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DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE UNA LEVADURA

I. INTRODUCCIN

La fermentacin alcohlica es un proceso bioqumico para la obtencin de etanol, han sido utilizadas desde tiempos inmemoriales, ya sea para la elaboracin de cerveza, del vino, entre otros productos. Es por ello la importancia de mejorar los procesos de fermentacin y concerniente a ello, ms a la optimizacin del rendimiento industrial. Los inculos de levaduras comerciales son ampliamente usados en la industria de las bebidas alcohlicas, sin embargo es preferible utilizar cepas autctonas, las cuales estn adaptadas a los medios de fermentacin de cada rea. Aunque se han encontrado muchos gneros de levaduras en fermentaciones, la especie Saccharomyces cerevisiae es la principal responsable de la fermentacin alcohlica, as como de la produccin de la mayora de los compuestos aromticos. Algunos de los criterios de seleccin de las cepas se basan en su capacidad fermentativa, medida como produccin de etanol, acidez y consumo de azcares. Como materia prima para la fermentacin alcohlica se utilizan generalmente jugos de frutas, los cuales contienen mucha glucosa y fructosa; igualmente es fcil de fermentar el azcar corriente (sacarosa). Sin embargo, no todos los azucares pueden servir como substrato para las levaduras, he aqu la importancia de elegir el substrato adecuado as como las concentraciones adecuadas para un proceso ptimo.

II. OBJETIVOS Determinar la prdida de peso y la cantidad de glucosa consumida por las soluciones de levaduras, as como el CO2 producido. Determinar el rendimiento real de las levaduras (g. etanol/g glucosa). Determinar la eficiencia de las levaduras.

III. FUNDAMENTO TERICO 3.1. Glucolisis La glucolisis es una va catablica del citoplasma que existe en casi todos los organismos, sean aerobios o anaerobios. Es el conjunto de reacciones que degradan la gluc9osa (C6) transformndola en dos molculas de cido pirvi co (PYR) (C3).
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Estas reacciones se realizan en el hialoplasma de la clula. Es un proceso anaerobio, que no necesita oxgeno y en el que por cada molcula de glucosa (GLU) se obtienen 2 ATP y 2 NADH + H+ (Tortora, Funke, & Case, 2007). 3.1.1. Balance de la glucolisis El balance de la glucolisis es sencillo: la glucosa se fragmenta en dos molculas de piruvato y adems se forman dos molculas de piruvato y adems se forman dos molculas de ATP y NADH + H+. En presencia de oxigeno el piruvato y el NADH + H+ alcanzan la mitocondria y all son nuevamente transformados. En condiciones de anaerobiosis a partir del piruvato y del NADH + H+ deben producirse en el citoplasma productos de fermentacin como el lactato o el etanol para generar el NAD+ necesario para la continuacin de la glucolisis. En esas condiciones la glucolisis es la nica posibilidad de sintetizar ATP de las clulas animales (Koolman, 2004).

Figura 1. Reaccin global de la gluclisis 3.1.2. Fases de la glucolisis En sntesis, al glucolisis consta de dos fases fundamentales, una preparatoria y otra de conservacin de energa: a) En primer lugar, en la fase preparatoria se utilizan dos molculas de ATP durante el proceso en el que una molcula de glucosa de seis tomos de carbono experimenta procesos de fosforilacin, reestructuracin y escicin para formar dos compuestos de tres tomos de carbono cada uno: gliceraldehdo-3-fosfato (GP) y dihidroacetona fosfato (GHAP). La DHAP experimenta una conversin rpida en GP (tambin puede tener lugar al reaccin en sentido inverso). La conversin de DHAP en GP significa que a partir de ese momento de la glucolisis se aportarn dos molculas de GP en las reacciones qumicas restantes. b) En la fase de conservacin de energa, las dos molculas de tres tomos de carbono son oxidadas en varios pasos para formar dos molculas de acido pirvico. En estas reacciones dos molculas de NAD+ experimenten una reduccin a NADH y se forman cuatro molculas de ATP por fosforilacion a nivel del sustrato (Melo & Cuamatzi, 2007). Dado que para iniciar la glucolisis se necesitaron dos molculas de ATP y el proceso genero cuatro molculas de ATP, se produjo una ganancia neta de dos
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molculas de ATP por cada molcula de glucosa oxidada. Las reacciones y productos que surgen en las fases de la glucolisis se observan en la figura 2 y 3 (Koolman, 2004).

