromatogrficos.
5.Fuente de ionizacin
5.1.Descripcin de las mltiples fuentes de ionizacin
Histricamente, los iones para anlisis de masas se producan por bombardeo de los
componentes de muestras gaseosas con electrones de elevada energa. A pesar de ciertas desventajas,
esta tcnica todava tiene una gran importancia y es en la que se basan la mayor parte de las
bibliotecas de espectros. Sin embargo, durante las dos ltimas dcadas se han desarrollado varias
nuevas fuentes de iones que ofrecen ciertas ventajas sobre la clsica fuente de haz de electrones. La
Tabla 5-1 da un listado de stas.
Normalmente, la mayora de los espectrmetros de masas comerciales estn equipados con
accesorios que permiten el uso de varias de estas fuentes, intercambiables. Ntese que las fuentes que
se indican en la Tabla 4-1 pertenecen a dos categoras. La primera corresponde a las fuentes de fase gas
en las que la muestra es primero volatilizada y a continuacin los componentes gaseosos son ionizados
de diversas maneras. La segunda categora de fuentes es la de fuentes de desorcin en la que se
prescinde de la vaporizacin de la muestra y en consecuencia, esta tcnica requiere siempre la
utilizacin de una sonda de muestra. En este caso, la energa se transmite a la muestra slida o lquida,
de maneras muy diversas produciendo la ionizacin y la transferencia directa de iones de la fase
condensada al estado gaseoso inico. La mayor ventaja de la ionizacin por desorcin es que permite el
examen de molculas no voltiles y trmicamente inestables tales como las que se encuentran
normalmente en bioqumica.
Las fuentes de iones se clasifican a menudo en duras o blandas. La fuente dura ms importante
es la fuente de impacto de electrones (para ms detalles remtase a la bibliografa [3]). Estas fuentes
duras comunican energas elevadas a los iones formados de manera que se encuentran en estados
vibracionales y rotacionales excitados. La relajacin de estos iones produce una gran cantidad de
fragmentacin y resultan espectros de masas complejos. Por el contrario, las fuentes blandas, tales
como las fuentes de ionizacin qumica y la de desorcin, producen relativamente poca excitacin de los
iones, de modo que, tiene lugar poca fragmentacin, y los espectros son sencillos. Ambos tipos de
espectros son tiles.
Los espectros sencillos de las fuentes blandas permiten la determinacin exacta del peso
molecular del analito, mientras que los modelos espectrales ms complejos de las fuentes duras a
menudo permiten una identificacin inequvoca del mismo. El mtodo de ionizacin que se utilizar
depender del tipo de la muestra, objeto de la investigacin y el espectrmetro de masa disponible. A
continuacin se presenta una lista de los mtodos de ionizacin:
Electron Impact (EI) - Ionizacin por impacto de electrones.
Fuentes de ionizacin qumica - (CI = Chemical ionisation).
Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) Ionizacin qumica por presin atmosfrica.
Fuentes de ionizacin a presin atmosfrica (API).
Fuentes de ionizacin de campo (FI = Field ionisation).
Fuentes de desorcin de campo (FD = Field desorption).
Fuentes de bombardeo por tomos rpidos (FAB=Fast Atom Bombardment) o iones (SIMS =
Secondary ion MS).
Ionizacin por Electrospray (Electrospray Ionization ESI).
Thermospray Ionisation (TSP) Ionizacin por termo spray.
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Desorcin / ionizacin lser asistida por
matriz.
Nota: En el presente informe nos concentraremos en el mtodo de espectrometra que usa ionizador
lser.
Nombre Abreviatura Tipo Agente ionizante
Ionizacin por electrones EI Fase gas Electrones energticos
Ionizacin qumica CI Fase gas Iones reactivos
Ionizacin por campo FI Fase gas Electrodo de elevado
potencial
Desorcin por campo FD Desorcin Electrodo de elevado
potencial
Bombardeo con tomos
rpidos
FAB Desorcin tomos energticos
Espectrometra de masas
de iones secundarios
SIMS Desorcin Iones energticos
Desorcin por lser LD Desorcin Haz lser
Desorcin por plasma PD Desorcin Fragmentos de fisin de
elevada energa
Desorcin trmica Desorcin Calor
Ionizacin
electrohidrodinmica
EHMS Desorcin Campo elevado
Ionizacin por
termovaporizacin
ES Cargas positivas aplicadas
sobre finas gotitas de la
disolucin de la muestra
Tabla 5-1: Fuentes de ionizacin.
5.2.Introduccin Desorcin/Ionizacin Lser Asistida por
Matriz(MALDI)
La ionizacin MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, desorcin/ionizacin mediante
lser asistida por matriz), es una tcnica de ionizacin suave, la misma permite el anlisis de
biomolculas(biopolmeros, como protenas, pptidos y azcares), y de grandes molculas orgnicas
(como los polmeros, dendrmeros y otras macromolculas), que tienden a ser frgiles y fragmentar
cuando son ionizadas por los mtodos convencionales de ionizacin. En lo que se refiere a su suavidad y
a los iones producidos MALDI es muy similar a la ionizacin por electrospray. La ionizacin es provocada
por un rayo lser (normalmente un lser de nitrgeno).
Figura 5-1: Esquema de la espectrometra de masas MALDI.
5.3.La matriz
En este mtodo de ionizacin los analitos son disueltos en una solucin de un compuesto que
absorbe UV, llamado matriz (matrix), y colocado dentro del espectrmetro de masas. Debido a que los
solventes se van secando, los compuestos de la matriz se cristalizan y los analitos quedan contenidos
dentro de la matriz de cristales (se dice que el analito se co-cristaliza con la matrz).
Figura 5-2: Matriz.
La matriz se utiliza para proteger a la biomolcula de ser destruida por el impacto directo del
rayo lser y para facilitar la vaporizacin y la ionizacin; la misma acta como intermediaria en el
proceso de transferencia de energa del haz lser a los analitos. En el proceso de conversin de las
molculas neutras de analito a especies cargadas o iones (generalmente protonados), la matriz juega un
papel fundamental al ceder protones (H+) a los analitos. Una solucin para una matriz se hace, a
menudo en una mezcla de agua muy purificada y un disolvente orgnico (normalmente acetonitrilo
(ACN) o etanol). cido trifluoroactico (TFA) puede ser tambin aadido. Un buen ejemplo de una
solucin para matriz sera de 20 mg / ml de cido sinapinic en ACN: agua: TFA (50:50:0.1). En la figura
5-2 se pueden observar los distintos compuestos utilizados en las matrices MALDI.
Figura 5-3: Distintos compuestos utilizados en matrices MALDI.
consideraciones:
Los compuestos utilizados son de bajo peso molecular (para permitir la fcil vaporizacin), pero
son lo suficiente mente grandes (con una presin de vaporizacin lo suficientemente baja) para
que no se evapore durante la preparacin de la muestra o mientras estn en el espectrmetro.
Son cidos, por lo tanto, actan como una fuente de protones para fomentar la ionizacin del
analito.
Tienen una fuerte absorcin ptica en la gama de los UV, para absorber rpida y eficientemente
la radiacin del lser.
Son fusionados con grupos polares, lo que permite su uso en soluciones acuosas.
La solucin (analito-cido) es colocada sobre un plato MALDI (generalmente una placa metlica
diseada para ste propsito). Los platos son de acero pulido, plata o cromo plateado
Figura 5-4: Contenedor de plata para 10 muestras, cada pozo mide 23 mm de dimetro(Izq.). Detalle del pozo 10 del contenedor;
(Der.) el rectngulo muestra el lugar donde impactar el lser. La lnea blanca es un rasguo. La muestra aplicada es una solucin
en acetona que form una capa cristalina. Se necesitan entre 10-100 disparos del lser para evaporar la capa completamente.
Los solventes se vaporizan dejando solo la matriz recristralizada, pero ahora las molculas del analito se
han propagado por todos los cristales. Se dice entonces que la matriz y el analito se han co-cristalizado
en la placa MALDI.
5.4.El lser
Pulsos de lser de luz UV son utilizados para vaporizar pequeas cantidades de la matriz, donde
se incluyen los iones del analito, y llevarlos a la fase gaseosa en el proceso (Figura 5-5).
