Biologia Molecular

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA
MANUAL DE PRCTICAS BIOLOGA MOLECULAR
MANUAL DE PRCTICAS DE BIOLOGA MOLECULAR COMPILADORES: Principal: Dra. Florinda Jimenez Vega Colaboradores: Revisado por: Academia de Biologia 2011
Ciudad Jurez, Chihuahua Universidad Autnoma de Ciudad Jurez 2011 p. 69
M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa
D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa
Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas
M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas
Aprobados por la Academia de Biologa, 2011
I NTRODUCCIN
La Biologa Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensin de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la informacin gentica se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos. Este conocimiento ha rebasado barreras naturales entre especies y instalar genes de cualquier organismo, en un organismo hospedador no relacionado mediante el empleo de herramientas genticas. Una de las consecuencias importantes derivadas, fue la produccin de fragmentos de cidos nuclecos a gran escala, abriendo las puertas a la secuenciacin de los cidos nuclecos, y por ende a nuevas disciplinas como el diagnstico molecular, la terapia gnica o la obtencin de organismos superiores recombinantes. Cronolgicamente todos estos eventos inician en el ao 1866 cuando Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de segregacin y clasificacin independiente de los genes. En 1953 se marca la pauta que dio origen a la revolucin gentica con la publicacin de Watson y Crick en la cual describen la estructura del DNA como una doble hlice complementaria que recuerda la estructura de una escalera de caracol. A partir de entonces y de manera exponencial, se ha llegado hasta la secuenciacin de los genomas y los procesos de clonacin y mutagnesis. El presente manual tiene como finalidad la transportacin al maravilloso estudio de las macromolculas y su integracin como herramientas moleculares para el estudio y caracterizacin de estas. Es solo el inicio de un largo camino por andar, esperando sea de inters para ustedes.
T ABLADE C ONTENIDO
Practica No. 1 ........................................................................................................ 4 Preparacin de soluciones de concentracin definida y soluciones amortiguadoras ..................................................................................................... 4 Practica No. 2 ........................................................................................................ 9 Determinacin de protenas por la tcnica de Bradford .............................. 9 Practica No. 3 ...................................................................................................... 13 Electroforesis en Geles de Poliacrilamida desnaturalizantes SDS-PAGE .... 13 Practica No. 4 ...................................................................................................... 20 Tincin de Geles de Poliacrilamida por Coomassie Blue ............................. 20 Practica No. 5 ...................................................................................................... 22 Extraccin de DNA utilizando DNAZOL............................................................ 22 Practica No. 6 ...................................................................................................... 25 Extraccin de DNA utilizando Fenol Cloroformo Alcohol isoamlico .......... 25 Practica No. 7 ...................................................................................................... 28 Extraccin de RNA .............................................................................................. 28 Practica No. 8 ...................................................................................................... 31 Cuantificacin de RNA y DNA .......................................................................... 31 Practica No. 9 ...................................................................................................... 33 Electroforesis de DNA en geles de agarosa ................................................... 33 Practica No.10 ..................................................................................................... 35 Electroforesis de RNA en geles de agarosa-formaldehido .......................... 35 Practica No. 11 .................................................................................................... 38 Sntesis de cDNA .................................................................................................. 38 Practica No. 12 .................................................................................................... 41 Reaccin en cadena de la Polimerasa .......................................................... 41 Practica No. 13 .................................................................................................... 44
ManualdePrcticasdeLaboratorio BiologaMolecular Dra.FlorindaJimnezVega
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Aislamiento de un fragmento de DNA a partir de un soporte solido ......... 44 Practica No. 14 .................................................................................................... 47 Ligacin de productos de PCR a un vector de clonacin .......................... 47 Practica No. 15 .................................................................................................... 50 Preparacin de clulas qumicamente competentes ................................. 50 Practica No. 16 ................................................................................................... 53 Transformacin bacteriana en E. coli .............................................................. 53 Practica No. 17 .................................................................................................... 57 Anlisis de colonias recombinantes por PCR ................................................. 57 Practica No. 18 .................................................................................................... 60 Aislamiento de DNA plasmdico ....................................................................... 60 Practica No. 19 .................................................................................................... 63 Digestin de DNA plasmdico con endonucleasas de restriccin ............. 63 Practica No. 20 .................................................................................................... 67 Introduccin a la Bioinformtica ...................................................................... 67
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P RACTICA N O . 1 P REPARACINDESOLUCIONESDE
CONCENTRACIN DEFINIDA Y SOLUCIONESAMORTIGUADORAS
OBJETIVO
Que el estudiante aprenda a preparar disoluciones en concentraciones definidas en porciento, normalidad, molalidad y molaridad.
INTRODUCCIN
La composicin de una solucin se debe medir en trminos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentracin. Durante cualquier trabajo experimental, el uso de soluciones se hace indispensable, por lo que es necesario conocer los procedimientos para su elaboracin. En la presente prctica se realizarn soluciones utilizando como concentracin la molaridad, la normalidad y las relaciones porcentuales. La molalidad se define como el nmero de moles de soluto disueltos en 1 kg de disolvente, esto es: M =[( numero de moles de soluto )/( peso del disolvente en kg) ] La unidad de porcentaje peso tiene la ventaja de que no se necesita conocer la masa molar del soluto. Adems, el porcentaje peso de una solucin es independiente a la
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temperatura, ya que se define en trminos de pesos, el termino de fraccin molar no se emplea normalmente para expresar la concentracin de soluciones. Sin embargo es de utilidad para calcular las presiones parciales de los gases y en el estudio de concentracin que se emplean con frecuencia, la ventaja del empleo de la molaridad es que por lo general resulta ms sencillo medir el volumen de una solucin utilizando matraces volumtricos calibrados con precisin, que pesar al disolvente. Su principal inconveniente es que depende de la temperatura, ya que el volumen de una solucin suele aumentar con el incremento de la temperatura. Otro inconveniente es que la molaridad no especifica la cantidad de disolvente presente. Por otra parte, la molalidad es independiente de la temperatura, ya que se define como una relacin del nmero de moles de soluto y el peso del disolvente. Por esta razn, la molalidad es la unidad de concentracin de empleo preferente en los estudios que involucran cambios de temperatura, al igual que en aquellos de las propiedades negativas de las soluciones. Por su parte la Normalidad se define como el nmero de equivalentes qumicos de sustancia disuelta por litro de solucin. # de equivalentes = peso molecular del soluto As tambin dentro de las concentraciones porcentuales, el %peso se define como el peso del componente entre el peso de la solucin por 100 y el % mol es el numero de moles de cada uno de los componentes entre el nmero total de moles de solucin por 100.
MATERIALES
Cloruro de Sodio Hidrxido de Sodio cido clorhdrico
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Fosfato de Sodio Probeta, pipetas, Balanza, Papel encerado, placa de agitacin, magnetos, matraces volumtricos y vasos de precipitado.
PROCEDIMIENTO
I. Disoluciones de concentracin en peso Preparacin de 50 mL de una solucin de NaCl al 0.9% (p/v) 1. Pesar NaCl en la balanza 2. Disolver los X g de NaCl en agua destilada (aprox. 30 mL) 3. Colocar la disolucin de NaCl en un matraz volumtrico de 50 mL y aforar con agua destilada. Preparacin de 50 mL de una disolucin de alcohol etlico al 70% (v/v) 1. Con base a la concentracin del alcohol etlico comercial determinar el volumen necesario para tener 35 mL de alcohol etlico. 2. Medir el alcohol en una probeta 3. Colocar el alcohol etlico en un matraz volumtrico de 50 mL y aforar con agua destilada.
II. Disoluciones de concentracin molar Preparacin de 200 mL una disolucin de NaOH 1 M 1. Determinar los gramos requeridos de NaOH para preparar 200 mL de NaOH 1M. 2. Pese el NaOH requerido y colocarlo en un vaso de precipitado de 500 mL para su disolucin con agua destilada (aprox. 150 mL). 3. Colocar la disolucin en un matraz volumtrico de 200 mL y aforar con agua destilada.
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Nota: Los cidos y los lcalis son agentes corrosivos. Extreme precauciones para su manejo, evite todo el contacto con la piel y ojos.
Preparacin de 100 mL de una disolucin de NaOH 25 mM a partir de la disolucin de NaOH 1M Aplicar la frmula C1 x V1 = C2 x V2 para calcular los mL de NaOH 1 M necesarios para preparar 100 mL de una disolucin de NaOH 25 mM V1= (C2 x V2)/ C1 Donde: C1= Concentracin inicial V1= Volumen inicial C2= Concentracin final V2= Volumen final
Medir el volumen requerido de NaOH 1M con una pipeta y colocarlos en un matraz volumtrico de 100 mL y aforar con agua destilada.
III. Disoluciones de Concentracin Normal Preparacin de HCL 1N 1. Conocer la concentracin del HCL concentrado comercial. 2. Calcular la cantidad de HCL conc. requerido para preparar 50 mL de HCl 1N. 3. Colocar el agua destilada (aprox. 30 mL) en un vaso de precipitado. 4. Con cuidado agregar poco a poco la cantidad de HCL concentrado requerido. a. Nota: Siempre se agrega el cido al agua nunca el agua al cido. 5. Agitar en la placa de agitacin 6. Colocar la disolucin en un matraz volumtrico de 50 mL y aforar con agua destilada.
ManualdePrcticasdeLaboratorio BiologaMolecular Dra.FlorindaJimnezVega Pag.7
TEMASADEMOSTRAR
Clculos estequiomtricos
RESULTADOS
Desarrollar los clculos que realizaron para preparar las soluciones. Concluya la importancia de los diferentes procesos para preparar soluciones.
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P RACTICA N O . 2 D ETERMINACINDE P ROTENAS PORLA T CNICADE B RADFORD
OBJETIVO
Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de elaborar una curva de calibracin para cuantificar la concentracin de una protena.
INTRODUCCIN
Las molculas proteicas se organizan de manera caracterstica en distintos niveles. El nivel primario es la secuencia de aminocidos, dictada por el gen. Esta secuencia a su vez determina el plegamiento local (estructura secundaria, el plegamiento global (estructura terciaria) y la organizacin en estructuras de mltiples subunidades (estructura cuaternaria). Para la cuantificacin de estas molculas existen diversos mtodos los cuales se basan en a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. Dentro de la unin a colorantes especficos la cuantificacin proteica por Bradford se basa en la unin del Coomassie Brillant Blue G-250 a molculas de protena en pH cido produciendo un cambio de color de rojo-caf a azul, que presenta un mximo de absorbancia a 595 nm. La interaccin del Coomassie se ha demostrado con residuos de arginina y muy levemente con cistena, lisina, tirosina, triptfano y residuos de fenilalanina. Debido a que la respuesta
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de color no es lineal en un amplio intervalo de concentracin, es recomendable correr una curva estndar.
MATERIALES
Reactivo de Bradford Disolver 100 mg de Coomassie B-Blue G-250 en 50 mL de etanol por agitacin con un magneto, cuando este perfectamente disuelto adicionar 100 mL de ac.fosfrico 85% y aforar a un 1Lt CUIDADO!!! (cido + agua) Filtrar con papel (Listo para ser empleado). Almacenar a temperatura ambiente. Agua Albmina Celdas para luz visible
PROCEDIMIENTO
Elaboracin de curva patrn 1. A partir de una alcuota de protena de aproximadamente 4 mg/mL (C1), realizar las diluciones necesarias para tener alcuotas de 500 uL con las siguientes concentraciones (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/mL) Conc. mg/mL L apartir de L de agua la alcuota de 4mg/mL C1 V1 Volumen final 500 L V2
C2 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
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2. Para la cuantificacin, se realizara, cada determinacin por duplicado. 3. Marcar para cada concentracin 2 tubos Adicionar 100 L de la protena de cada una de las concentraciones conocidas 4. Incluir un par de tubos sin muestra, intercambiar por agua (ser el control) 5. Adicionar 1 mL de reactivo 6. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente 7. Determinar absorbancia a 595 nm
Informacin Adicional Verificar que el material empleado se encuentre perfectamente limpio ya que concentraciones muy bajas de detergentes pueden interferir en la reaccin. Sustancias compatibles (NH4)2SO4, Etanol con Bradford NaCl, MgCl, KCl,
Sustancias incompatibles con Bradford: Tris 2 M, Ac. Actico, 2Mercaptoetanol 1 M, Sacarosa 1 M, Glicerol 99 %, EDTA 0.1 M, Triton X-100 0.1 %, SDS 1 %, Hemosol 0.1 %
TEMASADEMOSTRAR
Caracterizacin de macromolculas
RESULTADOS
Graficar la concentracin de protena (mg/mL) en el eje X y lectura de absorbancia (595nm) eje Y. Utilizando el programa Excel, realizar una regresin lineal de los datos y determinar la curva estndar para cuantificar.
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P RACTICA N O . 3 E LECTROFORESISEN G ELESDE P OLIACRILAMIDA DESNATURALIZANTES SDS PAGE