Figura 2. Reacciones de la primera fase de la gluclisis.

Figura 3. Reacciones de la segunda fase de la gluclisis. .

3.2. Respiracin Aerbica Es el proceso en el cual, sus clulas extraen la energa presente en la glucosa, cidos grasos y otros compuestos orgnicos, utilizando oxigeno y produciendo CO2 , H2O y 38 ATP por cada glucosa oxidada. Este proceso se lleva a cabo a nivel celular y lo realizan casi todos los organismos. Una de las principales vas. La respiracin aerobia se puede resumir en la reaccin general. La respiracin aerbica consta de varias etapas: Gluclisis (ya descrita anteriormente), Ciclo de Krebs, cadena transportadora de electrones y fosforilacin oxidada (De Abate, 1999). 3.2.1. Ciclo de Krebs El ciclo de Krebs (conocido tambin como ciclo de los cidos tricarboxlicos o ciclo del cido ctrico) es un ciclo metablico de importancia fundamental en todas las clulas que utilizan oxgeno durante el proceso de respiracin celular. En estos organismos aerbicos, el ciclo de Krebs es el anillo de conjuncin de las rutas metablicas responsables de la degradacin y desasimilacin de los
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carbohidratos, las grasas y las protenas en anhdrido carbnico y agua, con la formacin de energa qumica. El ciclo de Krebs es una ruta metablica anfiblica, ya que participa tanto en procesos catablicos como anablicos. Este ciclo proporciona muchos precursores para la produccin de algunos aminocidos, como por ejemplo el cetoglutarato y el oxalacetato, as como otras molculas fundamentales para la clula (figura 4) (Garrido & Teijn, 2006).

Figura 4. Reacciones del Ciclo de Krebs. 3.2.2. Cadena transporta de electrones Los electrones de alta energa son transportados por el NADH y el FADH2 del ciclo de Krebs, que van cuesta abajo hasta el oxgeno. Se desprenden grandes cantidades de energa que impulsan el bombeo de protones (iones H+) hacia el exterior de la matriz mitocondrial. Uno de los portadores de electrones es una coenzima, los dems contienen hierro y se llaman citocromos. Cada portador esta en un nivel ms bajo de energa que el anterior y la energa que se libera se usa para formar ATP (Garrido & Teijn, 2006). 3.2.3. Fosforilacin oxidativa En esta ltima etapa de la respiracin celular, un complejo enzimtico llamado ATP sintetasa, produce el ATP que requiere nuestras clulas para crecer, realizar transporte activo, dividirse, etc. La fosforilacin oxidativa es la transferencia de electrones de los equivalentes reducidos NADH, NADPH, FADH, obtenidos en la gluclisis y en el ciclo de Krebs hasta el oxgeno molecular, acoplado con la sntesis de ATP. Este proceso metablico est formado por un conjunto de enzimas complejas, ubicadas en la membrana interna de las mitocondrias, que catalizan varias reacciones de xido-reduccin, donde el oxgeno es el aceptor final de electrones y donde se forma finalmente agua. De una molcula de glucosa
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se obtienen 38 molculas de ATP mediante la fosforilacin oxidativa (Garrido & Teijn, 2006). 3.3. Fermentacin Una vez que la glucosa ha sido degrada para formar acido pirvico este compuesto puede experimentar una degradacin completa durante la respiracin, como se comento antes, o se puede convertir en un producto orgnico durante la fermentacin, en el transcurso de la cual se regeneran NAD+ y NADP+ que pueden ingresar en otro ciclo de glucolisis. La fermentacin se puede definir de diversas maneras, pero nosotros la definimos como un proceso que: Libera energa a partir de azucares u otras molculas orgnicas, como aminocidos, cidos orgnicos, purinas y pirimidinas. No necesita oxigeno (pero a veces tiene lugar en su presencia). No necesita recurrir al ciclo de Krebs ni a una cadena transportadora de electrones. Utiliza una molcula orgnica como aceptor final de electrones. Solo produce pequeas cantidades de ATP (una o dos molculas por cada molcula de material incial) debido a que una gran parte de la energa original almacenada en la glucosa permanece en los enlaces qumicos de los productos finales orgnicos, como el acido lctico o el etanol (Koolman, 2004).

