NOVEMBRE 2005

ANNO 44 - N. 452
ISSN 0019-901X

Poste Italiane spa - Sped. in A.P. - D.L. 353/2003 (Conv. in L. 27/02/2004 n 46) art. 1 comma 1 DCB TO - n. 11/2005 - I.P.

CHIRIOTTI

EDITORI

10064 PINEROLO - Tel. 0121 393127 - Fax 0121 794480 - E-mail: info@chiriottieditori.it

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SUMMARY
The aim of this work is evaluating the effect of the monovarietal olive oil storage at different temperatures as regards phenolic fraction and oxidative stability of samples. In a previous research work, the AA demonstrated that the amount of olive oil phenolic compounds signicantly decreased after a storage at 43C for one month. It has been highlighted a positive correlation between the phenolic fraction decrease and the oxidative stability of the olive oils. However, in this experimental work the olive oil samples are stocked at 4 and -18C and compared with reference samples stored at room temperature. As a matter of fact these temperatures can be compared to storage conditions during winter.

MATTEO BONOLI-CARBOGNIN - LORENZO CERRETANI* ALESSANDRA BENDINI - TULLIA GALLINA TOSCHI GIOVANNI LERCKER
Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Universit di Bologna - Piazza Goidanich 60 47023 Cesena - FC - Italia *e-mail: lorenzo.cerretani2@unibo.it

Prove di conservazione a diversa temperatura di olio da olive monovarietali

The case of monovarietal olive oil: storage test at different temperature
Parole chiave: olio doliva, stabilit ossidativa, fenoli, conservazione, temperatura Key words: olive oil, oxidative stability, phenols, storage, temperature

SOMMARIO
Questa sperimentazione, condotta su oli extravergini di oliva monovarietali, ha la nalit di valutare gli effetti che la conservazione dellolio, in diverse condizioni termiche, ha sulla componente fenolica e sulla stabilit dei lipidi nei confronti delle reazioni ossidative. In un nostro precedente lavoro di ricerca stato, infatti, dimostrato come la quantit di composti fenolici presenti negli oli extravergini di oliva vada incontro ad un signicativo decremento, a seguito di uno stoccaggio del prodotto alla temperatura di -43C, seppur mantenuta per un periodo di tempo limitato (un mese) e non confrontato con un campione di controllo mantenuto a temperatura ambiente. Nellattuale piano sperimentale lolio stato invece conservato alle temperature di 4 e -18C, ponendo come riferimento lo stesso prodotto mantenuto a temperatura ambiente. Tali condizioni termiche risultano, infatti, pi vicine a quelle che possono essere realmente raggiunte quando lolio viene conservato durante la stagione invernale.

INTRODUZIONE
Durante la conservazione, nellolio avvengono alcune trasformazioni ossidative che portano ad un deterioramento qualitativo del prodotto. stato ampiamente dimostrato come lautossidazione causi, da una parte, la perdita di importanti componenti da un punto di vista dietetico e nutrizionale (Frankel, 1980) e dallaltra la formazione di sostanze nocive alla salute (Frankel, 1982; Frankel, 1985), alcune delle quali, sono anche sgradite da un punto di vista sensoriale (Solinas et al., 1985; Solinas et al., 1987). La presenza dei componenti fenolici dellolio varia durante la conservazione in relazione probabilmente a processi idrolitici e di ossidazione degli o-difenoli; uno studio pi approfondito riguardo ai cambiamenti che queste sostanze subiscono nel tempo, potrebbe permettere di comprendere meglio come la qualit dellolio vergine di oliva tenda a decadere durante il suo stoccagIndustrie Alimentari - XLIV (2005) novembre

gio (Morell et al., 2004; Cinquanta et al., 1997). Linuenza che linsaturazione, la temperatura, la luce, la presenza di metalli pro-ossidanti, la presenza di pigmenti e la pressione parziale di ossigeno hanno sul processo ossidativo, stata studiata a lungo su substrati modello come i metil-esteri di acidi grassi insaturi vericandone il processo di autossidazione. Per quanto riguarda limpiego delle basse temperature nella conservazione di qualsiasi prodotto alimentare, noto che la determinazione della shelf-life dipende dalle caratteristiche intrinseche del prodotto. Lo sviluppo di reazioni chimiche negli alimenti congelati difcilmente prevedibile a causa delle transizioni di fase dei composti che cristallizzano (acqua, zuccheri, lipidi). Infatti, come conseguenza dellabbassamento della temperatura, lalta viscosit e la bassa mobilit molecolare potrebbero causare una riduzione delle velocit delle reazioni chimiche, ma, allo stesso tempo, la