OBJETIVO
Conocer los principios y aplicaciones de la electroforesis.
INTRODUCCIN
La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos nuclecos) segn la movilidad de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se use. Los cidos nuclecos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separacin se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla, por la que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida. Por lo general para caracterizar la molcula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo elctrico y se utiliza para determinar el peso molecular en el caso de
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protenas o para detectar cambios de aminocidos y separar cuantitativamente distintas especies moleculares.
MATERIALES
Soluciones proteicas Marcadores de peso molecular Fuente de poder Cmara de electroforesis Puntas de micropipeta Papel absorbente Soluc. Azul de Coomasie (tincin) (tabla anexa) Soluc. PAGE-SDS (Tabla anexa)
PROCEDIMIENTO
Preparacin del gel de corrimiento (10%) 1. La preparacin del gel de separacin se efecta de acuerdo a la tabla anexa 2. Una vez polimerizado en el portagel, lavarlo y eliminar el exceso de agua usando tiras de papel Whatman. 3. Preparar el gel de concentracin (stacking gel) de acuerdo a la tabla anexa. 4. Una vez llena la cmara, colocar el peine evitando la formacin de burbujas. 5. Una vez polimerizado el gel, lavarlo con agua destilada y llenarlo con buffer de corrimiento (running buffer).
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6. Resuspender la buffer muestra en proporcin 1:4 (si es necesario agregar ms azul de bromofenol y glicerol). 7. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular en los carriles correspondientes. 8. Fijar las condiciones de corrimiento en 60 V hasta que entre la muestra al gel de separacin, una vez dentro, cambiar a 100120 V (2 h) y vigilar que las muestras no salgan del gel. 9. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios dividir el gel. 10. Teir el gel utilizando Coomassie Blue, de acuerdo al protocolo anexo. 11. Calcular el peso molecular de las protenas problema.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
1. Determinacin de la aparente masa molecular de las protenas 2. Mida la distancia total del principio al fin del gel de corrido 3. Mida la distancia del origen a cada uno de los estndares de peso molecular 4. Mida la distancia de la protena desconocida (X) 5. Para cada banda calcula la movilidad relativa: a / total, b / total 6. Ejemplo a = 0.5cm, total = 4.9cm. 0.5/4.9 = 0.1 7. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada estndar
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8. Hacer una grafica del log pM contra la movilidad relativa de los estndares 9. Localizar la movilidad relativa de la protena de la protena desconocida, extrapolando el log PM correspondiente y calcular el antiligaritmo.
LOG MW MOVILIDAD
ANEXO
Preparacin del Gel y Reactivos para la Electroforesis en Geles de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli) A) Acrilamida/Bis (30% T, 2.67%C) Acrilamida NN Bismetilenacrilamida 146.0 g 4.0 g
500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4C en la obscuridad. Vida media 30 das.
B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 Tris base Agua destilada 54.45 g 150 mL
Ajustar el pH 8.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 300 mL con agua destilada. Almacenar a 4 C
C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 Tris base Agua destilada 6.0 g 60 mL
Ajustar el pH 6.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 100 mL con agua destilada y almacenar a 4C.
D) 10% (w/v) SDS Disolver 10 g de SDS en agua destilada, agitar suavemente y aforar a 100 mL
E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio
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100 mg de sulfato de amonio. Adicionar 1 mL de agua destilada, preparar en el momento.
F) Buffer de corrimiento (5x), 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 1% de SDS, pH 8.3 Tris base Glicina SDS 45.0 g 216 .0 g 15.0 g
No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo condiciones nativas (PAGE). Aforar a 3 L con agua destilada. No ajustar el pH con acido o base. Almacenar a 4C. Calentar a 37C antes de usar en caso de precipitacin.
G) Buffer muestra Agua destilada 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 Glicerol 10 % SDS 0.5 (w/v) azul de bromofenol en agua 4.4 mL 1.0 mL 0.8 mL 1.6 mL
0.2 mL
Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer. *Si el gel fuese en condiciones desnaturalizantes y reductoras, se deber adicionar 0.4 mL al buffer muestra de betamercaptoetanol y posteriormente de diluir 1:4 habr que calentar las muestras a 95 C por 4 min. *Cuando son condiciones nativas (PAGE) omitir SDS,
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H) Preparacin de PAGE-SDS 10% Volmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel BioRad MR
Gel Separador (Separating) (10 mL)
Agua destilada 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 Acrilamida 10 % SDS Persulfato de amonio 10% Temed
4.0 mL 2.5 mL 3.3 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.004 mL
Gel Concentrador (Stacking) (4mL)
Agua destilada 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 Acrilamida 10 % SDS Persulfato de amonio Temed
2.7 mL 0.5 mL 0.67 mL 0.04 mL 0.10 mL 0.004 mL
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T INCINDE G ELESDE P OLIACRILAMIDAPOR C OOMASSIE B LUE