Figura 5-5: Esquema de la Desorcin/Ionizacin Lser.
La ionizacin del analito se puede dar por deprotonacin (protonacin), al aceptar o ceder un
electrn, por unin de cationes o fotoionizacin, por lo que los iones generados por MALDI son de una
amplia variedad de molculas, ya que dependiendo de la combinacin entre el analito y la matriz ser el
tipo de iones predominantes en el espectro obtenido. Comnmente la ionizacin ocurre por protonacin
en el ambiente cido producido por los compuestos de la matriz y por la adicin de cido diluido en la
muestra. La protonacin de pptidos es particularmente eficiente en ambientes cidos, haciendo de
MALDI, un mtodo efectivo para producir pptidos protonados. Debido a que con la desorcin por lser
la produccin de iones es discreta y en pequeos paquetes, el MALDI esta comnmente combinado con
un analizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un sistema de alta sensibilidad. Mientras que ESI es
afectado por especies contaminantes, MALDI puede tolerar niveles variables de algunos contaminantes.
Cada pulso lser genera una pequea cantidad de plasma que se expande en vaco, del cual se extraen
los iones (positivos o negativos) del analito que son acelerados por un potencial de 10-30 kV y
controlados por medio de campos electromagnticos.
El tipo de lser ms comn en sta clase de espectrmetros es el de nitrgeno. Este es un lser
de fcil montaje y numerosas aplicaciones. Debido a sus componentes de bajo coste y la abundancia del
medio activo (N
2
o simplemente aire), el lser de nitrgeno puede ser construido con pocos recursos y
con bsicos conocimientos tcnicos. Desde su descubrimiento en 1963, el lser de Nitrgeno molecular
ha sido optimizado hasta obtener pulsos ultracortos y de gran potencia. En la actualidad se han
registrado emisiones de pulsos ultravioleta del orden de 5ns, centrados en los 337.1nm y con potencias
que van desde unas centenas de kW hasta los 5MW. Mejoras como el bombeo por descarga o por un haz
de electrones han hecho que el lser de nitrgeno molecular sea hoy en da una herramienta verstil
tanto en la industria como en la investigacin. Las caractersticas diferenciales de la radiacin lser son:
Alta direccionalidad (la desviacin respecto a un haz exactamente paralelo es de slo algunos
miliradianes). Ello se debe al estricto alineamiento de los dos espejos situados en ambos
extremos de la cavidad.
Monocromaticidad, debido a los lmites impuestos por la ley de Planck y la condicin de que la
longitud de la cavidad lser debe ser un mltiplo entero de semilongitudes de onda.
Brillo extremadamente elevado, ya que el ngulo slido en el que se distribuye la radiacin es
muy pequeo.
Coherencia espacial y temporal, debido a que las ondas asociadas a todos los fotones estn en
fase.
En el lser de nitrgeno se aplica un pulso de alto voltaje (20 kV de C.A.), disparado por un descargador
o tiratrn, que atraviesa la cavidad.
Figura 5-6: Lser de nitrgeno.
5.5.MALDI a presin atmosfrica (AP-MALDI)
MALDI a presin atmosfrica es una tcnica de ionizacin que, en contraste con MALDI en vaco,
opera en condiciones de presin atmosfrica. Los iones en MALDI en vaco se forman a una presin de
10 mTorr o menos, mientras que en la AP-MALDI, los iones se forman a presin atmosfrica. La
desventaja de este mtodo es la limitacin de la sensibilidad y del rango de masa. AP-MALDI se utiliza
en una variedad de aplicaciones de la espectrometra de masa, que va desde la protemica hasta el
campo del descubrimiento de frmacos. La fuente de iones AP-MALDI es fcilmente acoplable a un
espectrmetro de masas de trampa de iones o cualquier otro sistema de espectrometra equipado con
ESI (ionizacin por electrospray) o fuente nano ESI.
6.Analizador de masa
6.1.Introduccin a los analizadores de masas
Los analizadores de masas llevan a cabo la separacin de los iones producidos por diferentes
mtodos en una fuente de iones, de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z) para que puedan llegar al
detector. La unidad para m/z es el Thomson (Th). En los experimentos de espectrometra de masas
aparecen dos clases principales de iones, el ion molecular, que es la molcula completa del analito, y
fragmentos inicos, los cuales contienen solo una parte de la estructura. El peso molecular de una
molcula puede ser calculado de la m/z del ion molecular, si la carga (z) es conocida, la informacin
estructural se obtiene a partir de las m/z de los fragmentos del ion. Una variedad de analizadores de
masas estn disponibles para realizar estas mediciones, incluyendo cuadrupolo (quadrupole), trampa de
iones (ion-trap), tiempo de vuelo (time-of-flight), sector magntico (magnetic sector), ciclotrn (ion
cyclotron resonance) y otros. Cada tipo de analizador posee caractersticas y aplicaciones especiales, as
como beneficios y limitaciones. La seleccin del tipo de analizador a utilizar es en base a que aplicacin
se le dar, el costo y el rendimiento deseado, ya que el analizador determina varias caractersticas del
resultado del experimento, entre estas la resolucin y el rango de m/z de los iones que pueden ser
medidos.
Nota: En el presente informe nos limitaremos a los analizadores utilizados en los equipos de
espectrometra lser.
6.2.Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight - TOF)
El principio de operacin del analizador de tiempo de vuelo (time-of-flight: TOF) involucra la
medicin del tiempo requerido por un ion para viajar desde la fuente de iones hasta el detector
localizado a 1 o 2 mts. de la fuente. Todos los iones reciben la misma energa cintica durante la
aceleracin instantnea (3000 eV), pero debido a que tienen diferentes valores de m/z, se separan en
grupos de acuerdo a su velocidad (por lo tanto m/z) como van recorriendo la regin libre de campo entre
la fuente de iones y el detector. Los iones chocan secuencialmente en el detector en forma de un
incremento de m/z. Los iones de baja m/z llegan al detector antes que aquellos con m/z alta debido a
que entre mas m/z tengan los iones tendrn una velocidad menor (Figura 6-1).
Figura 6-1: analizador TOF.
La energa cintica de un ion se define por:
Ec = eV =
mv
2
2
; Ec6-1
La velocidad del ion:
v =
2 z eV
1/2
m
; Ec 6-2
Debido a que es imprctico medir directamente la velocidad del ion; el tiempo de vuelo desde la fuente
de iones hasta el detector (separados por una distancia L) provee la informacin necesaria:
tof =
L
v
=
Lm
2 z eV
1/2
; Ec6-3
El valor de m/z para un ion es determinado por su tof (tiempo de vuelo) al detector calibrado
con los tof de al menos 2 iones de m/z conocida. El tiempo de trnsito de un ion de 3000 eV de 800 m/z
es aproximadamente 30 seg a travs de un tubo de 1m de vuelo, el ciclo de produccin de iones,
aceleracin y deteccin es completado en un periodo de aproximadamente 100 seg para un rango
mayor de 1000 m/z. Los iones que parten de la fuente de iones en un espectrmetro de masas TOF no
tienen los mismos tiempos de partida ni exactamente la misma energa cintica, por lo que estos
aparatos han sido diseados para compensar estas diferencias. El analizador TOF es el analizador de
masas ms rpido, tiene alta transmisin de iones y el rango de masas ms grande de todos los
analizadores de masas. Algunas limitaciones son que en muchas ocasiones requieren exclusivamente de
un mtodo de ionizacin por pulsos y que la selectividad de los iones puede limitarse en algunos
experimentos. Casi todos los sistemas MALDI estn en conjunto con un analizador de TOF, los sistemas
GC/MS con TOF poseen una alta velocidad de anlisis.
Figura 6-2: Espectrmetro MALDI-TOF.
6.2.1.Analizador TOF Lineal
A la salida de la fuente de ionizacin los iones son acelerados en un campo elctrico (30 kV de
C.A) y conducidos a una zona de deriva libre de campos. Este voltaje de aceleracin proporciona a todos
los iones la misma energa cintica y, por lo tanto, distintas velocidades en funcin de sus relaciones
masa-carga. Los iones ms livianos viajarn a mayor velocidad a lo largo de la zona de deriva y llegarn
antes al detector, el cual registra los tiempos de vuelo de los distintos iones. Dichos tiempos son del
orden de entre 1 a 30 s. A partir de los tiempos de vuelo pueden derivarse las relaciones masa-carga
de los iones.