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progressiva concentrazione dei reagenti potrebbe essere responsabile dellaumento delle stesse (Fu et al., 1997). Una delle pi importanti reazioni chimiche che pu portare ad un decadimento della qualit durante il congelamento, lossidazione lipidica. Negli alimenti congelati, e quindi anche nellolio di oliva, i lipidi si trovano in fase liquida, in fase solida o in diverse emulsioni solido/liquido (Lawler et al., 1998). Il loro stato sico dipende dalla composizione e dalle condizioni di processo durante il raffreddamento e il congelamento (Sato, 1988). La cristallizzazione degli oli e dei grassi e la successiva transizione del tipo di cristallo, potrebbe promuovere le reazioni di ossidazione; infatti Kristott (2000) suggerisce che la fase liquida, che circonda i cristalli di ghiaccio, possa contenere una alta percentuale di acidi grassi insaturi in aggiunta allossigeno concentrato disciolto. Come ben sappiamo, entrambi questi fattori sono in grado di promuovere lossidazione (Calligaris, 2002). Lobiettivo di questo lavoro di indagare i cambiamenti a carico della frazione fenolica dellolio di oliva durante il processo di cristallizzazione. dalle diverse piante selezionate allinterno di due oliveti connanti (AB, AC), a due differenti stadi di maturazione (I e II). Effetto tempo-temperatura sulla conservazione di oli di oliva monovarietali I quattro campioni di olio sono stati conservati con modalit differenti. Lolio appena prodotto, che verr indicato in questo studio come olio fresco, stato sottoposto immediatamente ad analisi. Per valutare linuenza del cambiamento dello stato sico dellolio, sui parametri analitici considerati, stata effettuata, dopo oltre due settimane dalla produzione (previo stoccaggio a temperatura ambiente), una conservazione mediante abbassamento della temperatura a 4C (e conseguente cristallizzazione) per ulteriori quindici giorni. Per valutare landamento dellossidazione dellolio nel tempo, il prodotto stato conservato anche per un periodo di tre mesi in diverse condizioni termiche: a temperatura ambiente e a temperatura di -18C. Gli andamenti delle temperature di conservazione sono riportati in g. 1. Valutazione della stabilit ossidativa dei campioni di olio, mediante ossidazione forzata (Oxidative Stability Instrument) Per effettuare un confronto relativo alla loro stabilit ossidativa, i diversi campioni di olio sono stati sottoposti ad ossidazione forzata, impiegando il calore ed un usso di aria in condizioni standardizzate e controllate. stato scelto, basandosi su dati riportati in letteratura, di effettuare lossidazione forzata a 110C, con un usso di aria di 120 mL/min. La resistenza allossidazione viene determinata da un elettrodo che misura le variazioni di conducibilit dellacqua deionizzata nella quale giunge il usso di aria che trasporta i prodotti volatili dellossidazione. Attraverso questa misura, che viene effettuata in continuo, lo strumento estrapola, dalla fase iniziale dellossidazione, a quella in cui essa assume un andamento esponenziale, il dato relativo alla ne del periodo di induzione, noto per lappunto come OSI time (Jebe et al., 1993). Per effettuare queste analisi stato utilizzato un Oxidative Stability Instrument (OSI) ad 8 canali (Omnion, Decatur, IL, USA).

MATERIALI E METODI
Solventi e reagenti Tutti i solventi e reattivi utilizzati erano di grado analitico e forniti dalla Merck & Co. Inc. (Darmstadt, Germania). Gli standard erano invece stati acquistati della Fluka (Buchs, Svizzera). Campioni Questo studio stato svolto impiegando olive della cultivar Colombaia prodotte da oliveti situati nellarea di Varigotti, comune di Finale Ligure (SV). I campioni rappresentativi ed omogenei di olive sono stati raccolti, in maniera randomizzata