OBJETIVO
P RACTICA N O . 4
El alumno evaluara el proceso para la deteccin de protenas en gel.
INTRODUCCIN
Las protenas que se han separado en un gel de poliacrilamida (o otros soportes) pueden ser detectadas por diferentes mtodos, entre los que destacan los colorantes y la tincin con plata. La tincin de azul de coomassie permite detectar hasta o.2 a 0.6 g de protena y es cuantitativo (lineal) hasta 15 a 20 g. Se utilizan principalmente solventes como metano y cido actico para fijar las protenas. Dentro de las diversidad de tcnicas que existen podemos mencionar tambin la tincin con Plata que aunque es ms sensible el proceso suele ser ms tardado y ms caro. El uso de la tincin por Comassie tiene dentro de sus bondades bajo costo y rapidez.
MATERIALES
Coomassie Blue-R250 al 0.1% Disolver 0.1 g en solucin de desteido, dejar a temperatura ambiente hasta el siguiente da, agregar el agua. Filtrar siempre antes de su uso.
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Solucin A Solucin de fijado / desteido (Metanol 50%, Ac. Actico 10%) Recipientes plsticos o de vidrio
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir el gel por 10 minutos en solucin A. 2. 3. 4. 5. Teir con la solucin de Coomassie. Desteir con la solucin A hasta que se observen las bandas. Enjuagar con agua destilada. Documente su gel fotograficamente
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
Determine la pureza de sus muestras, as como el tamao de las bandas proteicas obtenidas Defina otras metodologas para tinciones electroforticas mencionando el rango de sensibilidad as como bondades y deficiencias en comparacin a la tincin con azul de comassie.
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P RACTICA N O . 5 E XTRACCINDE DNA UTILIZANDO DNAZOL

OBJETIVO
Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de extraer DNA, partiendo de tejido de tipo animal o vegetal, a travs de esta prctica el alumno pondr en prctica los conocimientos adquiridos en clase para el manejo y almacenamiento del DNA.
INTRODUCCIN
La doble cadena de DNA est compuesta de potenciales grupos reactivos que estn arreglados dentro de una hlice central unida a travs de enlaces de puente de hidrgeno. Estas pares de bases estn protegidas por azucares y fosfatos los cuales estn unidos internamente por fuerzas superiores. A pesar de su estabilidad qumica el DNA es fsicamente frgil, para su extraccin a travs de clulas o tejidos es necesaria Proteinasa K en presencia de EDTA y una solubilizacin de membranas y desnaturalizacin de protenas con un detergente como SDS. Los cidos nucleicos pueden ser purificados a travs de extracciones con solventes orgnicos y ser aplicados a una infinidad de tcnicas desde anlisis de southern blot, como templado en reacciones en cadena de la polimerasa y construccin de libreras genmicas entre otros.
MATERIALES
Material Biolgico
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DNAzol Puntas, micropipetas, microtubos
PROCEDIMIENTO
1. Lisis celular adicionar 0.75-1mL de DNAzol Clulas crecidas en monocapa 10cm 2 de cultivo Suspensin celular 1-3 x 10 7 Tejidos 25-50 mg 2. Mezclar por homogenizacin, si se trata de tejidos, habr que fragmentar en porciones pequeas, previo a la homogenizacin. 3. Sedimentar el homogenizado por centrifugacin por 10 min a 10 000 x g a una temp. ambiente o 4 C. Transferir la fase sobrenadante a un tubo nuevo. 4. Precipitacin.- Precipitar el DNA por adicin de 0.5 mL de Etanol al 100% por mL de DNAzol. Mezclar por inversin y mantener a temperatura ambiente por 1-3 min. El DNA puede ser visible como una nube precipitante. Si es probable, enroscar las hebras de DNA con la ayuda de la punta de una pipeta (Si es que es visible) y transferir a un tubo nuevo. Si tenemos pequeas cantidades, centrifugar a 4000 x g por 1-2 min a temp. ambiente o 4 C y retirar el sobrenadante. 5. Lavado del DNA.- Lavar el DNA precipitado 2 veces con 0.81.0 mL de etanol al 75% por inversin del tubo 3-6 veces. Mantener los tubos en posicin vertical por 1-2 min para sedimentar el DNA y remover el etanol por pipeteo o decantacin. 6. Resuspender el DNA en un pequeo volumen de agua destilada. 7. Evaluar calidad y concentracin
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8. Almacenar el DNA a -20 C hasta su cuantificacin y corrimiento electrofortico.
TEMASADEMOSTRAR
Caracterizacin de los cidos nuclecos
RESULTADOS
Determine como puede interferir la presencia de protenas en la muestra. Investigue en caso de tener protenas en la muestra de DNA que proceso utilizara para poder purificarla? Que caractersticas le da absorbancia 260/280 = 1.9? si obtiene una relacin de
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P RACTICA N O . 6 E XTRACCINDE DNA UTILIZANDO F ENOL C LOROFORMO A LCOHOL ISOAMILICO

OBJETIVO
Evaluar el aislamiento de DNA a partir de extracciones con solventes.
INTRODUCCIN
El DNA puede ser aislado de diferentes formas dependiendo si es cromosomal o extracromosomal, para su purificacin se requiere de debilitar la pared bacteriana por congelacin y descongelacin o por tratamiento con lizosima y agentes quelantes como EDTA. La lisis celular tanto de procariotes como eucariotes, se realiza con la adicin de detergentes, como el dodecil sulfato de sodio (SDS). Despus de la lisis se degrada el RNA y las protenas con ribonucleasa pancreatca y proteasa. Las protenas se extraen con solventes orgnicos como fenol, debido a que este solvente permite su desnaturalizacin y su concentracin en la fase orgnica, en tanto que el DNA es recuperado de la fase acuosa y precipitado con etanol.
MATERIALES
Material Biolgico
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Buffer de Lisis ( Tris 0.1M pH 8.0, EDTA 0.1M, NaCl 0.15 M, 2% mercaptoetanol, 4% L-Sarkosil) Proteasa (10 mg/mL) RNAsa (10mg/mL) Fenol cloroformo alcohol isoamilico 24:25:1 Acetato de sodio 3M pH 5.4 Etanol absoluto Etanol al 70% Agua destilada estril TE pH 8.0
PROCEDIMIENTO
1. Colocar una muestra de tejido finamente cortado aproximadamente 10 mg de tejido en tubos eppendorf de 1.5 mL 2. Adicionar 500 L de Bufer de lisis y 3 L de proteinasa 3. Incubar durante 1 hr a 37C. Vortex cada 30 min 4. Adicionar 3 L de proteinasa e Incubar durante 1 hr a 37C. Vortex cada 30 min 5. Adicionar 500 L de Fenol Cloroformo Alcohol Isoamilico 25:24:1 6. Mezclar por inversin 7. Centrifugar a 14 rpm durante 10 min a 4C 8. Colectar el sobrenadante y colocarlo em um tubo eppendorf nuevo 9. Adicionar 2 volmenes de etanol absoluto previamente enfriado a -20C.
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10. Mezclar por inversin, adicionar 1/10 del volumen de acetato de sodio 3M 11. Incubar a -20 C durante 10 min. 12. Centrifugar a 14 000 rpm durante 20 min a 4C 13. Decantar el sobrenadante 14. Lavar el pellet con 250 L de alcohol al 70 % previamente enfriado a -20 15. Dejar secar por inversin 16. Resuspender el pellet en 50 L de agua estril o buffer TE
TEMASADEMOSTRAR
Caracterizacin de cidos nuclecos
RESULTADOS
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E XTRACCINDE RNA
OBJETIVO
P RACTICA N O . 7
Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de extraer RNA de tejido, y pondr en prctica los conocimientos adquiridos en clase para su manejo y almacenamiento.
INTRODUCCIN
Una tpica clula de mamferos contiene aproximadamente 10 -5 g de RNA, 80-85% del cual es ribosomal. El remanente 1520% consiste de RNAs de bajo peso molecular (RNAs de transferencia y pequeo nuclear). Estos RNAs abundantes han sido determinados en tamao y secuencia, y pueden ser aislados por electroforesis, centrifugacin a travs de gradientes de densidad, o cromatografa de intercambio inico. En contraste con el RNA mensajero, el cual se encuentra entre el 1 al 5 % del total del RNA celular. La clave para poder extraer un RNA intacto es dada a travs de la inactivacin del RNAsa, muchos mtodos, utilizan para la purificacin fuertes agentes desnaturalizantes como tiocionato de guanidina para disruptar las clulas, solubilizar sus componentes y desnaturalizar simultneamente RNAsas endgenas. La tcnica ms utilizada fue descrita por Chomczynski and Sacchi en 1987, en la cual el tiocianato de guanidina es extrado utilizando solventes como fenol cloroformo. Lo cual genera una segunda fase orgnica en la cual el DNA y las protenas son extrados liberando en RNA en la fase sobrenadante. El RNA puede ser precipitado utilizando
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Isopropanol y purificado por cromatografa o utilizado como tal para anlisis de hibridacin tipo Northen Blot, transcripcin reversa o transcripcin reversa-PCR
MATERIALES
Tejido fresco Estuche de diseccin, tubos eppendorf, Trizol, Agua tratada con DEPC, Homogenizadores
PROCEDIMIENTO
1. Cuidadosamente con ayuda de un equipo de diseccin, extraer el tejido a utilizar no contaminar con otro tejido, y de ser posible enjuagar con agua DEPC. 2. Fragmentar el tejido, pesar y colocar en un tubo 3. Mezclar 10 mg de tejido con 0.75 mL de trizol, homogenizar la muestra e Incubar el homogenizado por 5 min a temperatura ambiente (En este paso la muestra puede ser almacenada a -80 C). 4. Adicionar 0.2 mL de cloroformo por cada 0.75 mL de Trizol, mezclar vigorosamente con la mano por 15 seg e incubar a temperatura ambiente por 2-15 min. Centrifugar la muestra a no ms de 12,000 x g por 15 min a 4 C. 5. Transferir la fase acuosa a un tubo limpio, libre de RNAsas. 6. Precipitar el RNA por adicin de 0.5 mL de isopropanol por cada 0.75 mL de Trizol, e incubar a 4 C por 10 min. 7. Centrifugar a no ms de 12,000 x g, por 10 min a 4 C. El RNA precipitara formando una especie de gel, en la parte inferior del tubo 8. Remover el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de EtOH al 75%
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9. Centrifugar a no ms de 7500 x g por 5 min a 4 C 10. Secar el precipitado de RNA por 5 -10 min 11. Disolver el RNA en 50 L de agua libre de RNAsas, por mezcla con la pipeta o incubando por 10 min a 55-60 C. 12. Almacenar el RNA a -80 C hasta su cuantificacin y corrimiento electrofortico.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
Determine la calidad y concentracin del cido nuclecos Investigue que efecto tiene la solucin DEPC dentro del proceso de aislamiento de RNA Mencione que tipos de RNA existen en un tejido
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P RACTICA N O . 8 C UANTIFICACINDE RNA Y DNA