Figura 6-2: Analizador TOF lineal.
6.2.2.Analizador TOF Reflector
La principal limitacin de los analizadores TOF lineales es la relativamente baja resolucin que
alcanzan debido a la dispersin energtica del paquete de iones generado y otros factores como la
formacin diferida de iones (iones que se forman en diferentes momentos) y los efectos espacio-carga.
Se consigue una notable mejora aadiendo al dispositivo un reflectrn o espejo inico que, mediante un
campo electrosttico, refleja los iones hacia un segundo detector. De esta manera, iones con la misma
relacin masa carga pero con energas cinticas mayores penetran ms profundamente en el reflectrn,
retrasndose su tiempo de llegada al detector reflector respecto al de los iones de menor energa. Si un
paquete de iones de una m/z dada contiene iones con diferentes energas cinticas, el reflectrn
disminuir la dispersin de los tiempos de vuelo de los iones, mejorando la resolucin del
espectrmetro.
Figura 6-3: Analizador TOF Reflector.
6.2.3.Analizador TOF / TOF
Los analizadores TOF/TOF proporcionan un mejor enfoque de los iones y, por tanto, mayor
resolucin y precisin msica. En una primera etapa (TOF 1), los iones son acelerados a bajo voltaje (ca.
7 kV) en condiciones que favorecen la fragmentacin metaestable. Un pulsador temporal permite
seleccionar un determinado ion padre y sus iones fragmento y este paquete de iones es a continuacin
acelerado a un potencial mayor (ca. 20 kV). El analizador TOF 2 permite separar los iones que
componen el paquete, ricos en energa pero con una distribucin energtica estrecha.
Figura 6-5: Analizador TOF-TOF.
6.3.Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron
Resonance)
El analizador FT-ICR (Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) es probablemente el mtodo
ms complejo de anlisis de masas. Esta tcnica fue desarrollada en los 50s, es altamente sensible,
pero tiene limitaciones de resolucin de masas (>106 Da). Este tipo de espectrmetros consisten
principalmente de tres secciones, la primera es la fuente de iones (ESI y MALDI son las ms comunes),
despus la regin de transferencia de iones donde los iones producidos son captados, enfocados y
transferidos a una regin de alto vaco antes de entrar al analizador, y finalmente el analizador. El
arreglo estndar para el analizador FT-ICR, es una trampa de iones localizada dentro de un campo
magntico especialmente uniforme de una fuerza B
0
. El efecto del campo magntico es obligar a los
iones incidentes a circular en una rbita (Figura 6-5), la frecuencia es determinada por la masa (m), la
carga (z) y velocidad (v) del ion, por accin de la ley de Lorentz. El ion es llevado a una trayectoria
circular en un plano perpendicular al campo magntico. La frecuencia angular de los iones (wc) se
define por la ecuacin 2. El sentido contrario de rotacin es experimentado por iones de carga opuesta.
F = z
i
v B
0
; Ec 6-4
u
c
=
z
i
B
0
2m
i
; Ec 6-5
m
i
=
B
0
2 z
i
u
c
; Ec6-6
Donde :
F=fuerza de lorentz
B
0
=campo magntico
m
i
=masa del ion
z
i
=carga del ion
v=velocidad incidente del ion
u
c
= frecuencia rotacional inducida(ciclotrn)
Figura 6-5: Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance).
La presencia de iones entre el par de electrodos (en la trampa) no producir ninguna seal
medible, por lo que es necesario excitar los iones de una m/z dada como un paquete a un radio orbital
mayor al aplicar barrido de potencial RF de milisegundos. Una frecuencia excitar una m/z particular (la
transformacin de Fourier permite medir simultneamente todas las frecuencias). La medicin de la
frecuencia angular (
c
) lleva a valores de m/z y al espectro de masas. Debido a que la frecuencia puede
ser medida ms exactamente que otras propiedades fsicas, esta tcnica de anlisis tiene una gran
resolucin. Despus de la excitacin, los iones regresan a su estado normal. Este tipo de analizadores
poseen la resolucin de masas mas alta, alta capacidad, y acoplamiento a mtodos de ionizacin por
pulsos (MALDI); es un mtodo no destructivo, pero posee un rango de masa limitado, puede sufrir
efectos por cargas y por reacciones entre los iones, se deben cuidar muchos parmetros para tener
buenas mediciones. Se acopla bien a MALDI y ESI.
7.Detector
Comercialmente son asequibles varios tipos de detectores para espectrmetros de masas. En los
primeros aos predominaban los multiplicadores de electrones de deteccin puntual situados en el
ambiente de alto vaco del espectrmetro. Estos mediante un proceso de avalancha, transforman las
partculas incidentes en seales elctricas mensurables. Mas tarde fueron apareciendo nuevos
desarrollos para deteccin puntual, como los detectores "Channeltron" de bajo coste y uso general, y los
sistemas de conversin fotnica mas sofisticados, sensibles y duraderos. Tambin han aparecido
sistemas de deteccin simultnea, tales como bateras de micromultiplicadores multicanal
(Microchannel Plate o Multichannel Multiplier Array Detector), combinadas normalmente con posterior
centelleo o conversin fotnica, cuya aportacin a los nuevos desarrollos instrumentales en
espectrometra de masas ha sido importante. La sensibilidad, precisin, y tiempo de respuesta son
criterios importantes que distinguen los diferentes sistemas de deteccin de iones. Alta precisin y
rpido tiempo de respuesta son caractersticas mutuamente excluyentes. Idealmente, la sensibilidad
debe definir explcitamente la corriente de ion recibida por el detector. La definicin debe incluir: (1) el
nombre del compuesto de calibracin, (2) el valor m/z del ion medido, (3) el poder de
resolucin del instrumento, (4) la cantidad de compuesto de calibracin consumido por minuto, (5) la
intensidad de la corriente de electrones y presin de la fuente de iones (para CI: ionizacin
qumica), (6) la corriente del ion que llego al detector. Estas unidades de sensibilidad permiten
comparar instrumentos, que en ocasiones es difcil ya que las diferentes compaas usan diferentes
criterios.
7.1.Detector de copa de Faraday
Este es un detector elctrico convencional, iones positivos que impactan sobre el colector son
neutralizados por electrones despus de pasar a travs de una resistencia. La cada de voltaje en la
resistencia de acuerdo a un estndar es la medicin de la corriente del ion. La seal del voltaje de la
resistencia es entonces amplificada por un amplificador DC o por un electrmetro. La mnima corriente
detectable es del orden de 10
-14
A. El pequeo electrodo de metal que intercepta los iones positivos esta
montado en una jaula de Faraday (Figura 7-1). La corriente del ion medida y amplificada es
directamente proporcional al nmero de iones y al nmero de cargas de los iones. La respuesta de la
copa faraday es independiente de la energa, la masa, o la naturaleza qumica de los iones. Este tipo de
detector es simple, barato, resistente y fiable. Posee alta precisin, sensibilidad y produce poco ruido de
salida. La principal desventaja es que tiene un gran retraso inherente a la simplificacin del sistema. Por
esto es que se utiliza para mediciones precisas o de corrientes de iones poco cargados y no debe ser
usado para realizar examinaciones rpidas (por ejemplo en sistemas GC/MS). Se utiliza principalmente
en sistemas para anlisis de gases permanentes, en muestras ambientales, reactores, gases residuales,
etc., normalmente combinado con un SEM (Multiplicador de Electrones Secundarios = Secondary
Electron Multiplier), usndose uno u otro segn la sensibilidad requerida y el vaco disponible. Tambin
tiene aplicacin en los espectrmetros de masas para medida de Relaciones Isotpicas (IRMS = Isotopic
Ratio Mass Spectrometer). En estos equipos se utilizan colectores mltiples, formados por una batera
de copas de Faraday, cada una de las cuales se dedica a la deteccin de una nica masa.
Figura 7-1: Diagrama esquemtico del detector Copa de Faraday.