Durante la fermentacin los electrones se transfieren (junto con los protones) desde coenzimas reducidas (NADH, NADPH) el acido pirvico o sus derivados. Los aceptores finales de electrones experimentan una reduccin que los convierte en los productos finales. Una de las funciones esenciales del segundo estadio de la fermentacin consiste en garantizar una provisin constante de NAD+ y NADP+ para que pueda continuar el proceso de glucolisis. En la fermentacin el ATP se produce exclusivamente durante la glucolisis. Los microorganismos poseen la capacidad de fermentar diversos sustratos; los productos finales dependen del tipo de microorganismo. Del tipo de sustrato y del tipo de enzimas que se encuentran presentes y en estado de activacin. El anlisis qumico de estos productos finales ayuda a identificar los microorganismos (Klages, 1998) 3.3.1. Fermentacin alcohlica La fermentacin del alcohol tambin comienza con la glucolisis de una molcula de glucosa para formar dos molculas de acido pirvico y dos molculas de ATP. Durante el paso siguiente las dos molculas de acido pirvico se convierten en dos molculas de acetaldehdo y dos molculas de CO2. Ms tarde las dos molculas de acetaldehdo son reducidas por dos molculas de NADH para formar dos molculas de etanol. La fermentacin del alcohol tambin es un proceso que produce una escasa cantidad de energa debido a que la mayor parte de la energa almacenada en la molcula de glucosa inicial permanece en el producto final, es decir el etanol (Koolman, 2004). La fermentacin del alcohol se observa en numerosas bacterias y levaduras. Saccharomyces son productos de desecho para las clulas de la levadura pero son tiles para el ser humano. El etanol producido por las levaduras es el alcohol presente en las bebidas alcohlicas y el dixido de carbono elaborado por las levaduras es responsable de que la masa del pan aumente de tamao (leve).
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La fermentacin alcohlica consiste de 11 reacciones enzimticas, mostradas en la figura 5.

Figura 5. Etapas de la fermentacin alcohlica. 3.4. Limitaciones del Proceso La determinacin de los factores que limitan la gliclisis fermentativa del etanol son complejos debido a la interrelacin existente y a la naturaleza de los parmetros intervinientes durante el proceso de fermentacin. Alguno de ellos se deben tener en cuenta en la fermentacin alcohlica industrial. En las limitaciones que surgen durante el proceso se pueden enumerar alguno de los ms importantes como son: Concentracin de etanol resultante: una de las principales limitaciones del proceso es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol) que se llegan a producir durante la fermentacin, algunos microorganismos como el saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentracin volumen. Acidez del substrato: el pH es un factor limitante en el proceso de la fermentacin ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea alcalino o cido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras est en un rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales procuran mantener los niveles ptimos de acidez durante la fermentacin usualmente mediante el empleo de disoluciones tampn. Concentracin de azcares: la concentracin excesiva de hidratos de carbono en forma de monosacridos y disacridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentracin puede frenar el proceso. Contacto con el aire: una intervencin de oxgeno (por mnima que sea) en el proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razn por la que los recipientes fermentadores se cierren hermticamente. La temperatura. El proceso de fermentacin es exotrmico, y las levaduras tienen un rgimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura optimos, se debe entender adems que las levaduras son seres mesofilos. Si se expone cualquier levadura a una
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temperatura cercana o superior a 55C por un tiempo de 5 minutos se produce su muerte. Ritmo de crecimiento de las cepas: Durante la fermentacin las cepas crecen en nmero debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto hace que se incremente la concentracin de levaduras (Surez & igo , 2004)

IV. MATERIALES Y METODOLOGA Materiales Levadura Agua destilada Azcar Algodn Fiola volumtrica Matraz Erlenmeyer.

Equipos Balanza semi-analtica Refractmetro.

Metodologa Se pes los matraces, para poder sacar clculos posteriores. Prepar dos soluciones de sacarosa al 10% y 20%. Luego de esto se verti en las soluciones 1% de levadura, se diluy en la solucin y se tap con algodn la boca de los matraces. Se tom el peso y los Brix en el tiempo 0, luego se tom peso cada 24 horas, hasta llegar a peso constante, luego se tomo el peso y los Brix finales. Encontrar la prdida de peso y cantidad de glucosa consumida (Brix). Determinar el rendimiento real (g etanol/g glucosa). Calcular finalmente la eficacia de las levaduras.