OBJETIVO
El alumno ser capaz de determinar la concentracin de DNA y RNA por espectroscopia.
INTRODUCCIN
Medir la concentracin de cidos nucleicos de alto peso molecular es difcil, cuando se trata realizar a travs de mtodos estndares. Esto es debido a que la solucin de DNA es usualmente viscosa, el problema se minimiza al realizar diluciones de la muestra en buffer TE pH 8.0 y mezclando vigorosamente. La absorbancia puede ser determinada a 260 y 280 nm. Una solucin con una A260 de 1 contiene aproximadamente 50 g de DNA/mL en tanto que para DNA de simple cadena o RNA A 260 equivale a un coeficiente de 38 g de RNA/mL.
MATERIALES
DNA, RNA Buffer TE o agua
PROCEDIMIENTO
1. Colocar 1 L del cido nuclecos a cuantificar y diluir con 89 L de agua. Mezclar bien. 2. Ajustar a 0.0 la lectura del espectrofotmetro a 260 y 280 nm con agua.
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3. Leer la absorbancia de la solucin a 260 y 280 nm. 4. Utilizar la relacin de 50 g/mL de DNA= 1 unidad de absorbancia a 260 nm y calcular la concentracin y pureza del DNA, en base a los principios estudiados en clase. 5. Utilizar la relacin de 40 g/mL de RNA= 1 unidad de absorbancia a 260 nm y calcular la concentracin y pureza del RNA, en base a los principios estudiados en clase.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
Evalue los datos obtenidos y reporte
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P RACTICA N O . 9 E LECTROFORESISDE DNA EN GELESDEAGAROSA

OBJETIVO
Analizar por electroforesis la calidad del DNA extrado.
INTRODUCCIN
Los cidos nuclecos pueden ser sujetos a tcnicas electroforticas a travs de geles de agarosa que pueden ser detectados por tincin y visualizacin por iluminacin con 300 nm de luz U.V. Los mtodos de tincin y visualizacin del DNA ms utilizados son bromuro de etidio y SYBR Gold. El bromuro de etidio fue sintetizado en los aos 50s en un esfuerzo para desarrollar fenantridina como un efectivo agente tipanocidal. Puede ser utilizado para la deteccin de cidos nuclecos de simple y doble cadena.
MATERIALES
DNA Buffer de corrida TAE Tris-Acetato EDTA (acetatos 0.04M, EDTA 0.01M, pH 8.0) Agarosa Buffer muestra Estndares de Peso molecular 1 Kb ladder Bromuro de etidio 1 mg/mL en agua Cmara de electroforesis
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Transiluminador de UV Cmara fotogrfica polaroid
PROCEDIMIENTO
1. Preparar una solucin de agarosa al 1% en buffer TAE. Disolver por calentamiento cuidando que no ebulla rpidamente y se derrame del matraz. 2. Una vez disuelta dejar que se enfri y vaciar en la placa de la unidad de electroforesis. Esperar a que solidifique. 3. Colocar el gel en la unidad de electroforesis horizontal. Agregar el buffer lentamente hasta cubrir el gel. 4. Cargar las muestras en los pozos del gel. 5. Conectar los electrodos a la fuente de poder. 6. Correr el gel en las condiciones indicadas; esto depende del tamao del gel ya que alto voltaje puede ocasionar que la agarosa se disuelva (en este caso 100 Volts constantes). 7. Fotografiar el gel utilizando pelcula instantnea y un transiluminador de luz ultravioleta (usar lentes de seguridad). 8. Analizar los resultados del gel. Estime los tamaos de los fragmentos de acuerdo a la migracin de los estndares y las muestras.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
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P RACTICA N O .10 E LECTROFORESISDE RNA EN GELESDEAGAROSA FORMALDEHIDO

OBJETIVO
Determinar la calidad del RNA aislado anteriormente
INTRODUCCIN
Despus del aislamiento de la muestras de RNA, la calidad de la preparacin aislada del RNA es evaluada por electroforesis en gel de agarosa. Aunque los resultados son principalmente cualitativos, se consigue informacin de la calidad del material. Dicho anlisis deber de realizarse en condiciones desnaturalizantes dado que el RNA tiende a formar extensivamente estructuras secundarias, lo cual dificulta su migracin. Un RNA intacto en un gel desnaturalizante deber observarse como un barrido donde encontraremos las bandas 28S y 18S rRNA (en muestras eucariotas). La subunidad 28S rRNA puede ser aproximadamente el doble de intensa que la 18S rRNA. Este ratio 2:1 (28S:18S) es un indicativo que el RNA esta intacto.
MATERIALES
Buffer 10X MOPS/EDTA: MOPS 0.2 M, acetato de sodio 50 rnM, EDTA 10 mM, pH 7.0 Yesterilizada en autoclave.
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Buffer muestra para RNA: 0.75 mI de formamida desionizada, 0.15 mI de MOPS lOX, 0.24 mI de forma1dehido,0.1 mI de agua tratda con DEPC, 0.1 mI de glicerol, 0.08 mI de azul de bromofenol al 10.% (p/v) Agarosa Estndares de tamaos conocidos Cmara para electroforesis horizontal Fuente de poder Cmara fotogrfica polaroid
PROCEDIMIENTO
1. Preparar un gel al 1% de agarosa en buffer MOPS IX libre deRNAsas. Para un volumen de 50 mI pesar 0.5 g de agarosa, agregar 43.5 mI de agua tratada con DEPC y 5 mI de buffer MOPS 10X en un matraz erlenmeyer libre de RNAsas. 2. Calentar en el microondas cuidando que no ebulla rpidamente y se tire del matraz. 3. Enfriar la solucin hasta 55C y agregar 2.05 mI de formaldehido al 37%, mezclar suavemente evitando la formacin de burbujas y vaciar a la placa libre de RNAsas. (Hacer este paso en la campana de humos, el formaldehido es txico. 4. Esperar 1 h antes de usar el gel. 5. Preparacin de la muestra: Calcular el volumen necesario para cargar 5-10 g de RNA en el gel. Aadir por lo menos 1 vol igual de buffer muestra. Lo ideal es tener 5 vol de buffer muestra/vol de muestra. Calentar a 65C por 15 min y colocar en el hielo. 6. Colocar buffer MOPS IX en la cmara de e1ectroforesis.El nivel del buffer debe de cubrir ligeramente el gel.
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7. Agregar 1-5 l de la solucin de bromuro de etidio (1.0 mg/mL) a cada muestra y cargar la muestra en el gel. Nota: antes de cargar las muestras, lave los pozos con el buffer de corrida. 8. Conectar a la fuente de poder. Nota: Este tipo de electroforesis genera mucho calor y afecta el buffer de corrida ocasionando cambios de pH y por lo tanto migraciones anmalas. Si va correr geles geles grandes, se recomienda recircular el buffer y utilizar un sistema de enfriamiento. 9. Correr la electroforesis en las condiciones adecuadas de acuerdo al tamao del gel. Seguir la migracin del azul de bromofenol hasta aproximadamente 75% del gel. 10. Visualizar las bandas con luz UV y tomar la fotografa. 11. Determinar los tamaos de las bandas ms abundantes.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
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P RACTICA N O . 11 S NTESISDEC DNA