7.2.Multiplicador de electrones secundarios
El multiplicador de electrones (electron multiplier) utiliza el principio de emisin secundaria de
electrones para afectar la amplificacin. En el dinodo discreto (discrete-dynode) los iones provenientes
del analizador de masas son enfocados sobre un dinodo que emite electrones en proporcin directa al
nmero de iones bombardeados hacia l. Los electrones secundarios emitidos por el dinodo (convierte
iones en electrones) son acelerados y enfocados hacia un segundo dinodo, el cual tambin emite
electrones secundarios (multiplicacin de electrones). De este modo, la amplificacin es llevada a cabo
a travs de un efecto cascada de electrones secundarios de dinodo a dinodo, ya que el nmero de
electrones que llegan a un dinodo es menor al que sale del mismo (Figura 7-2). Cada etapa es un
dinodo de cobre-berilio conectado a un potencial sucesivamente mayor por un divisor de voltaje.
Pueden llegar a tener de 10 a 20 etapas amplificando la seal en un orden de hasta 10
7
. Es un detector
mucho ms sensible que el de copa de Faraday, con una seal mnima detectable del orden de 10
-18
A.
Requiere alta tensin y un mayor vaco para operar, del orden de 10
-6
[torr] o mejor. Es un detector de
vida limitada, pues se va desgastando con el uso, por lo que su ganancia va cambiando con el tiempo y
requiere calibracin frecuente. Es muy sensible a subidas de presin, pudiendo destruirse prcticamente
si se produce una ruptura o accidente de vaco. La velocidad de respuesta del multiplicador de
electrones, tpicamente inferior a 50 ns, es mucho ms rpida que la del detector Faraday, lo que
permite mayores velocidades de barrido en el espectrmetro de masas.
Figura 7-2: Multiplicador de electrones de dinodo discreto (discrete-dynodo).
Esta clase de detector lleva asociado sistemas electrnicos y mecnicos simples, aunque pueden
no ser tan sensibles (al no tener amplificacin de seal) y un tiempo de respuesta lento debido a alta
impedancia en el amplificador. Es decir que si el amplificador de salida no es lo suficientemente bueno
puede echar por tierra todas las ventajas que este tipo de detectores presenta.
7.3.Detector "Channeltron"
Este detector es uno de los ms utilizados hoy en da en espectrometra de masas para uso
general. Es similar al multiplicador de electrones clsico, con la principal diferencia de que no tiene
mltiples dinodos discretos, sino que est formado por un tubo de vidrio en forma de corneta, a veces
terminado en forma de espiral o caracol (figura 7-3), cuyo interior est recubierto por un xido de plomo
semiconductor de composicin y caractersticas especiales. Si se desea detectar iones positivos, se
aplica un potencial negativo en la boca del detector para que los iones procedentes del espectrmetro
de masas, desviados de su trayectoria por una placa repulsora con potencial positivo sean atrados a su
interior y choquen con la cara interna, produciendo la emisin de un cierto nmero de electrones. El
final del tubo del detector se sita a un potencial cercano a tierra, con lo que existir un gradiente
continuo de potencial desde la boca al fondo del detector. Debido a esto, los electrones arrancados en el
impacto inicial del ion volarn en la direccin de los potenciales menos negativos, hacia potencial cero,
producindose una gran cantidad de impactos en el camino, en cada uno de los cuales se multiplicar el
nmero de electrones, con lo que se puede conseguir un efecto multiplicador del orden de 10
8
. A1 final
del recorrido del tubo multiplicador se encuentran un cono colector con la electrnica de
preamplificacin y amplificacin asociada. Si se desean detectar iones negativos, en principio basta con
cambiar el signo de los potenciales aplicados a la placa repulsora y a la boca del channeltron. Por tanto,
este detector es susceptible de ser empleado tanto para detectar iones positivos como negativos. El
hecho de situar el detector fuera del "eje ptico" del espectrmetro, produce una ventaja importante,
adems de permitir la deteccin selectiva de iones positivos o negativos, como es la de evitar que
alcancen el detector partculas o radiaciones no deseadas, tales como fragmentos neutros o fotones
procedentes del filamento de la fuente, que podran incrementar el ruido de fondo y originar seales
parsitas. Otra ventaja de los "Channeltron" es que pueden exponerse a presin atmosfrica sin ningn
problema, siempre que el alto voltaje haya sido desconectado, lo que permite romper vaco en el
sistema sin complicaciones. Requieren un vaco mnimo de trabajo del orden de 5 x 10
-5
[torr], lo que no
debe ser problema en espectroscopia de masas donde es habitual trabajar con vacos mejores que 10
-6
[torr] en el analizador. La vida de un detector "Channeltron", aunque superior a la de los multiplicadores
de dinodos discretos, es tambin limitada y depende de la carga total acumulada, es decir, del voltaje
aplicado y del nmero de iones detectados. A medida que la superficie interior se va agotando, se va
haciendo necesario incrementar el alto voltaje aplicado para conseguir una seal adecuada. Cuando
este fenmeno se acelera, es sntoma evidente de que el final de la vida til del detector se acerca.
Figura 7-3: Channeltron.
7.4.Detector de conversin fotnica (Detector "Daly" o de
centelleo)
Primero veremos una breve descripcin de los elementos particulares que esta clase de
detectores utiliza.
7.4.1.Detectores de centelleo y termoluminiscencia
Los detectores de centelleo y de termoluminiscencia (tld) son dos tipos de detectores que, si bien
tienen un modo de funcionamiento y unas aplicaciones diferentes, poseen un principio bsico de
deteccin semejante. Existen unas sustancias cristalinas denominadas luminiscentes, a las que la
radiacin ionizante provoca unos defectos reversibles en la red cristalina. Se provoca por tanto un
estado de mayor energa y, al volver espontneamente a la conguracin de equilibrio, se emiten
fotones en el rango de la luz visible. En las sustancias utilizadas en detectores de centelleo, por ejemplo
sulfuro de cinc dopado con plata ZnS(Ag) o yoduro de sodio dopado con talio NaI(Tl) la vuelta al
equilibrio de la red cristalina es casi instantnea, lo que los hace tiles para deteccin y medida de la
radiacin. En las sustancias utilizadas en los dosmetros de termoluminiscencia, como el uoruro de litio,
la vuelta al equilibrio es un proceso extremadamente lento a temperatura ambiente, lo que hace que a
efectos prcticos la red no presente efectos de reparacin en perodos del orden del mes. Sin embargo,
frente a un calentamiento del material hasta temperaturas de 300C, el material vuelve rpidamente al
equilibrio, emitiendo sbitamente todos los fotones correspondientes al cambio de la estructura
cristalina. Esta propiedad lo hace muy til como dosmetro, i.e., como sistema capaz de medir la dosis
acumulada durante un perodo de tiempo y revelarla en un nico proceso de lectura que, adems,
produce la recuperacin del material para un nuevo uso. Durante el proceso de medida se produce una
cantidad reducida de fotones, ya sea durante el proceso de irradiacin en los detectores de centelleo o
en el calentamiento para el caso de tld. Es pues necesario recogerlos en un sistema amplicador
denominado fotomultiplicador. La recogida debe realizar en un ambiente de oscuridad total para no
enmascarar las medidas. En el fotomultiplicador los fotones son convertidos a una seal elctrica
mediante un fotoctodo, material metlico compuesto usualmente por aleaciones de cesio-plata o
semiconductores, con un potencial de ionizacin muy bajo, de modo que los fotones sean capaces de
arrancar electrones de la red cristalina. Los electrones provenientes del fotoctodo son acelerados en
etapas sucesivas contra electrodos intermedios llamados dinodos, buscando un efecto multiplicativo
al arrancar ms electrones de stos. En el ltimo electrodo, el nodo, se recoge una carga elctrica
proporcional a la inicialmente generada en el fotoctodo, pero amplicada por un factor del orden del
milln.
7.4.2.Descripcin de los detectores Daly
Este detector es uno de los ms eficientes, sensibles y de ms larga vida disponibles para
deteccin puntual. Los iones procedentes del tubo de vuelo del espectrmetro de masas son desviados
de su trayectoria mediante un potencial elctrico. El voltaje aplicado es de signo contrario a la carga de
los iones que se quieran detectar, para provocar su atraccin y choque sobre el dinodo inicial. Este
choque produce mltiples electrones que son atrados, a su vez, por un voltaje ms positivo que el del
dinodo, y aplicado sobre una pantalla fosforescente.