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V. RESULTADOS Y DISCUSIONES En el cuadro 1 observamos los pesos tomados de las soluciones al 8% y 18% durante el proceso y los grados Brix iniciales y finales.
Cuadro 1. Datos experimentales para determinar capacidad fermentativa. Tiempo(h) 0 18 66 96 116 137 185 Solucin 8% W(g) Brix 105.88 8 105.26 103.21 101.96 100.61 100.03 99.41 0.5 Solucin 18% W(g) Brix 95.63 18 95.11 93.23 92.13 90.82 90.15 89.47 9.25

Cuadro 2. Valores encontrados durante la respiracin y fermentacin. Valores X Y A B Solucin 8% 5.97 2.42 2.92 3.55 Solucin 18% 7.81 1.6 3.82 2.34

X: g Glucosa consumida durante la fermentacin Y: g Glucosa consumida durante la respiracin A: g CO2 producido durante la fermentacin B: g CO2 producido durante la respiracin En el cuadro 2, se indican los resultados de la glucosa consumida durante la fermentacin y respiracin, el CO2 tambin para ambos casos. Podemos darnos cuenta que para la solucin al 18% existe un mayor consumo de glucosa y una menor produccin de CO2 con respecto a la solucin del 8%, este resultado indica que la solucin al 18% un mayor porcentaje de la glucosa se degrado por la va fermentativa y en menor porcentaje por la respiracin aerobia en comparacin a la otra solucin. Esta aclaracin se justifica en que por cada 180g de glucosa consumida por fermentacin se generan 88g de CO2 mientras que por respiracin se producen 264g de CO2 (Surez & igo , 2004). Existen levaduras que prefieren un metabolismo fermentativo incluso en aerobiosis, en las cuales como mximo un 10% de glucosa se consume por va oxidativa (Leveaux & Bouix, 2000). En nuestra prctica, las levaduras, en la solucin al 8% de sacarosa consumieron el 72% de la glucosa por va fermentativa mientras que el 28% restante por
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respiracin, y para la muestra al 18% de la glucosa consumida el 83% fue pro la va fermentativa y el 17% por respiracin. Aunque para ambos casos hay un exceso de consumo de glucosa por respiracin debido a que no se pudo mantener las condiciones anaerobias adecuadamente, para la solucin al 18 % el consumo por respiracin es menor lo que concuerda con Surez & igo (2004) que indica que a mayor concentracin de glucosa favorecer la anaerobiosis dentro de la solucin. En el cuadro 3 se especifican la cantidad de alcohol formado para ambas muestras as como su rendimiento experimental y la eficiencia.
Cuadro 3. Rendimiento y eficiencia de la Capacidad fermentativa de la levadura. Variable g OH formado Rendimiento (e) Rendimiento (t) Eficiencia Solucin 8% 3.0513 0.3635 0.51 71.28 Solucin 18% 3.9936 0.4245 0.51 83.24

( B l o u i n & P e yn a u d , 2 0 0 3 ) L a l e v a d u r a Saccharomyces cerevisiae permite una conversin aproximada del 85% al cabo de 32horas y del 90% al cabo de 75 horas en la produccin de etanol. Sin embargo en la prctica obtuvimos una eficiencia de 72% para la muestra de 8Bx iniciales y 83% para la muestra de 18Bx, esto se debe a muchos factores que limitan el proceso. La temperatura de fermentacin se encuentra entre 10 y 35 C, en este intervalo la velocidad se duplica por toda elevacin de temperatura de alrededor de 10C, para caer espectacularmente por encima de 35C. Estos aumentos d temperatura favorecen la presencia de azcares residuales y de un rendimiento de alcohol menor (Blouin & Peynaud , 2003). Otro factor que acondiciona el rendimiento es la concentracin de azcares ya que una excesiva concentracin de hidratos de carbono en forma de monosacridos y disacridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentracin puede frenar el proceso (Surez & igo , 2004). (Leveaux & Bouix, 2000) Una intervencin de oxgeno (por mnima que sea) en el proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razn por la que los recipientes fermentadores se cierren hermticamente. En el cuadro 1 observamos adems que los grados Brix finales fueron de 0,5 para la solucin del 8% y 9.25 para la solucin del 18%, sin embargo Navarro et al (2000) indican que la concentracin final del azcar debe ser del 2% para todos los azcares. Esto quiere decir que hubo un consumo mayor de glucosa sin embargo como no se manifest en el rendimiento este consumo excesivo fue por respiracin.

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7 6 CO2 Producido (g) 5 4 3 2 1 0 0 30 60 90 120 150 180 210 Tiempo (h)

Figura 6. Comportamiento de la produccin de CO2 en la muestra de 8 Bx.