OBJETIVO
Por medio de esta prctica el alumno ser capaz de sintetizar in vitro DNA complementario a partir de RNA.
INTRODUCCIN
La mezcla de RNAmensajero o bien RNA total se utiliza como molde para sintetizar una cadena de DNA complementario mediante una polimerasa dependiente de RNA, la transcriptasa inversa. Para la reaccin se necesita de un cebador y se aprovecha la presencia de la cola de Poli A en el lado 3del mRNA eucariotico. Tras la sntesis del cDNA se desnaturaliza el hibrido. El extremo 3forma una horquilla que sirve como cebador para la sntesis de la segunda cadena, lo cual en este caso pueda darse por medio de un fragmento de Klenow como en la transcriptasa inversa.
MATERIALES
RNA problema Oligo dt 50 mM dNTPs 10 mM Buffer RT 10X MgCl2 25 mM DTT 0.1 M RNAse OUT 40U
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RNAsa H SuperScript 200U Microtubos Incubadora
PROCEDIMIENTO
1. RNA Oligo (dt) 50 M dNTPs 10 mM Llevar con agua DEPC a 10 l 2.-Incubar a 65C por 5 min, y mantener en hielo por 1 min 3.-Preparar la siguiente mezcla, adicionando los componentes en el orden indicado. 10X RT Buffer 25 mM MgCl2 0.1 M DTT RNAse out(40U /l) Super Script III RT (200U/ l) 2 l 4 l 2 l 1 l 1 l Mezlcar los siguientes componentes 5 g 1l 1 l
4.-Adicionar 10 l de la mezcla de cDNA sntesis al tubo de reaccin mezclar suavemente y colectar por centrifugacin. 5.-Incubar a 50 C por 50 min. 6. Terminar la reaccin por incubacin a 85 C por 5 min, y mantener en hielo. 7. Colectar la reaccin por centrifugacin. Adicionar 1 L de RNAsa H a cada tubo e incubar por 20 min a 37 C. 8. La sntesis puede ser almacenada a -20 C. o ser utilizado inmediatamente para PCR.
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TEMASADEMOSTRAR
Transcripcin in vitro de RNA
RESULTADOS
Probar la sntesis de CDNA por PCR Defina la importancia de realizar un ensayo de RT-PCR a un gen problema? Se requiere de esta tcnica para diagnostico molecular de enfermedades como Dengue, o virus del nilo? Porque?
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R EACCIN EN CADENA DE LA P OLIMERASA

OBJETIVO
Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de amplificar segmentos especficos de DNA mediante PCR
P RACTICA N O . 12
INTRODUCCIN
Es una de las tcnicas ms utilizadas en el campo de la biologa molecular. Este mtodo fue propuesto a mediados de los aos 70s por Ghobind Khorana, sin embargo no su puso en marca pues Polimerasas termoestables no haban sido descritas y la sntesis de oligonucletidos era ms que un arte de la ciencia. Sin embargo la tcnica fue puesta en prctica 15 aos ms tarde por Kary Mullis, quien describi la amplificacin in Vitro de una copia de genes de mamfero usando polimerasa Klenow. PCR es una tcnica rpida y flexible, que permite la amplificacin del DNA, este interactivo proceso requiere de tres elementos como desnaturalizacin del templado por calor, alineacin de los oligonucletidos a las secuencias blanco de DNA y extensin de los primers alineados por una termoestable DNA polimerasa.
MATERIALES
50 mM MgCl2 Taq Polimerasa 2U/L 10 mM dNTPs
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20 mM Primer Sentido y Antisentido DNA Agua estril Termociclador Tubos para PCR Pipetas
PROCEDIMIENTO
1. En un microtubo de 0.2 mL para PCR, adicionar todos los reactantes, mezclando con el agua perfectamente. DNA10ng MgCl2 50 mM * dNTPS 10 mM* P. Sentido 20 mM P. Antisentido 20 mM Taq Polimerasa 2U/L* Agua Volumen final X L 1.5 L 1.0 L 1.0 L 1.0 L 1.0 L X L 25 L
*Si se cuenta con master mix 2X Promega, estos reactivos pueden sustituirse por 12.5 L de la muestras. 2. Colocar los tubos en la centrifuga y dar un pulso 3. Calentar los tubos a 95 C por dos minutos 4. Correr las reacciones bajo el siguiente programa: 5. 94C por 45 seg, T.M de los primers por 1 min y 68C por 2 min, durante 30 ciclos, programar una extensin final a 68C durante 10 min y por ultimo mantener la reaccin a 4C. 6. Para estimar el producto de la reaccin examinar 5 L en un gel de electroforesis de agarosa al 2%
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7. Fotografiar el gel con ayuda de un transilumnidar 8. Estimar el producto de la reaccin de PCR comparando la intensidad de las bandas con el marcador de peso molecular utilizado en la electroforesis.
TEMASADEMOSTRAR
Amplificacin del DNA
RESULTADOS
Determine los productos de amplificacin Explique su gel de electroforesis Calcule los tamaos de sus bandas
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A ISLAMIENTODEUNFRAGMENTO DE DNA APARTIRDEUN SOPORTESOLIDO

OBJETIVO
El alumno utilizara sus conocimientos y adiestramiento en tcnicas de biologa molecular para recuperar un fragmento de DNA partir de un gel electrofortico.
P RACTICA N O . 13
INTRODUCCIN
La purificacin de bandas requiere el uso nde agentes caotropicos que desnaturalizan las protenas, disuelven la agarosa y promueven la unin de DNA de doble cadena (100 bp a 48 kb)a una matriz de vidrio. Una vez que el DNA es capturado, protenas y sales contaminantes son lavadas y el DNA purificado es eluido en un buffer de baja fuerza inica (TE o agua).
MATERIALES
Buffer de captura*, Buffer purificacin de DNA* de lavado*, Columnas para
Baos de agua, Incubadora, Pipetas, Microtubos *Componentes del Kit Ilustra GFX PCR DNA and gel elute GE MR cat 27-9602-01.
PROCEDIMIENTO
Pesar un microtubo limpio y estril.
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Exponer el gel, rpidamente en el transiluminador y cortar con ayuda de una navaja limpia, la banda de inters, colocarla en el tubo, limpio y volver a pesar. Por diferencia de pesos determinar el peso real de la banda. De acuerdo al peso estimado, adicionar 300 L de buffer de captura por cada 300 mg de gel. Cerrar el tubo, mezclar vigorosamente e incubar a 60 C por 515 min, hasta que la agarosa se haya disuelto. Transferir la muestra a una columna de purificacin e incubar por 1 min. Centrifugar por 30 seg a 10000 rpm, descartar el buffer centrifugado. Adicionar a la columna 500 L de buffer de lavado, centrifugar por 30 seg a 10000 rpm Colocar la columna en un tubo limpio y adicionar agua estril para la elusin 50 L, para eluir el DNA en forma concentrada, disminuir el volumen de agua a no menos de 10 L Incubar la muestra a temperatura ambiente por 1 min Centrifugar por 30 seg a 10000 rpm para recuperar el DNA purificado.
TEMASADEMOSTRAR
Aislamiento de DN A
RESULTADOS
Describa sus observaciones Que caractersticas fsicas y qumicas tiene la agarosa que permite purificar DNA? Investigue el material y principio de las columnas que se utilizan en estos procesos?
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Porque este tipo de tcnicas no pueden utilizarse para otras molculas como protenas?
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P RACTICA N O . 14 L IGACINDEPRODUCTOSDE PCR AUNVECTORDECLONACIN

