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Desarrollo y Optimización de un procedimiento para la

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Comisión Nacional de Cultura Física y Deporte Laboratorio Nacional de Prevención y Control del Dopaje

Desarrollo y Optimización de un procedimiento para la cuantificación de tetrahidrocannabinol (THC) en muestras de orina por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM).
Almaraz Sibaja Ana Patricia

Delta-9- Tetrahidrocannabinol

El THC se metaboliza principalmente en el hígado por reacciones de hidroxilación y oxidación microsomal . . es un narcótico del grupo de los cannabinoides. siendo sus principales metabolitos.• • El ∆9-Tetrahidrocannabinol. THC). que a su vez puede metabolizarse a 11-nor-9-carboxy-THC (THC-COOH) que puede presentarse en forma libre o como glucurónido. el 11-OH-THC. (∆-9-THC.

se declara que el deportista presente un resultado adverso a este compuesto. • La AMA a través de una lista de sustancias y métodos prohibidos en el deporte. ha establecido que si una muestra de orina contiene THC o su metabolito THC-COOH en concentración superior a 15 ng/mL.Dopaje por THC: • La Agencia Mundial Antidopaje (AMA) incluyó el THC en el subgrupo“S8. pueden mejorar la oxigenación y la recuperación por lo que su consumo ha sido prohibido en todos los deportes. • El THC y en general los cannabinoides actúan como ansiolíticos en dosis pequeñas. Cannabinoides”. .

.• Optimizar una metodología por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para la determinación del THC y sus metabolitos en las muestras de orina.

• Realizar un manejo estadístico adecuado de los resultados para garantizar la confiabilidad de los mismos. evaluando diferentes valores de pH. • Optimizar el procedimiento de extracción de THC en orina humana. • Optimizar el procedimiento de extracción de THC en orina humana. • Evaluar la limpieza de la muestra a partir de extracción en fase sólida.• Comparar la eficiencia de hidrólisis del THC y sus metabolitos excretados en forma conjugada utilizando hidrólisis enzimática e hidrólisis alcalina. evaluando diferentes disolventes orgánicos en la extracción líquido-líquido. . utilizando cartuchos con fase C-8 y C-18. así como el efecto de la concentración de un electrolito fuerte en la muestra para lograr un efecto de “salting-out”.

Optimización del procedimiento de preparación de muestra para la determinación y cuantificación de THC en orina humana. .

3 mL de orina humana Adicionar Estándar Interno (EI) Hidrólisis Separar la fase orgánica Extracción líquido-líquido “Salting out” Evaporar el disolvente bajo corriente de N2 T<50°C Derivatizar los tubos con 50 µL de MSTFA:NH4I:Ditioeritritol análisis cromatográfico .

Extracción con terc-butilmetiléter Derivatizar Evaporar el disolvente Análisis instrumental (CG-EM) *Las pruebas se realizaron en 2 muestras de orina diferentes. por triplicado .

A de fosfatos S.A.A de fosfatos S.A de acetatos S.Análisis instrumental (CG-EM) pH 5: S.A de amonio/amoniáco Evaporar el disolvente S.A de fosfatos pH 9: pH 7: S.: Disolución amortiguadora .

500 mL 1 mL 2 mL .Se emplearon los siguientes volúmenes de una disolución de NaCl al 30% : 0 mL 0.250 mL 0.

La EFS se evaluó empleando dos columnas no polares: C8 C18 Ocupando como eluyente metanol .

Para evaluar éste parámetro se emplearon 3 diferentes disolventes orgánicos: Terc-butil metil éter Acetato de etilo Cloroformo .

éstas se obtuvieron mediante la siguiente ecuación: Arelativa= Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑛𝑜 Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 .NOTA: El parámetro evaluado para todos los experimentos fue el Área Relativa del ión más abundante (ión de cuantificación) del THC y sus metabolitos con respecto al ión más abundante del estándar interno.

HIDRÓLISIS .

EVALUACIÓN DE pH .

SALTING OUT .

EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (EFS) .

EXTRACCIÓN CON DIFERENTES DISOLVENTES ORGÁNICOS *TBME: terc-butilmetiléter **Acetato: acetato de etilo .

MEJORES CONDICIONES PARÁMETRO MEJORES CONDICIONES Hidrólisis KOH 10 M pH 5 Cantidad de NaCl al 30% 500 µL Disolvente Acetato de etilo .

.

Ión 374 THC-COOHd3 Ión 371 THC-COOH .

• Se procesaron las 2 muestras por triplicado con las mejores condiciones obtenidas y se cuantificó la concentración de THCCOOH mediante la curva de calibración con la siguiente fórmula: 𝐴𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 = 𝐹𝑟𝑟 ∗ 𝐶𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 De la pendiente de la curva obtenemos el Frr: Frr= 0.7056 Para cuantificar la concentración de THC-COOH: 𝑇𝐻𝐶 = 𝐴𝑟𝑒𝑙 𝐹𝑟𝑟 ∗ [EI] .

62 2 30.970 0.540 2.68 .650 8.número de muestra [THCCOOH](ng/mL) Desviación estándar %CV 1 15.259 1.

mostraron que la hidrolisis básica con KOH 10M presentó mayor eficiencia comparando las áreas relativas de cada muestra y cada tipo de hidrólisis. . obteniendo como resultado una extracción más cuantitativa. según los resultados obtenidos. • El fenómeno fisicoquímico de salting-out ayudó a mejorar la transferencia de los analítos de interés de la fase acuosa a la fase orgánica. • En cuanto a las pruebas de extracción a diferentes pH observamos que para el THC y sus metabolitos THC-COOH y 11-OH-THC. con la adición de 500 µL de la disolución de NaCl se obtuvo el mejor rendimiento de extracción para el THC-COOH.• Los resultados obtenidos mediante las pruebas de hidrólisis con la enzima β-glucuronidasa. la disolución amortiguadora de acetatos (pH=5) presentó un mejor rendimiento de extracción para el analito. y la hidrólisis alcalina con KOH 10M.

• En las pruebas de extracción en fase sólida. se observa que la columna con fase C8 tiene una mejor eficiencia que la columna C18. . para el analito de interés (THC-COOH). esto debido a las características del THC y sus metabolitos. se observó una mayor área relativa utilizando acetato de etilo como extractante. al tener grupos funcionales polares. • El último parámetro a evaluar para la optimización del método fue la extracción con diferentes disolventes orgánicos. éstos son más afines por el cartucho con cadena hidrocarbonada más corta.

El método fue probado en dos muestras reales con diferentes niveles de concentración de THC-COOH obteniéndose resultados confiables.• En este trabajo se logró la optimización del procedimiento de preparación de muestra para la cuantificación de THC-COOH en muestras de orina de atletas. . Se encuentra en proceso la validación completa del método desarrollado. como parte del control antidopaje exigido por la AMA. con coeficientes de variación porcentuales menores a 10 %.

2007 October .Simultaneous GC–EI-MS Determination of Δ9-Tetrahydrocannabinol. .ipd. Fundación Miguel Indurain. www. International Standard. 31(8): 477–485.• Fundación Instituto Catalán de Farmacología.wadaama.gob.org • Instituto Peruano del Deporte. The 2012 Prohibited List. Uso terapeútico del cannabis: Farmacología básica. and 11-nor-9-Carboxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol in Human Urine Following Tandem Enzyme-Alkaline Hydrolysis.pe/conad/image/folleto. Enero de 2012. 11-Hydroxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol. Abraham.pdfte • Tsadik T. • WADA. http://www. España 2007 • Por un deporte limpio. et al. J Anal Toxicol.

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