Figura 7-4: Esquema del detector Daly.
A1 recibir el impacto de los electrones, la pantalla de centelleo emite un gran nmero de fotones,
los cuales se dirigen a un fotomultiplicador convencional sellado a vaco, producindose la consiguiente
cascada de electrones que multiplica la seal. La seal es detectada al final de su recorrido por el
interior del tubo fotomultiplicador, siendo posteriormente de nuevo amplificada, digitalizada y elaborada
mediante circuitos electrnicos, para su manipulacin por el sistema de tratamiento de datos del
espectrmetro de masas. Una ventaja de este detector sobre los clsicos "Channeltron", aparte de su
mayor sensibilidad y estabilidad, es su extraordinaria duracin, ya que el elemento que envejece
principalmente es el fotomultiplicador, que sufre en todo caso menos deterioro, pues recibe el impacto
de fotones y electrones que causan menor dao que el impacto directo de los iones. Adems, la
sustitucin del multiplicador no es nada costosa, ya que se trata de un componente normal, disponible
en el mercado a bajo precio.
7.5.Detectores multicanal o microcanal
Existen varios tipos de detectores que pueden incluirse en esta denominacin de multicanales.
Se basan en un arreglo de capilares de vidrio huecos (de 10-25mm de dimetro), recubiertos
internamente de un material semiconductor, emisor de electrones, formando microcanales.
Manteniendo estos microcanales a un alto voltaje se obtiene la expulsin de electrones al golpear el
material con iones, esto causa una avalancha, creando electrones secundarios con una ganancia de
entre 10
3
-10
4
(Figura 7-5). Cada microcanal acta como multiplicador de electrones independiente y el
conjunto se conecta elctricamente en paralelo. Estos detectores son tiles en seales de baja
intensidad. Luego de una o dos capas de bateras de micromultiplicadores, se coloca un sistema de
deteccin mas o menos sofisticado y eficiente, encargado de detectar simultneamente todas las
seales. Este tipo de detectores renen la ventaja de los antiguos sistemas de fotoplacas, de ser
capaces de detectar simultneamente una amplia zona espectral, lo que aumenta enormemente el
tiempo de observacin de cada ion. Ello conduce a una sensibilidad aumentada en muchos rdenes de
magnitud. Los detectores de placas de microcanales pueden detectar tanto seales pequeas como
grandes con mnimos niveles de saturacin y su tiempo de respuesta para la generacin de voltajes de
salida es muy corto en comparacin con otros tipos de detectores. Existen distintas denominaciones de
este tipo de detectores tales como: Multiple Channel Detector, Multiplier Array Detector, Microchannel
Multipliers, Multichannel Photo Diode Array, ect.
Figura 7-5: Principio de funcionamiento del detector de microcanales.
Los microcanales pueden tambin emitir electrones a travs de pantallas fosforescentes. Un
detector de arreglo de fotodiodo es usado para convertir los fotones liberados en seales elctricas.
(Vase la figura 7-6).
Figura 7-6: Detector de arreglo de fotodiodo.
7.6.Sintona y calibracin de los espectrmetros de masas
Con el fin de disponer de picos de masas conocidas se utilizan sustancias de referencia, de
espectro bastante complejo pero muy bien conocido, para realizar la calibracin de la escala de masas
del espectrmetro. Lo que se hace es ajustar las distintas lentes y rendijas de la fuente para conseguir
los valores ptimos de los iones fragmento del compuesto de referencia de los cuales se conoce su
masa exacta as como las abundancias relativas de cada uno. A este proceso se le denomina TUNE
(sintona). Las sustancias de referencia ms utilizadas son heptacosa (perfluorterbutilamina) para la
calibracin de las masas en equipos de baja resolucin y el PFK (perfluorkeroseno) para los de alta.
8.Espectros moleculares
Los espectros de masas obtenidos por ionizacin API o MALDI-TOF son totalmente diferentes a los
conseguidos por otras tcnicas de ionizacin, y consiste en una serie de seales discretas a lo largo de
todo el dominio espectral, que corresponden, cada una de ellas, a una molcula intacta cargada con
diferente nmero de cargas, y con un cierto nmero de protones aadidos. A modo de ejemplo en la
figura 8-1, se muestra el espectro de masas del poliestireno.
Figura 8-1: Espectro de masas del poliestireno 7,600 obtenido por MALDI-TOF.
Los siguientes son otros espectros de masas de diferentes materiales, tambin obtenidos por
espectrometra MALDI o MALDI-TOF:
Figura 8-2: Espectro de un peptido usando ionizacin positiva MALDI y cido alpha-cyano-4-hydroxycinnamic como matrz.
Figura 8-3: Espectro de MALDI-TOF de los oligosacridos liberados por hidrlisis parcial de un polisacrido del liquen L.
pustulata[10]. Recordemos que el eje vertical es abundancia relativa y el horizontal es valor de la relacin m/z.
Figura 8-4: Espectro MALDI-TOF del poliestireno.
Figura 8-5: Espectro MALDI-TOF del Poly(Propylene Glycol).
9.Introduccin a la Espectroscopa Infrarroja
9.1.La Espectroscopa
La espectroscopia es una rama de la Ciencia Fsico-Qumica que se ocupa del estudio de los
"espectros" para conocer la forma de obtenerlos, la forma de medirlos y la aplicacin al anlisis qumico.
El espectro se define como una representacin grfica o fotogrfica de la distribucin de intensidades
de la radiacin electromagntica emitida o absorbida por la materia, en funcin de la longitud de onda
de dicha radiacin. Los espectros son debidos a transiciones entre estados de energa caractersticos de
la materia. Los espectros pueden ser de emisin, que se obtienen excitando adecuadamente la materia
para que emita radiacin electromagntica y de absorcin, obtenidos sometiendo a la materia a una
radiacin electromagntica continua y representando la proporcin de radiacin absorbida por la misma
en funcin de la frecuencia o longitud de onda.
9.2.Espectrometra infrarroja
La principal utilizacin de la espectrometra infrarroja ha sido la identificacin de compuestos
orgnicos, ya que los espectros correspondientes suelen ser complejos y contienen numerosos mximos
y mnimos que pueden servir para realizar comparaciones. Con excepcin de los ismeros pticos, no
existen tericamente dos compuestos que absorban exactamente en la misma forma. Igualmente, la
espectroscopa infrarroja se emplea cada vez ms en el anlisis cuantitativo. En este caso, su enorme
ventaja reside en la gran selectividad, lo que posibilita a veces cuantificar una sustancia en una mezcla
compleja sin realizar mucho trabajo previo de separacin. Para absorber radiacin infrarroja, una
molcula debe experimentar un cambio neto en el momento dipolar como consecuencia de su
movimiento vibratorio y rotatorio. Slo en estas circunstancias puede interaccionar con la molcula el
campo elctrico alternante de la radiacin y causar cambios en su movimiento. Si la frecuencia de la
radiacin iguala a la frecuencia de una vibracin natural de la molcula, ocurre una transferencia neta
de energa que da por resultado un cambio en la amplitud de la vibracin molecular; la consecuencia es
la absorcin de la radiacin. Anlogamente, la rotacin de molculas asimtricas alrededor de sus
centros de masa produce una fluctuacin dipolar peridica; nuevamente, es posible la interaccin con la
radiacin. La energa requerida para causar un cambio en el nivel rotatorio es muy pequea. Los niveles
de energa vibratoria estn igualmente cuantizadas y las diferencias de energa entre estados cunticos
corresponden a las regiones fcilmente accesibles del infrarrojo de 13000 a 675 cm-1.
Figura 9-1: Zonas espectrales. Origen de la radiacin electromagntica. Tcnicas instrumentales
El espectro infrarrojo de un gas consiste por lo general en una serie de lneas muy prximas entre
s debido a que existen varios estados energticos rotatorios para cada estado vibratorio. Por otra parte
en el estado lquido y slido la rotacin esta muy restringida, y desaparecen las lneas rotacionales
discretas, dejando slo picos vibracionales algo ensanchados. Una molcula puede ser modelada como
un sistema de osciladores acoplados, descritos aproximadamente por un movimiento armnico
cuntico, en consecuencia por compleja que sea una molcula su modelo vibracional es una
combinacin de sus modos normales de vibracin. En la figura 9-1 se muestran las regiones del
espectro que se emplean con fines analticos, los nombres de las tcnicas espectroscpicas y las
transiciones moleculares o atmicas a las que se debe la absorcin o emisin de radiacin en cada
regin.