OBJETIVO
Obtener un DNA recombinante mediante el proceso de ligacin del material gentico a un vector de clonacin.
INTRODUCCIN
La tecnologa del DNA recombinante es un campo relativamente extenso de la Biologa molecular que ha permitido realizar grandes avances en el conocimiento de la estructura y funcin del material hereditario. Comprende un conjunto de tcnicas que permiten realizar el anlisis estructural y fisiolgico de los elementos genticos. Destacamos los diferentes pasos a seguir en un experimento de clonado de DNA por medio de plsmidos bacterianos. Un experimento de clonado de DNA consiste, esencialmente, en extraer de un contexto gentico y celular complejo, grande y poco conocido un fragmento de DNA de inters, y colocarlo en un contexto sencillo y bien conocido. Desde el punto de vista molecular, el DNA de inters se inserta en un vector., para llevar a cabo este proceso se requiere de la Ligacin con DNA ligasa de los DNAs productos de una amplificacin por PCR o de la digestin de un DNA. stos se mezclan y se les aade DNA ligasa. De este modo, se obtienen molculas recombinantes integradas por el vector ms un inserto.
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MATERIALES
Incubadora Microtubos Micropipetas pGEM-T Vector (50ng/L)* Inserto (DNA ~4 ng/L) T4 DNA ligasa100U * Buffer de ligacin rpido 2X *
* Reactivos contenidos en el Kit pGEM-T Easy Vector System II Promega A 1380.
PROCEDIMIENTO
1.-Centrifugar los tubos conteniendo el Vector rpidamente para mantener el contenido de estos en el fondo. 2.-Mezclar el buffer de ligacin 3.- Realizar la mezcla de la siguiente forma: Buffer de Ligacin 2X DNA ligasa 3U/L Vector pGEM 50 ng DNA 5L 1L 1L XL ___________ 10 L *Llevar a un volumen de 10L con agua desionizada 4.- Mezclar la reaccin por pipeteo e incubar por una hora a temp amb, alternativamente si se requiere obtener un nmero mayor de recombinantes incubar por toda la noche a 4C.
TEMASADEMOSTRAR
Tecnologa del DNA recombinante
RESULTADOSYCONCLUSIN
Documentar sus observaciones
Describa porque es importante mantener control de la temperatura, si la reaccin se lleva a cabo por toda la noche? Describa el modo de accin de las T4 DNA ligasas Uno de los ms estudiados y utilizados vectores para propsitos generales ha sido el llamado pBR322, dibuje el mapa gentico del vector e identifique los elementos con que cuenta y para qu sirven.
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P REPARACINDECLULAS
OBJETIVO
Elaborar clulas competentes utilizando CaCl2
P RACTICA N O . 15
QUMICAMENTECOMPETENTES
INTRODUCCIN
Para los experimentos de DNA recombinante se requiere de la insercin del DNA a una clula hospedera. En bacterias el proceso de introducir DNA dentro de la clula es llamado transformacin. Para E. coli uno de los mtodos de transformacin requiere que las clulas sean tratadas con un rgimen de alta temperatura y cloruro de calcio (CaCl2). El mecanismo de accin del CaCl2 es asumido que la pared de la clula bacteriana es fragmentado lo cual va a permitir que el DN A entre al interior de la clula, por ello se dice que son competentes. Para E. coli la competencia debe ser inducida, en tanto que para otras bacterias esto ocurre naturalmente y algunas veces puede ser inducido por el uso especfico de medios de cultivo o condiciones de crecimiento. Para bacterias que son resistentes a la competencia qumica o no son naturalmente competentes, otros sistemas pueden ser utilizados, como la competencia por pulsos elctricos (electroporacin).
MATERIALES
Colonia de E. coli Medio LB
CaCl2 Tubos Falcon de 50 mL Todos los materiales y reactivos deben de estar en condiciones estriles.
PROCEDIMIENTO
1. Inocular una colonia de E. coli en 50 mL de medio LB, crecer durante toda la noche a 37C con agitacin moderada (250rpm). Transferir la colonia en 100 mL de caldo LB o medio SOC en un matraz de 1 L. Incubar el cultivo por 3 hrs a 37C con vigorosa agitacin, monitoreando la densidad ptica del cultivo a 600 nm. (Para una eficiente transformacin, es esencial que el nmero de clulas viables no exceda de 10 8 cel/mL, lo cual en la mayora de las E. coli es equivalente a una OD600 de 0.4. 2. Transferir las clulas a un tubo de 50 mL estril y frio. Enfriar los cultivos a 0 C mantenindolos en hielo 10 min. 3. Recuperar las clulas por centrifugacin a 2700 g por 10 min a 4C. 4. Decantar el medio del pellet celular. Mantener los tubos en posicin invertida sobre una toalla de papel por un minuto para evitar trazas del medio. 5. Resuspender el pellet en 30 mL de solucin (MgCl2 80 mM, CaCl2 20 mM) fra. 6. Recuperar las clulas por centrifugacin a 2700 g por 10 min a 4C. 7. Decantar el medio del pellet celular. Mantener los tubos en posicin invertida sobre una toalla de papel por un minuto para evitar trazas del medio. 8. Resuspender el pellet en 2 mL de solucin de CaCl2 0.1 mM fra, por cada 50 mL del cultivo original.
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9. En este punto las clulas pueden ser utilizadas para transformacin o bien almacenadas en alcuotas para su almacenamiento a -70 C. 10. Adicionar 34 l de glicerol 100% v/v estril a las alcuotas de 166 l de la solucin de clulas competentes, dando una concentracin final de 17% de glicerol.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOSYCONCLUSIN
Documentar sus observaciones
Mencione 5 de las principales cepas de E. coli que se utilizan para los fines de transformacin. Desarrolle brevemente el principio de la electroporacin y cules son las condiciones que se requieren para llevar a cabo dicho proceso. Describa cuales son los puntos clave para que las clulas no pierdan eficiencia.
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PRACTICANO.16 T RANSFORMACINBACTERIANA EN E. COLI