Fig. 1 - Andamento della temperatura durante la conservazione. In blu e in fucsia il prolo termico dei campioni (prima e seconda raccolta) conservati a temperatura ambiente e a -18C, in giallo e azzurro landamento delle temperature dei campioni conservati a 4C della prima (giallo) e seconda (azzurro) raccolta.
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Determinazione dellacidit e del numero di perossido La percentuale di acidit libera ed il numero di perossido dei campioni di olio sono stati determinati in accordo con gli allegati II e III del Regolamento CEE n. 2568/91. Estrazione della frazione fenolica dallolio di oliva Il procedimento di estrazione dei componenti fenolici dallolio di oliva stato eseguito seguendo le modalit descritte da Pirisi et al., 2000. Determinazione spettrofotometrica dei fenoli totali La determinazione dei fenoli totali nei campioni stata effettuata mediante analisi spettrofotometrica con il reattivo di Folin-Ciacolteu, seguendo la metodica di Singleton et al., 1965 e applicando alcune modiche (Cerretani et al., 2003). Lo spettrofotometro impiegato era un UV-Vis 1204 (Shimadzu Co., Kyoto, Giappone). Determinazione spettrofotometrica degli o-difenoli La determinazione degli o-difenoli stata effettuata seguendo il metodo di Mateos et al., 2001, eseguendo le letture delle quattro ripetizioni di ogni campione a 370 nm. Analisi delle sostanze fenoliche mediante cromatograa liquida ad elevate prestazioni (HPLC), con rivelatore UV (DAD) e rivelatore spettrometrico di massa (ES/APCI-MSD) Lestratto fenolico relativo ai campioni (Pirisi et al., 2000) stato iniettato in HPLC (HP Serie 1100, Agilent Techologies, Palo Alto, CA, USA), nel volume di
Fig. 2 - Valori di acidit libera (% acido oleico) negli oli campionati; confronto fra oli freschi (in verde), oli conservati per tre mesi a -18C (in verde acqua) e a temperatura ambiente (in arancio). ABI e ACI, campioni di olio da olive raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre 2003.
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10 L. Tale strumento era provvisto di: una pompa binaria ad alta pressione, un autocampionatore indicato come ASL (Automatic Liquid Sampler modello G1313A), un degasatore a membrana per la deareazione dei solventi, e, quali sistemi di rivelazione, un detector UV-VIS HP a serie di fotodiodi (DAD), ed uno spettrometro di massa HP (MSD). La colonna utilizzata era una C18 Luna (Phenomenex Co., Aschaffenburg, Germania) della lunghezza di 250 mm, diametro interno di 3 mm e particelle di 5 m. I solventi impiegati come fase mobile sono stati ltrati su ltri in nylon, aventi una porosit di 0,45 m (Lida Manufacturing Corp., Kenosha, WI, USA). Leluizione a gradiente stata effettuata impiegando le seguenti fasi mobili: fase mobile A, costituita da acqua/acido formico, 99,5:0,5 (v/v), mentre la fase mobile B era CH3CN al 100%. Il usso era di 0,5 mL/min. Il gradiente di eluizione riportato in Cerretani et al. (2005). Il segnale acquisito mediante il DAD stato registrato a 280 nm, lunghezza donda alla quale stata eseguita la quanticazione degli analiti (rispetto allacido 3,4-diidrossifenilacetico). La rivelazione effettuata mediante

lo spettrometro di massa, invece, stata impiegata unicamente a ni identicativi e prevedeva lutilizzo della sorgente ElectroSpray (API-ES), in modalit positiva e quella a ionizzazione chimica (APCI), in modalit negativa. Determinazione dellattivit antiradicalica degli estratti fenolici mediante test del DPPH e test del ABTSIl procedimento seguito per questi due test era di Kim D.O. et al., 2002, mentre lo spettrofotometro utilizzato era sempre lUV-VIS 1204 (Shimadzu Co., Kyoto, Giappone).

RISULTATI E DISCUSSIONE
In tab. 1 vengono riportati i valori delle diverse analisi effettuate sui campioni di olio ligure. Ogni valore la media di quattro ripetizioni. possibile notare gracamente (g. 2) come lacidit

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tenda ad aumentare durante la conservazione, sia a temperatura ambiente che a -18C, tanto che per un campione dei quattro (ACII) tale valore supera il limite consentito dal regolamento CEE 2568/91 (e successive modiche) per la categoria merceologica di olio extravergine di oliva. Questultimo andamento probabilmente il frutto della presenza di piccole quantit di acqua di vegetazione residue nellolio a causa di una separazione non completamente efciente; gli enzimi presenti nella fase acquosa possono infatti determinare fenomeni idrolitici a carico dei trigliceridi. La determinazione del numero di perossido (g. 3), in linea con la precedente, mostra un aumento di tale parametro passando da olio fresco, a quello conservato a -18C per tre mesi, a quello conservato per lo stesso periodo ma a temperatura