7 6 CO2 Producido (g) 5 4 3 2 1 0 0 30 60 90 120 150 180 210 Tiempo (h)

Figura 7. Comportamiento de la produccin de CO2 en la muestra de 18Bx. En las figuras 6 y 7 podemos observar, la cantidad de CO2 producido durante el proceso de fermentacin. El fin de esta grfica es relacionar el CO2 producido con la cantidad de alcohol producido, las grficas indican un aumento notable del CO2 sin embargo, al final del proceso este aumento disminuye, y ser hasta llegar al punto en donde no habr ms produccin de este. En el quinto da el proceso fermentativo se encuentra notablemente avanzado, en el mosto empiezan a escasear determinados nutrientes, el grado alcohlico es lo suficientemente importante para comenzar a afectar la permeabilidad de la membrana celular ocasionando la muerte de la levadura (Surez & igo , 2004). Segn Navarro et al (1986) la produccin de etanol a lo largo de la fermentacin es signifivativamente mayor durante las primeras horas de fermentacin, eso es debido al a alta disponibilidad de sustrato en el medio y a medida que ste se va a agotando las velocidades de produccin disminuyen hasta alcanzar un estado estacionario.

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VI. CONCLUSIONES Se determin la glucosa consumida para ambas soluciones, siendo para la solucin al 8% de sacarosa un consumo de 8,3931g de los cuales 5,97 g fueron consumidos por el proceso de fermentacin y 2,42g por respiracin. Para la solucin al 10% de sacarosa el consumo de glucosa fue de 9,4078g, siendo consumidos 7,81g por el proceso de fermentacin y 1,6g por respiracin aerobia. Se determin adems el CO2 producido en ambas soluciones obtenindose para la solucin al 8% una produccin de 6,47g de CO2 del cual le corresponde 2,92g por el proceso de fermentacin y 3,55g por respiracin. Para la solucin al 18% el CO2 producido fue de 6,16g siendo la produccin de CO2 de 3,82g por el proceso de fermentacin y 2,34g por respiracin. Tambin se determin la cantidad de alcohol producido para ambas soluciones siendo los valores de 3,0513g en la solucin al 8% con un rendimiento experimental de 0.3635g OH/g Glucosa y 3,9936g en la solucin al 18% de sacarosa con un rendimiento experimental de 0.4245g OH/g Glucosa. La eficiencia de las levaduras fueron de 71.28% en la solucin al 8% de sacarosa y 83.24% en la solucin al 18%.

VII. RECOMENDACIONES Es recomendable realizar un estudio para optimizar la produccin de etanol, modificando las condiciones de fermentacin, mediante adicin del sustrato a diferentes concentraciones, suplementos nutricionales y reciclado de clulas y utilizacin de diferentes cepas que sean tolerantes al etanol. La fermentacin alcohlica aparte de ser un proceso relativamente barato para la obtencin de alcohol, es poco susceptible a contaminacin y posee altos rendimientos. Es por ello que se recomienda buscar un sustrato ms barato proveniente de algn desecho o residuo para evitar gastar mucho en sacarosa.

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VIII. REFERENCIAS Blouin, J., & Peynaud , B. (2003). Enologa prctica: conocimiento y elaboracin del vino. Madrid: Mundi-Prensa Libros. De Abate, J. (1999). Biologa aplicada. San Jos: EUNED. Garrido, A., & Teijn, J. (2006). Fundamentos de bioqumica metablica. Madrid: Editorial Tbar . Klages, F. (1998). Tratado de qumica orgnica. Valencia: Editorial Revert S.A. Koolman, J. (2004). Bioqumica: texto y atlas. Madrid: Editorial Mdica Panamericana S.A. Leveaux, J., & Bouix, M. (2000). Microbiologa Industrial. Zaragoza: Editorial Acribia. Melo, V., & Cuamatzi, . (2007). Bioqumica de los procesos metablicos. Mxico: Revert Ediciones S.A. Navarro, e. (1986). Produccin de etanol por alta concentracin de levaduras. Buenso Aires: Revista Argentina de Microbiologa. Surez, J., & igo , B. (2004). Microbiologa Enolgica: fundamentos de vinificacin. Madrid: Ediciones Mundi-Prensa. Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introduccin a la Microbiologa. Buenos Aires: Ed. Medica Panamericana.

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ANEXOS

Figura 8. Levadura utilizada para el proceso de fermentacin.

Figura 9. Soluciones de sacarosa al 8 y 18% en agua.

Figura 10. Fiolas con las soluciones y levaduras durante la fermentacin.

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