OBJETIVO
El alumno evaluara el proceso de incorporar DNA extrao a una clula de E. coli.
INTRODUCCIN
La transformacin es el proceso en el que las clulas procariontes toman DNA exgeno del ambiente, alterando a su fenotipo y el de sus descendientes. En general la entrada del DNA a las clulas es independiente de la fuente del DNA (o de sus secuencias), pero es muy dependiente del estado fsicoqumico del DNA (tamao, hebra simple o doble, lineal o circular, relajado o superenrollado). La eficiencia con la que la clula blanco tima el DNA exgeno vara ampliamente entre especies procariticas y dentro una especie, de las cepas. Algunas especies pueden ser manipuladas en el laboratorio para incrementar la eficiencia con la que toman el DNA. Las clulas pre-tratadas que toman el DNA ms eficientemente se dice que son competentes. El efecto que tiene el DNA al entrar en una clula blanco y en los descendientes depende completamente de la secuencia especfica del DNA exgeno. El DNA exgeno pasar a la descendencia slo si este se integra en el material gentico de la clula blanco o si el mismo tiene un origen de replicacin (ori), que funcione en la clula blanco. Transformaremos clulas de E. coli para demostrar la habilidad de este DNA para modificar permanentemente la herencia gentica de las clulas que lo adquieren. Se transformar con un plsmido que
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contiene su propio ori y un gen de resistencia a antibitico. Las clulas blanco que adquieran el plsmido se transformarn, de un fenotipo sensible al antibitico, a otro, resistente al antibitico. Despus de mezclase con el plsmido, encontraremos a las clulas resistentes al antibitico sembrando las clulas tratadas sobre cajas de agar que contienen antibiticos. El antibitico matar cualquier clula que no adquiero al plsmido.
MATERIALES
Medio LB Reaccin de ligacin Clulas competentes Placas LB-agar Antibitico IPTG X-Gal
PROCEDIMIENTO
Nota: Es necesario trabajar con mucho cuidado para mantener la esterilidad y no contaminar las muestras.
1. Cada grupo tomar dos tubos con 200 l de clulas competentes para la transformacin. Los tubos debern conservarse sobre hielo. 2. Adicionar 2 l de la reaccin de ligacin slo a uno de los tubos. Los dos tubos se incubarn 30 minutos sobre hielo. (El tubo al que se le agreg el DNA es el experimento y al que no se le agreg nada es el control negativo). 3. Colocar ambos tubos en un bao de agua a 42C por 90-120 segundos. Remover el tubo inmediatamente hacia el hielo e
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incubarlo otros 5 minutos (Al finalizar este paso el DNA presente debi entrar en algunas clulas). 4. Adicionar 900 l de LB o medio SOC a cada tubo resupendiendo suavemente las clulas. Incubar 30-60 min, esto permitir a las clulas recobrarse del trauma del tratamiento de competencia y empezar la expresin de los genes funcionales recin introducidos. 5. Despus de la incubacin, resuspender las clulas de ambos tubos y sembrar por separado 100 l de cada uno en cajas con LB, conteniendo el antibitico al que confiera resistencia el plsmido (generalmente 50g/ml) y suplementadas con 100 L de 100mM IPTG y 20 L de 50 mg/mL y esparcir uniformemente sobre el agar con una varilla de vidrio doblada como bastn de hockey esterilizada mediante flameo con alcohol. 6. Pipetear 1.98 ml de medio LB en cuatro tubos estriles y arreglar en dos hileras de tubos. 7. Agitar en vortex el tubo con el cultivo tratado con el plsmido e inmediatamente pipetear 20 l en el primer tubo de la primera serie y agite vigorosamente. Este tubo contendr la dilucin 1 a 100. Cambiar la punta de la pipeta e inmediatamente pipetear 20 ml de esta dilucin 1:100 al segundo tubo y agitar vigorosamente. Se realizaron dos diluciones seriales 1:100. Cul es la dilucin final en el segundo tubo? Ahora repita las diluciones con el tubo del control negativo. 8. Agitar la dilucin final y pipetear 100 l de clulas diluidas en cajas con LB mrquelas como transformadas. Untarlas en la superficie de la placa con la varilla de vidrio esterilizada. Repetir el procedimiento para la dilucin final del tubo del control negativo y marcar.
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9. Incubar las placas a 35-37 C toda la noche y revisar si hay crecimiento al otro da. Contar el nmero de colonias en las cajas con LB-antibitico.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
Cuente el nmero de colonias en las dos cajas con LB. Debera ser el nmero de colonias en estas dos cajas similar? Cuntos ml requieren agar y de esos cuntos ampicilina? Llene la siguiente tabla
Control # colonias Factor de dilucin Clulas suspendidas (cels/ml) # colonias
Transformadas Factor de dilucin Clulas suspendidas (cels/ml)
Calcular la proporcin del control de clulas transformadas (#clulas no transformadas / total de clulas = ________ Calcule la proporcin de clulas transformadas (#clulas transformadas / total de clulas = ________ Porque se tiene la presencia de colonias blanca y azules?
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A NLISISDECOLONIAS RECOMBINANTESPOR PCR

OBJETIVO
P RACTICA N O . 17
El alumno ser capaz de analizar la presencia de inserto producto de un proceso de clonacin.
INTRODUCCIN
La tecnologa de DNA recombinante requiere de una batera de procedimientos experimentales usados para aislar piezas de DNA que contienen especficos genes. En este caso el aislamiento de la colonia por el toque a travs de un palillo, es de los mtodos ms sencillos para poder evaluar la presencia de un recombinante presente en ese DNA, no requiere de cultivo previo, la tcnica acoplada a PCR utilizando oligonucletidos especficos contenidos en el vector permite el anlisis del inserto correspondiente.
MATERIALES
Colonias en placa Palillos estriles Placas LB + antibitico Agua estril Tubos de PCR Master Mix 2X (Contiene Taq Polimerasa 2U, Buffer PCR 10X, dNTPs 10 mM) Primers 20 mM
PROCEDIMIENTO
1. Tomar parte de la colonia con un palillo estril 2. Transferir el material a un tubo conteniendo 35 L de agua estril en un tubo 3. Realizar una siembra en un sector de la placa utilizando el material restante en el palillo 4. Preparar la reaccin utilizando las siguientes condiciones: Master mix Primer FW Primer RV Agua inoculada con la colonia 10.5 L 1.0 L 1.0 L 12.5 L
5. Amplificar utilizando las siguientes condiciones de corrida 35 ciclos a 1 min 95 C, 2 min a 50 C ( o a la tm de los primers -5 C), 2 min.
6.
Analizar 10 L de la reaccin de PCR en gel de agarosa
TEMASADEMOSTRAR
Tecnologa del DNA recombinante_Clonacin
RESULTADOS
Determine la presencia de insertos Explique su gel electrofortico Describa porque es importante crecer la colonia en medio de cultivo una vez diluida en agua para el mtodo de PCR. Que otra tcnica puede utilizar para analizar la presencia de un recombinate? Cual considera metodologa?
ud
que
son
los
riesgos
de
esta
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P RACTICA N O . 18 A ISLAMIENTODE DNA PLASMDICO

OBJETIVO
Aislar DNA plasmidico a partir de un cultivo lquido de E. coli transformada.
INTRODUCCIN
Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico circular y generalmente de tamao pequeo que se localiza en bacterias y que puede ser replicado independientemente. Tiene un inters peculiar dado que son producidos mediante ingeniera gentica como producto de una clonacin. El proceso de aislamiento es conocido como Mini Preps, debido a que es preparado de pequeas proporciones de cultivo de bacterias las cuales contienen el plsmido. La bacterias debe ser lisada con una solucin conteniendo dodecil sulfato de sodio e hidrxido de sodio, lo cual desnaturaliza protenas y DNA cromosomal. La mezcla es neutralizada con acetato de sodio, la mayora del DNA cromosomal y protenas son precipitadas y removidas por centrifugacin, por lo cual el DNA plasmdico es recuperado en la fase sobrenadante y precipitado con etanol, para su posterior anlisis.
MATERIALES
Plsmido Solucin I (Glucosa 50mM, Tris-HCL pH 8.0 25 mM, EDTA 10mM) Solucin II (NaOH 0.2 N, SDS 1%) Solucin III (Acetato de Potasio 5M) Etanol, Isopropanol
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Caldo LB Ampicilina
PROCEDIMIENTO
1. Inocular 5 mL de caldo LB estril conteniendo ampicilina 100 ug/mL, con 10 ml de muestra. Incubar en agitacin hasta obtener un cultivo en fase estacionaria por lo menos 8 hrs. 2. Centrifugar 1.5 mL de cultivo en un microtubo a 10,000 rpm x 3 min, retirar el sobrenadante y colocar ah mismo otros 1,5 mL de cultivo, repetir este proceso, hasta haber centrifugado todo el material. 3. Resuspender las clulas en 250 L de solucin 1, mezclando bien 4. Adicionar 250 L de Solucin 2, esperando 5-10 min hasta que este transparente. 5. Adicionar 250 L de solucin III (fra) y mantener en hielo por 10-15 min. 6. Centrifugar a temperatura ambiente por 10 000 rpm x 10 min 7. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio (700 L) 8. Adicional 500 L de Isopropanol a temp. Ambiente, agitar, suavemente 9. Centrifugar 30 min a 10,000 rpm 10. Remover el sobrenadante y lavar el pellet con 500 L de etanol fri al 70% 11. Centrifugar por 5 min y remover el etanol 12. Decantar y dejar secar, colocando el tubo, boca abajo y dejarlo por 5 min a temp. amb. 13. Resuspender en 50 L de agua estril. 14. Evaluar el DNA mediante gel, PCR o digestin enzimtica.
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TEMASADEMOSTRAR
Tecnologa del DNA recombinante_Caracterizacin de plasmidos
RESULTADOS
Evaluar la calidad del material nucleco por espectrofotometra y anlisis en gel.
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P RACTICA N O . 19 D IGESTINDE DNA PLASMDICO

