Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

Generalidades
(Lo que se debe saber antes de realizar este metodo :) El trmino moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la elaboracin de algunos alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la descomposicin de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibiticos, o la exposicin del alimento a la irradiacin. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacridos, cidos orgnicos, protenas y lpidos. Tambin pueden causar problemas a travs de: (a) sntesis de metabolitos txicos (micotoxinas)

(b) resistencia al calor, congelamiento, antibiticos o irradiacin (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Pueden tambin causar malos olores y sabores y la decoloracin de las superficies de alimentos.

Fundamento
El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo especfico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los polisacridos que contiene el medio. La hidrlisis de estos compuestos se efecta por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH cidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. As mismo, la acidificacin permite la eliminacin de la mayora de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubacin a una temperatura de 25 C da como resultado el crecimiento de colonias caractersticas para este 1 tipo de microorganismos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estril a. 3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estriles con tapn de algodn a. 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosaa . 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta a.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Solucin colorante de lactofenol azul de algodn b. Colorantes para tincin de Gram b. Solucin estril de cido tartrico al 10.0 % a

MATERIAL Y EQUIPO Vaso de licuadora estril o bolsa para Stomacher

Motor para licuadora o Stomacher Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn Pipetas Pasteur estriles Propipeta. Cajas de Petri estriles (una se utiliza para pesar la muestra) Utensilios estriles para la manipulacin de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc. Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 251C Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica mantenida a 451C Portaobjetos, cubreobjetos, diurex Microscopio ptico Asa bacteriolgica y asa micolgica Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador

PROCEDIMIENTO
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%. 2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora estril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la licuadora a velocidad mnima, 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal. Esta es la dilucin primaria. 3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operacin tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe tilizar una pipeta estril para cada dilucin. NOTA Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cmulo de hifas. Debido a esto, el nmero de UFC/mL uede variar dependiendo de las condiciones de homogeneizacin de la muestra (a mayor tiempo de homogeneizacin mayor ser la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentaran las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneizacin citados en esta metodologa son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para este grupo microbiano. 4. Colocar por duplicado en cajas Petri estriles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estril.

5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estriles. Enfriarlos y mantenerlos a 45C. 6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4 mL de cido tartrico al 10% esterilizado por filtracin en membrana, o bien esterilizar la solucin a 121C1C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45C se le deber adicionar 0.3 mL del cido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo precaucin de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo. 7. Despus de la acidificacin, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potencimetro. 8. En cada caja de Petri con inculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45C. El tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min. 9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrs hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejndolas reposar sobre una superficie horizontal fra. 10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verter en una caja de Petri sin inculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Despus de la incubacin estas cajas no debern presentar desarrollo de colonias. 11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 251C. 12. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. Despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificacin de 4 das de incubacin o incluso las de 3 das. En este caso, se informa el perodo de incubacin en los resultados de los anlisis. 13. Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodn, para un examen microscpico y una posible identificacin de los mohos que se hayan desarrollado. 14. Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las levaduras obtenidas. 15. Contar las colonias de cada placa representativa, despus de 3, 4 y 5 das de incubacin (a 26 1C o a temperatura ambiente).

16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 251C durante 5 das. 18. Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada. 19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difcil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 das de incubacin y an a los 3 das. En este caso se debe informar el periodo de incubacin de 3 4 das, en los resultados del anlisis.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a continuacin se expresan:

ANLISIS CUANTITATIVO
Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este anlisis, se deben seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadstica). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el nmero de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado fsico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el nmero de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilucin correspondiente a esa caja. En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se debe reportar el nmero obtenido de UFC indicando la dilucin correspondiente. En el caso de no encontrar colonias caractersticas de hongos y/o levaduras, el resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g bien menos de 10 UFC/mL (Sensibilidad del Mtodo) Para cualquiera de los casos citados se deber reportar el tiempo de incubacin en el que se realiz la cuantificacin. Para cualquiera de los casos citados se deber reportar por separado el resultado de la cuantificacin de hongos y de levaduras. Reportar las observaciones macroscpicas y microscpicas de los diferentes tipos de colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el anlisis. Si es posible reportar el o los gneros probables.

Conclusin
Bueno como bien sabemos los mohos y levaduras son microorganismos inteligentes que tienen un gran provecho en los diversos componentes qumicos de la carne (como carbohidratos, cidos orgnicos, protenas, sales, etc.) as como tambin en agentes fsicos (pH, temperatura, humedad, exposicin a la irradiacin, etc). Lo cual logran producirse principalmente en estos alimentos crnicos, utilizando como nutrientes a los polisacridos que contenga el medio para la muestra en este mtodo de determinacin con una acidificacin (pH 3.5) que nos indicara las presencia de estos microorganismos. as como las condiciones anaerobias y la incubacin a una temperatura adecuada nos brindaras las evidencia de la presencia de mohos y/o levaduras; Claro contando los materiales de laboratorio, soluciones, medios de cultivos, reactivos y indicadores que nos sealan y nos facilitaran esta evidencia tambin no hay que olvidar un uso y un seguimiento responsable del proceso de esta determinacin para continuar con un calculo de los resultados del procedimiento para realizar as su anlisis y concluir , en las colonias presentes y numero de hongos y levaduras en UFC (Unidades Formadoras de Colonias) en cada gramo y/o mililitro de la muestra para conocer el resultado definitivo.

BIBLIOGRAFA.

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