9.3.Sobre las vibraciones moleculares
En molculas sencillas es posible definir el tipo de vibraciones que tienen lugar entre los distintos
tomos enlazados e identificar la radiacin electromagntica que es absorbida para modificar su estado
vibracional. En molculas complejas esta posibilidad es ms difcil tanto por el elevado nmero de
vibraciones como por las interacciones entre los distintos centros vibracionales que se producen. Hay
dos clases de vibraciones bsicas o fundamentales, de tensin o alargamiento y de deformacin o
flexin, (figura 9-2). Las vibraciones de tensin producen un cambio continuo de la distancia entre los
tomos sin abandonar el eje de enlace. Las vibraciones de deformacin o flexin se caracterizan por un
cambio en el ngulo de dos enlaces y se clasifican en cuatro tipos, de tijera, de oscilacin en el plano o
balanceo, de sacudida fuera del plano o cabeceo y de torsin fuera del plano o trenzado. En la
molculas de ms de tres tomos, adems de las vibraciones descritas, puede producirse interacciones
o acoplamientos que dan lugar a cambios en las caractersticas de las vibraciones.
Figura 9-2: Tipos de vibraciones moleculares. + indica movimiento desde el plano de la pgina hacia el lector;
- indica movimiento desde el plano de la pgina alejndose del lector.
9.4.Modelos vibracionales
Las caractersticas de una vibracin atmica de tensin en una molcula biatmica son, en principio,
similares a un modelo mecnico consistente en dos masas unidas por un muelle, (oscilador armnico).
Para iniciar el desarrollo se considera la vibracin de una masa unida a un resorte que cuelga de un
objeto inmvil, la energa potencial para un desplazamiento de la masa sobre su posicin de equilibrio
es, La curva de energa potencial para una oscilacin armnica simple, obtenida a partir de la ecuacin
anterior, es una parbola, figura 9-3. En la posicin de equilibrio, d=0, la energa potencial es nula y
alcanza el valor mximo cuando el resorte est extendido o comprimido a mxima amplitud.
E
potencial
=
(
1
2
)
k d
2
Donde :
k :cte de fuerza
d : distancia recorrida por la masa
Figura 9-3: Curva de energa potencial en un oscilador armnico.
La frecuencia de esta vibracin, en ciclos por segundo, tiene la expresin,
v =
1
2 .
k
m
Donde :
k :cte de fuerza
m: masa del objeto
Esta expresin de la frecuencia de vibracin se puede aplicar a un oscilador armnico, formado por dos
bolas de masas m1, m2; y a dos tomos unidos por un enlace y en movimiento vibratorio,
v =
1
2
.
k
m
1
m
2
m
1
+m
2
Donde :
m
1
y m
2
: masa delas bolas o delos tomos
: masareducida=(m
1
m
2
/ m
1
+m
2
)
k :constante de fuerza del muelle odel enlace qumico
Sin embargo, el movimiento vibratorio de dos tomos unidos por un enlace qumico difiere del sistema
de dos masas unidas por un muelle, debido a que la energa vibracional de los tomos en una molcula
est cuantificada, figura 9-4, y solamente son permitidos ciertos niveles energticos, segn la siguiente
expresin,
v =
(
1
2
+V
)
hv =
(
1
2
+V
)
h
2 .
k
Donde :
V : es el n cunticovibracional , toma valores de( 0,1, 2, 3, etc)
h: es la cte. Planck ,(h=6,625210
-27
erg seg)
v : frecuencia devibracin de enlace
: masareducida
La transicin entre dos niveles energticos vibracionales consecutivos corresponde a un Evib,
A E
vid
=
h
2 .
k
La absorcin de radiacin con energa igual a esta diferencia da lugar a la transicin vibracional que
queda reflejada en el espectro. Las radiaciones electromagnticas con esta energa se encuentra en la
regin infrarroja del espectro electromagntico. La cuantificacin de la energa vibracional en un
sistema molecular, no es la nica diferencia existente entre 2 tomos unidos por un enlace (vibraciones
moleculares) y un oscilador armnico definido por dos masas unidas por un muelle (mecnica clsica).
Cuando 2 tomos se acercan entre s, en el movimiento vibratorio, se produce una repulsin entre los
dos ncleos con una fuerza que acta en la misma direccin que la fuerza restauradora del enlace. Este
efecto hace que en el extremo en el que los tomos se acercan, la energa potencial se eleve
rpidamente; mientras que en el extremo, en el que los tomos se alejan al mximo, se produce una
disminucin de la fuerza restauradora y por tanto de la energa potencial, figura 9-4. Las curvas de
energa potencial correspondientes a un oscilador armnico (dos masas unidas por un muelle) y un
oscilador no armnico (vibraciones moleculares) son muy parecidas, sobre todo a energas potenciales
bajas.
Figura 9-4: Curvas de energa potencial en un oscilador armnico (1) y oscilador no armnico (2).
La transicin desde el nivel v=0 al primer estado excitado v=1 absorbe intensamente la radiacin
electromagntica exterior dando lugar a bandas espectrales fundamentales. La absorcin de luz entre
niveles separados por dos o ms unidades, v=2 3, origina bandas dbiles, conocidas como
sobretonos, a frecuencias dos o tres veces mayores que la frecuencia de la vibracin fundamental.
10.El espetrmetro infrarrojo
10.1.Funcionamiento y descripcin
Con el fin de hacer medidas en una muestra, se transmite un rayo monocromo de luz infrarroja a
travs de la muestra, y se registra la cantidad de energa absorbida. Repetiendo esta operacin en un
rango de longitudes de onda de inters (por lo general, 4000-400 cm
-1
) se puede construir un grfico. Al
examinar el grfico de una sustancia, un usuario experimentado puede obtener informacin sobre la
misma. Esta tcnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes, y se usa mucho en qumica,
en especial en qumica orgnica. Se pueden generar grficos bien resueltos con muestras de una sola
sustancia de gran pureza. Sin embargo, la tcnica se utiliza habitualmente para la identificacin de
mezclas complejas. La zona de radiacin infrarroja del espectro electromagntico est limitada por las
regiones del espectro visible y del microondas. Como se muestra en la tabla 9.1, se distinguen tres
zonas, siendo la del infrarrojo medio la que hasta el momento actual tiene mayor aplicacin analtica.
DENOMINACION INTERVALO (cm
-1
) INTERVALO (m)
INFRARROJO PROXIMO 12500-4000 0,8-2,5
INFRARROJO MEDIO 4000-660 2,5-15,15
INFRARROJO LEJANO 660-50 15,15-200
Tabla 10-1: Zonas espectrales infrarrojas.
Dos son los tipos de espectrofotmetros ms utilizados, dispersivos de red, y con transformada de
Fourier. Como se ver a continuacin, existen claras diferencias entre los dos equipos; los
espectrofotmetros con transformada de Fourier es un equipo ms moderno que el espectrofotmetro
dispersivo y presenta una serie de ventajas como las que se citan seguidamente:

Los espectros se obtienen con gran rapidez, porque se miden simultneamente la energa
absorbida por la molcula a todas las longitudes de onda, en la zona espectral del infrarrojo
medio.
Esta rapidez permite hacer mltiples barridos espectrales para una misma muestra y calcular,
posteriormente, la media de todos ellos; con lo que se mejora la relacin (seal/ruido).
La identificacin de la longitud de onda que incide sobre la muestra es mucho ms exacta,
porque se utiliza un lser para el calibrado de la misma.
El equipo tiene menos elementos a travs de los cuales pasa la radiacin electromagntica, por
lo que la prdida de intensidad de la radiacin en su recorrido hacia la muestra es menor. Esto
permite poder detectar absorciones de energa ms dbiles.
Espectrofotmetros dispersivo: La figura 10-1 muestra un esquema de un espectrofotmetro
convencional de doble haz, cuyo funcionamiento se indica a continuacin:
La radiacin procedente de la fuente se divide en dos haces; uno se dirige a la clula muestra, y
el otro a la clula referencia (vaca o con disolvente).