CONENDONUCLEASASDE RESTRICCIN
OBJETIVOS
Digerir DNA plasmdico con diferentes enzimas de restriccin.
INTRODUCCIN
Muchos de los cambios que se han llevado a cabo en las ciencias biolgicas pueden ser atribuidos a la habilidad para manipular el DNA. La herramienta ms importante para la ingeniera gentica son las enzimas que catalizan especficas reacciones en el DNA. Primeramente el corte se da en sitios limitando a obtener un mapa fsico de DNA. Segundo, la habilidad para producir especficamente fragmentos de DNA haciendo posible purificar estos fragmentos por clonacin molecular. Existen dos tipos de enzimas de restriccin. Las del tipo I son complejos enzimticos grandes con capacidad de modificar mutilar y colar el DNA. Probablemente sirven para proteger las clulas de la invasin de DNA extrao. Las endonucleasas de restriccin del tipo II reconocen secuencia cortas de DNA y rompen el DNA en sitios especficos dentro o adyacente a secuencias de reconocimiento, las secuencias son generalmente, pero no siempre 4 a 6 nucletidos en longitud y son usualmente caracterizados por una simetra. El corte puede producir diferentes tipos de extremos en la molcula produciendo extremos parejos o disparejos produciendo extremos cohesivos.
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Algunos factores que deben de tomarse en cuenta para una digestin son pureza del DNA, grado de mutilacin y condiciones de buffer.
MATERIALES
Buffer de reaccin (10X) para las digestiones Buffer muestra 6X para terminacin de reaccin y de carga paraelectroforesis6X:0.25% azul de bromofenol, 0.25% xilencianolFF 30% Glicerol DNA plasmdico Agua destilada estril Enzimas de restriccin Nota: Para la mayora de las enzimas de restriccin comerciales, una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir completamente 1 g de pBR322 o de DNA del bacterifago lambda) en una hora bajo las condiciones apropiadas de reaccin y generalmente a 37C. La digestin del DNA es afectada por la pureza del DNA y el nmero de sitios de restriccin presentes en el mismo. En ocasiones es necesario extraer la solucin de DNA otra vez (y a veces ms) con fenol y cloroformo para eliminar las protenas, seguido por precipitacin con etanol para remover los solventes orgnicos, las sales y finalmente precipitar el DNA.
Bao de agua o incubadora a 37C.
PRECAUCIONES: Siempre use puntas nuevas y estriles para tomar cada una de las enzimas. Evite la contaminacin de las soluciones, del DNA y
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de las enzimas usando una punta nueva para la toma de cada componente.
PROCEDIMIENTO
1. Utilizar micropipeta y microtubos de 1.5 mL estriles para hacer las siguientes digestiones. Todas las soluciones y los tubos de reaccin se mantienen en hielo hasta el momento de iniciar la digestin. Agregar los componentes de la reaccin en forma ordenada como se indica. Mezclar los componentes de las reacciones por agitacin suave del microtubo con la punta de los dedos. Incluir un control sin digerir para cada una de las reacciones, para este paso, agregar todos los componentes en el mismo orden, excepto la enzima, mezclar como lo hizo anteriormente y parar la reaccin inmediatamente despus con buffer muestra para electroforesis. Evitar introducir burbujas de aire por agitacin demasiado vigorosa.
Cada reaccin deber de tener los siguientes componentes. Agua bidestilada estril Buffer 10X Enzima de restriccin DNA a digerir Volume total ____L ____L ____L ____L _50_L
2. Colocar los tubos a digerir a 37C e incubar por 1.5 hr. Mantener los tubos control (sin digerir) a -20C o en hielo.
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3. Transferir una alcuota de 0.5 g del DNA plasmdico a otro tubo, agregar buffer de carga para analizar por electroforesis en geles de agarosa. 4. Guardar los tubos conteniendo el resto de DNA a -20C.
TEMASADEMOSTRAR
Tecnologa del DNA recombinante _ Mapas de restriccin
RESULTADOS
Defina el mapa de restriccin del proceso utilizado. Describa 5 enzimas que presenten sitios rasurados y 5 con sitios cohesivos. Mencione 5 factores que interfieran en la digestin enzimtica de un DNA y explique porque interfieren.
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I NTRODUCCINALA B IOINFORMTICA
OBJETIVO
P RACTICA N O . 20
Aplicacin del uso de las herramientas bioinformticas accesibles en el Internet para el estudio de protenas y los genes que las codifican.
INTRODUCCIN
La biologa computacional est creciendo rpidamente y el nmero y variedad de mtodos computacionales utilizados para el anlisis de secuencias de DNA y protenas aumenta cada da. El conocimiento de los algoritmos y su aplicacin tienen alto valor para las compaas biotecnolgicas y para los investigadores. Por ello, se hace necesario conocer las principales herramientas de la Bioinformtica y aprender a utilizarlas en la resolucin de problemas biolgicos. Nuevas tcnicas y demostraciones de su uso, son presentadas para mantener al alumno en el estado del arte de esta disciplina.
MATERIALES
Secuencias: NP_035564 AAS65790, NP_003113, Q39837, BAA99079,
PROCEDIMIENTO
1. Conocer la pgina NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 2. Explorar y PUBMED, BLAST, Books y all bases. 3. Elija 3 secuencias de las proporcionadas
4. Busque la secuencia que le fue asignada a travs de su nmero de acceso del banco de datos NCBI. 5. Asigne identidad a la secuencia. 6. Determine mediante esta pgina http://ca.expasy.org/ i.Peso molecular ii.Punto isoelctrico iii.Contenido de aminocidos iv.Mencione en que ORF se localiza v.Describa que tipo de estructura secundaria presenta 7. Determine el sitio de corte del pptido seal (si es que se presenta). http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 8. Explore la liga de Human genome resuorce 9. Conozca las herramientas para el diseo de primers http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi 10. Conozca las herramientas para poder estudiar filogenia 11. http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.ht ml
TEMASADEMOSTRAR
Anlisis Bioinformticos
RESULTADOS
Para su reporte explore una liga de las bases analizadas y arme un ejercicio con forme a lo aprendido en esta seccin. Describa en media cuartilla la importancia que tienen la bioinformtica en relacin con el estudios de los genomas.
BIBLIOGRAFA
Ausbel F., Brent R., Kingston R.E., Moore D., Seidman J., Smith J.A., Struhl, K. 1995. Current Protocols in Molecualr Biology. John Wiley & Sons, Inc. Devlin T. 2000. Bioquimica:Libro de texto con aplicaciones clnicas. 3 Edicin. Revert. Madrid, Espaa. Glick B. y Pasternak J. 2003. Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA. American Society for Microbiology. Washington D.C. Harlow Ed. 1988. Antibodies a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York. Ruvinsky A., Marshall, J. 2005. Mammalian Genomics. CABI Pub, Cambridge, MA, USA. Sambrook J. y Rusell D. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. 3a Edicin. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Pag.69

Biologia Molecular

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS BIOLOGA MOLECULAR

Ciudad Jurez, Chihuahua Universidad Autnoma de Ciudad Jurez 2011 p. 69

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

ManualdePrcticasdeLaboratorio BiologaMolecular Dra.FlorindaJimnezVega

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P RACTICA N O . 2 D ETERMINACINDE P ROTENAS PORLA T CNICADE B RADFORD

C2 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4

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P RACTICA N O . 3 E LECTROFORESISEN G ELESDE P OLIACRILAMIDA DESNATURALIZANTES SDS PAGE

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500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4C en la obscuridad. Vida media 30 das.

B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 Tris base Agua destilada 54.45 g 150 mL

C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 Tris base Agua destilada 6.0 g 60 mL

E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio

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100 mg de sulfato de amonio. Adicionar 1 mL de agua destilada, preparar en el momento.

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Gel Separador (Separating) (10 mL)

4.0 mL 2.5 mL 3.3 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.004 mL

Gel Concentrador (Stacking) (4mL)

2.7 mL 0.5 mL 0.67 mL 0.04 mL 0.10 mL 0.004 mL

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T INCINDE G ELESDE P OLIACRILAMIDAPOR C OOMASSIE B LUE

El alumno evaluara el proceso para la deteccin de protenas en gel.

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P RACTICA N O . 5 E XTRACCINDE DNA UTILIZANDO DNAZOL

DNAzol Puntas, micropipetas, microtubos

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8. Almacenar el DNA a -20 C hasta su cuantificacin y corrimiento electrofortico.

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P RACTICA N O . 6 E XTRACCINDE DNA UTILIZANDO F ENOL C LOROFORMO A LCOHOL ISOAMILICO

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P RACTICA N O . 8 C UANTIFICACINDE RNA Y DNA

Evalue los datos obtenidos y reporte

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P RACTICA N O . 9 E LECTROFORESISDE DNA EN GELESDEAGAROSA

Transiluminador de UV Cmara fotogrfica polaroid

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P RACTICA N O .10 E LECTROFORESISDE RNA EN GELESDEAGAROSA FORMALDEHIDO

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P RACTICA N O . 11 S NTESISDEC DNA

RNAsa H SuperScript 200U Microtubos Incubadora

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R EACCIN EN CADENA DE LA P OLIMERASA

ManualdePrcticasdeLaboratorio BiologaMolecular Dra.FlorindaJimnezVega

A ISLAMIENTODEUNFRAGMENTO DE DNA APARTIRDEUN SOPORTESOLIDO

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P RACTICA N O . 14 L IGACINDEPRODUCTOSDE PCR AUNVECTORDECLONACIN

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Documentar sus observaciones

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