El haz de referencia pasa por un atenuador y se dirige al divisor peridico.
El divisor peridico es un disco impulsado por un motor que deja pasar alternativamente el haz
de muestra y el de referencia.
Se produce la dispersin de la radiacin por el prisma (monocromador).
Los haces llegan alternativamente al detector y dan lugar a una seal elctrica.
La seal se amplifica y pasa al rectificador sincrnico, aparato que est acoplado mecnica o
elctricamente al divisor peridico de forma que el interruptor del rectificador y el haz que
abandona el divisor peridico cambien simultneamente.
Si los dos haces son idnticos en potencia, la seal del rectificador es una corriente continua; si
los haces difieren en potencia se produce una corriente fluctuante o alterna cuya polaridad viene
dada por el haz que sea ms intenso.
La seal del rectificador es filtrada, modulada y amplificada para impulsar el motor sincrnico en
una direccin u otra segn la polaridad de la seal. El motor sincrnico est conectado al
atenuador y a la pluma del registro, y hace que ambos se muevan hasta alcanzar la anulacin.
El atenuador del haz es el mecanismo por el cual la potencia del haz de referencia se reduce
para igualarse a la del haz que pasa por la muestra. El mecanismo consiste en un peine de
dientes finos que se estrecha hacia las puntas. Este peine se opone a la radiacin eliminando una
fraccin del haz de la misma. El peine se pone en movimiento cuando el detector percibe una
diferencia de potencial entre la muestra y referencia.
Otro motor sincrnico impulsa el papel y vara la longitud de onda.
Figura 10-1: Diagrama de un espectrofotmetro dispersivo de doble haz. Lnea oscura gruesa indica enlace mecnico; lnea
delgada enlace elctrico; lnea de trazos trayectoria de la radiacin.
Espectrofotmetro con transformada de Fourier: En la figura 10-2 se muestra un esquema ptico
de un espectrofotmetro basado en la transformada de Fourier. En l se observa que el rayo infrarrojo es
generado en la fuente A y, posteriormente, colimado y dirigido hacia el interfermetro C por medio de
un espejo fijo toroidal B.
El rayo del lser de Helio-Nen sigue a la radiacin infrarroja a travs del interfermetro con
objeto de determinar el desplazamiento del espejo mvil y para conocer la longitud de onda a la
que se produce la absorcin de radiacin.
A la izquierda del compartimento de la muestra se encuentra un espejo toroidal ajustable D que
conduce el rayo procedente del interfermetro a la muestra. Desde el compartimento de la
muestra el rayo llega, a travs de una rendija, a un detector trmicamente estable de tantalato
de litio.
El interfermetro, que sustituye al tradicional monocromador, es la parte esencial de este
aparato, pues es el encargado de modular cada frecuencia del infrarrojo con el fin de realizar la
transformada de Fourier.
Figura 10-2: Diagrama de un espectrofotmetro por transformada de Fourier.
El esquema de un interfermetro se muestra en la figura 10-3 y consta de un divisor de haz B
que refleja la radiacin infrarroja hacia un espejo fijo C y hacia otro mvil D. Los dos haces reflejados se
recombinan de nuevo en el divisor de haz, interfiriendo constructiva o destructivamente segn cual sea
el valor de la diferencia de camino ptico entre el divisor y cada uno de los espejos. Por ejemplo, para
un desfase =0, , 2,... los dos rayos interfieren constructivamente y si =/2, 3/2, 5/2,...
destructivamente; as, si se va cambiando el valor del desfase suavemente desde cero; se detecta una
seal de intensidad modulada como una funcin cosenoidal. La seal de salida del interfermetro se
denomina interferograma que es la suma de todas las ondas cosenoidales moduladas.
Figura 10-3: Esquema del interfermetro.
Los componentes bsicos de que consta un espectrofotmetro de IR, que permite medir la
absorcin de radiacin infrarroja por parte de las molculas, son la fuente de radiacin, el sistema ptico
de dispersin (monocromador), el sistema de deteccin, el registrador del espectro y las cubetas
portamuestras. En las subsecciones siguientes se hace una breve descripcin de estos elementos
concluyendo con el funcionamiento del espectrofotmetro.
10.2.Fuente de radiacin
La fuente de radiacin es un slido inerte calentado elctricamente a temperatura comprendida
entre 1.500 y 2.000 K. Se produce una radiacin continua que se aproxima a la de un cuerpo negro. El
cuerpo ideal capaz de emitir el mximo de intensidad de radiacin para una temperatura y longitud de
onda determinada, recibe el nombre de cuerpo negro; se destacan las siguientes:
Emisor incandescente de Nernst, es un cilindro de un dimetro 1 a 2 mm y 20 mm de longitud,
construido de xido de zirconio y pequeas cantidades de xidos de ytrio y torio. En los extremos
del cilindro se alojan las resistencias de platino para el paso de la corriente elctrica; lo que
permite alcanzar temperaturas de 2.200 K, y una emisin de un 60 % con respecto al cuerpo
negro. La mxima intensidad de radiacin se produce entre 1 y 10 m (10.000-1.000 cm
-1)
.
Fuente Globar, es una barra de carburo de silicio de 5 cm de longitud y 0,5 cm de dimetro. Se
calienta elctricamente hasta temperaturas de 1.500 K. Tiene una radiacin estable entre 1 y 40
m (10.000-250 cm
-1
) con una emisin del 75% respecto al cuerpo negro. Es semejante al emisor
de Nerst excepto en la regin inferior a 2.000 cm
-1
donde el Globar tiene mejor rendimiento.
Fuente de filamento incandescente, es una espiral de alambre de nquel-cromo calentado por el
paso de la corriente elctrica hasta una temperatura de 1.900 K. Produce menor intensidad que
los anteriores pero tiene una vida ms larga.
El lser sintonizable de dixido de carbono es una fuente infrarroja para monitorear algunos
contaminantes atmosfricos y para determinar las especies de absorcin en soluciones acuosas.
10.3.Sistema ptico de dispersin

Tiene por objeto seleccionar haces estrechos de radiacin de pequeos intervalos de frecuencias
y hacerlos incidir sobre el detector una vez que han pasado por la muestra. Como agentes dispersantes
de la radiacin se emplean prismas y redes de difraccin. Los primeros han de ser construidos de un
material transparente a la radiacin infrarroja, considerndose desechable cuando la absorcin es
superior al 50 %. Los materiales ms usados son el cuarzo fundido, solo aplicable a radiaciones del IR
cercano, el cloruro sdico cristalizado cuando la radiacin corresponde al IR normal (2.000-660 cm
-1
)
ampliable hasta 4.000 cm
-1
; el bromuro potsico y el bromuro de cesio se emplean en el IR lejano. Las
sales metlicas, de las cuales se construyen estos materiales, son higroscpicas por lo que es necesario
mantener una atmsfera ausente de humedad. Las redes de difraccin, como sistema ptico
dispersante de la radiacin, pueden ser construidas de material estable como vidrio o plstico,
recubierto de aluminio. Ofrecen un mayor poder de resolucin.
10.4.Sistemas de deteccin
Las radiaciones infrarrojas no se pueden medir con detectores elctricos, similares a los
utilizados para detectar radiaciones UV-Vis., debido a la insuficiente energa del fotn correspondiente.
En los espectrofotmetros de dispersin los detectores son trmicos y trmicos piroelctricos; en
espectrofotmetros con transformada de Fourier los detectores pueden ser piroelctricos o
fotoconductores. En los detectores trmicos, la respuesta se produce por el efecto de calentamiento que
sufre un cuerpo negro al incidir sobre l la radiacin IR. El elemento sensible del detector ha de ser lo
ms reducido posible y tener una capacidad calorfica pequea con el fin de que la diferencia de
temperatura que se produzca sea lo mayor posible (del orden de 10-6 C). Asimismo, han de estar
aislados de la radiacin trmica que puedan emitir otros objetos prximos, dentro del equipo. A
continuacin se describen algunos detectores cuyo uso esta restringido a espectrofotmetros clsicos o
dispersivos.
Bolmetro, es un tipo de termmetro de resistencia construido de platino o nquel, denominado
tambin, termistor. Estos materiales presentan cambios relativamente grandes en la resistencia
al paso de la corriente elctrica en funcin de la temperatura. Consiste en una cinta de platino o
nquel, como elemento sensible, pintado de negro y montado sobre un puente de Wheatstone
por el que pasa la corriente elctrica; al incidir la radiacin cambia la resistencia y vara la
diferencia de potencial; el puente se desequilibra y la corriente que pasa por el galvanmetro es
proporcional a la intensidad de la radiacin.
Detector de Golay, es un termmetro de gas que contiene xenn en una pequea cmara
cilndrica con una membrana negra. En un extremo del cilindro hay una ventana transparente al
infrarrojo y en el otro un diafragma flexible que est plateado por la parte exterior. En la
superficie plateada se refleja un haz de luz hacia el ctodo de un fototubo. Al incidir la radiacin
de infrarrojos la membrana negra, que hay en el interior del cilindro, se calienta y calienta al
xenn; el resultado es un aumento de presin en el cilindro que hace variar la posicin del
diafragma plateado. Esto modifica la fraccin de radiacin que incide en el ctodo del fototubo y
la deteccin del mismo.
Termopares, consisten en uniones termoelctricas de dos piezas metlicas diferentes (platino-
paladio, antimonio-bismuto, etc.). Entre las dos uniones se produce un potencial que vara con la
diferencia de temperatura, entre dichas uniones, al encontrarse dentro de un circuito elctrico.
Una de las uniones (soldadura fra) se apantalla cuidadosamente y se mantiene a temperatura
constante, exponindose la soldadura caliente a la radiacin infrarroja con lo que aumenta su
temperatura. La diferencia de potencial entre los extremos depende de la diferencia de
temperatura entre las soldaduras y por tanto de la cantidad de radiacin IR que incide sobre la
soldadura caliente. El termopar es capaz de responder a diferencias de temperatura de 10-6 C.
Detectores piroelctricos, se construyen con lminas cristalinas de materiales piroelctricos,
como sulfato de triglicina. Situado el cristal piroelctrico entre dos electrodos se produce una
capacitancia que es sensible a la temperatura. Por tanto, al incidir la radiacin infrarroja el cristal
polieltrico se calienta y se modifica la distribucin de cargas a travs del cristal, que provoca
una corriente en un circuito elctrico externo. La intensidad de la corriente depende, entre otras
cosas, de la velocidad de cambio de polarizacin con la temperatura. Una caracterstica de este
detector es que tiene respuestas muy rpidas; lo que permite medir las seales procedentes de
un interfermetro instalados en equipos con transformada de Fourier.
Detectores fotoconductores, son detectores de telururo de cadmio y mercurio y tienen una
respuesta ms rpida que los detectores polielctricos; por lo que tienen una amplia aplicacin
en espectrofotmetros con trasformada de Fourier. Consisten en una delgada pelcula de un
material semiconductor colocada sobre una superficie de vidrio y sellada en una cmara al vaco.
La absorcin de radiacin infrarroja hace que electrones de valencia no conductores pasen a ser
conductores, disminuyendo la resistencia elctrica del semiconductor. Se colocan en serie un
fotoconductor, una fuente de voltaje y una resistencia; el descenso de voltaje en la resistencia
est relacionada con la intensidad de la radiacin electromagntica.
10.5.Preparacin de las muestras. Cubetas portamuestras
En espectroscopia infrarroja no existen buenos disolventes que sean transparentes a todas las
radiaciones espectrales, lo que entraa una dificultad para determinar con exactitud la absorbancia de
radiacin por parte de las molculas. Se pueden analizar compuestos en estado slido, lquido y
gaseoso; el recipiente de la muestra ser distinto segn se presente la misma y ha de estar construido
de un material transparente a la radiacin.
Figura 10-4 y 5: Recipientes de las muestras a analizar (cuvettes). Gases Izq. Lquidos Der.
Muestras de Gas: El espectro de gas puede obtenerse al permitir que la muestra se expanda en
una celda, tambin llamada cuvette.
Soluciones: Las celdas de solucin infrarroja constan de dos ventanas selladas y separadas por
dos juntas delgadas de Tefln, cobre o plomo previamente humedecidas con mercurio. Las
ventanas comnmente estn hechas de cloruro de sodio, cloruro de potasio o bromuro de cesio.
Las muestras que son lquidas a temperatura ambiente son generalmente analizadas en forma
pura o en solucin. Los solventes ms comunes son tetracloruro de carbono (CCl4) y disulfuro de
carbono (CS2). Cloroformo, cloruro de metileno, acetonitrilo y acetona son solventes comunes
para materiales polares.
Slidos: Polvos o slidos reducidos a partculas pequeas pueden examinarse como una pasta
delgada o mullita. La mullita se forma triturando algunos miligramos de la muestra en presencia
de una o dos gotas de aceite de hidrocarburo. La mullita resultante se examina luego entre dos
placas de sal. Se coloca una ventana del mismo grosor en la trayectoria del haz. Otra tcnica
para slidos es triturar un miligramo o menos de la muestra con alrededor de 100 miligramos de
bromuro de potasio. La mezcla luego se presiona en una molde para crear un disco transparente.
Se coloca un disco de bromuro de potasio puro en el trayecto del haz correspondiente.
11.Aplicaciones analticas del espetrmetro infrarrojo
La espectroscopia infrarroja tiene aplicaciones en anlisis cualitativo y cuantitativo. Su principal
utilizacin ha sido en la identificacin de compuestos orgnicos, debido a que no existen, tericamente,
dos compuestos que absorban exactamente en las mismas frecuencias.La espectroscopia de IR est
ms centrada en el estudio de compuestos orgnicos. Si no se aplica a los compuestos inorgnicos se
debe a que la mayora de las vibraciones de estos compuestos estn por debajo de la frecuencia de
400 cm
-1
. A continuacin se mostrarn diagramas obtenidos con espectrmetros infrarrojos.
Figura 11-1: Espectro infrarrojo de una muestra de pintura. Material identificado como goma laca.
Figura 11-2: Espectro del CO2.
Figura 11-3: Espectro infrarrojo de compuesto qumico
Figura 11-4: Espectro de cido carboxlico.
Figura 11-5: Dominio de tiempo versus dominio de frecuencia: la transformada de Fourier (FT-IR).
12.Bibliografa y Agradecimientos
12.1.Bibliografa
1. An Introduction to Mass Spectrometry. Dr Alison E. Ashcroft, Mass Spectrometry Facility Manager,
Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Astbury Building, The University of Leeds.
2. http://es.wikipedia.org
3. MAESTRA EN CIENCIAS BIOQUMICAS - CURSO DE MTODOS - ESPECTROMETRA DE MASAS de
GERMN PLASCENCIA VILLA. Instituto de Biotecnologa UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE
MXICO.
4. IDENTIFICACIN DE COMPUESTOS VOLTILES POR CG-MS. M.C. Gutirrez, M. Droguet.
5. CROMATOGRAFIA PRINCIPIOS Y APLICACIONES. Rafael Gmez - Ullate Ricn - Alonso Serrano lvarez.
6. www.monografias.com - Sntesis de pptidos.
7. http://macromoleculas.unq.edu.ar/Unidades/Qu%EDmica_prote%EDnas_A_2U1.doc
8. Fundamentos de Ingeniera Nuclear. Miguel Moro Vallina.
9. http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/MassSpec/mspec.htm#ms2
10. http://www.cib.csic.es/es/index.php (Centro de investigaciones biolgicas)
11. http://www.espectrometria.com/
12.2.Agradecimientos
Al Altsimo Dios, Creador del cielo y de la tierra, fuente de toda
razn y justicia, y mi inspiracin. A mi profe de Fibra pticas para las
comunicaciones, Nestor H. Mata, por su gran paciencia y por su direccin
para la realizacin de este informe ... y por aprobarme. A Diego y Patri,
esos amigos y crticos, que en este y en mis otros informes han aportado
esa muy necesaria realimentacin, tomando tiempo para leerlos y corregir
mis incontables errores; agradezco a Dios el haberlos puesto en mi camino
para ayudarme a ser cada da mejor. A todos muchas pero muchas
GRACIAS!!!
Dios les re bendiga!!!

FINAL Informe Fibras 2009-05-04

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