T Tabella 1 - Valori delle diverse analisi effettuate sui quattro campioni di olio ligure. ABI e ACI, campioni di olio da olive V raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre 2003; NV, non valutato. a-d Lettere V differenti per lo stesso tipo di campione indicano una differenza signicativa (test HSD di Tukey con p<0,05). T OSI Time ABI fresco ABI 15 giorni a 4C ABI 3 mesi a -18C ABI 3 mesi a Tamb ACI fresco ACI 15 giorni a 4C ACI 3 mesi a -18C ACI 3 mesi a Tamb ABII fresco ABII 15 giorni a 4C ABII 3 mesi a -18C ABII 3 mesi a Tamb ACII fresco ACII 15 giorni a 4C ACII 3 mesi a -18C ACII 3 mesi a Tamb 13,60a 11,39b 10,42c 6,95d 13,95a 10,74b 9,62c 6,04d 21,85a 15,85b 15,75b 8,74c 22,48a 16,56b 15,09c 8,80d Acidit libera (ac. oleico %) ABI fresco ABI 15 giorni a 4C ABI 3 mesi a -18C ABI 3 mesi a Tamb ACI fresco ACI 15 giorni a 4C ACI 3 mesi a -18C ACI 3 mesi a Tamb ABII fresco ABII 15 giorni a 4C ABII 3 mesi a -18C 0,21b NV 0,28a 0,28a 0,36c NV 0,41b 0,48a 0,30c NV 0,67a Fenoli Totali 296,50a 162,35c 171,01c 213,94b 368,00a 210,86b 235,62b 226,47b 383,61a 220,61c 318,48b 234,06c 510,79a 272,02b 337,71b 272,15b N. Perossido (meq O2/kg olio) 7,30b NV 7,82b 14,10a 7,43b NV 6,01c 15,28a 7,50c NV 12,15b o-difenoli 97,61a 30,71b 44,27b 33,00b 95,64a 90,74a 115,47a 31,02b 152,80a 46,93c 112,65b 26,54c 191,04a 110,89b 108,30b 45,21c Test DPPH mmoli Teac/kg olio 0,44a 0,26b 0,16c 0,16c 0,88a 0,53b 0,41b 0,15c 1,02a 0,75b 0,88a,b Fenoli Totali in HPLC 6.175,99605,20 5.181,38460,65 5.215,29425,98 NV 6.842,95871,28 6.630,84425,75 5.194,01386,03 NV 6.673,47694,57 6.257,39746,70 7.212,48975,50 NV 8.998,181.204,48 8.106,071.625,22 8.869,01600,90 NV Test ABTS- mmoli Teac/kg olio 1,69a 1,93a 0,60b 0,68b 2,34a 2,31a 0,89b 0,36c 2,49a 2,69a 1,73b

ABII 3 mesi a Tamb ACII fresco ACII 15 giorni a 4C ACII 3 mesi a -18C ACII 3 mesi a Tamb

0,58b 0,50c NV 0,99b 1,05a,b

20,93a 8,80c NV 16,07b 21,73a

0,45c 1,53a 1,25a 1,31a 0,39b

0,67c 2,96b 3,32a 2,18c 0,77d

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2005). Il loro andamento nei campioni analizzati segue tendenzialmente quello dei fenoli totali; per tre campioni su quattro (ABI, ABII, ACII) si assistito ad una signicativa diminuzione del contenuto in o-difenoli comparando lolio fresco con quello conservato nelle diverse modalit. Per quanto riguarda il campione ACI, la sostanziale stabilit del dato attribuibile allelevata variabilit analitica. Per valutare la resistenza nei confronti dei processi ossidativi, nei campioni di olio oggetto di questo studio, sono stati applicati tre differenti metodi analitici, lOxidative Stability Instrument ed i test antiradicalici dellABTS- e del DPPH. I dati relativi allOxidative Stability Instrument evidenziano la resistenza allossidazione dellolio connessa sia alla presenza dei componenti antiossidanti che alla stabilit intrinseca determinata dal grado di insaturazione della matrice lipidica; i test antiradicalici valutano, invece, lattivit radical scavenger propria della frazione fenolica estratta dallolio. Dalla tab. 1 si nota come il test dellABTSnon mostri una signicativa variazione fra lolio fresco e quello conservato 15 giorni a 4C, tuttavia confrontando il

Fig. 3 - Valori del numero di perossido, espressi in meq O2/kg di olio, negli oli vergini di oliva, in funzione delle modalit di conservazione. ABI e ACI, campioni di olio da olive raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre 2003.

ambiente. Anche per questo parametro il campione ACII superava i limiti consentiti dalla legge per la denominazione di olio extravergine di oliva. Mediante lutilizzo di uno strumento in grado di accelerare lossidazione della sostanza grassa (Oxidative Stability Instrument), stata valutata linuenza delle diverse modalit di conservazione, oggetto di questo studio, sulla stabilit dellolio. Dai dati riportati in tab. 1 e g. 4 appare evidente come la cristallizzazione a 4C sia associata ad un decremento statisticamente signicativo della stabilit ossidativa, rispetto a quella dellolio appena prodotto (fresco). Per gli stessi oli stata valutata linuenza della conservazione a -18C per tre mesi, confrontandoli con gli stessi campioni stoccati a temperatura ambiente per un ugual periodo di tempo. Anche in questo caso la diminuzione di stabilit ossidativa appare signicativa. I fenoli totali, misurati spettrofotometricamente, mostravano un calo signicativo solo se si confronta lolio fresco con quello conservato (nelle diverse modalit). Per quanto riguarda i diversi tipi di conservazione, non si riscontrato per i fenoli totali un anda-

mento univoco per i quattro campioni considerati (tab. 1). Gli o-difenoli possono essere considerati tra i composti a struttura fenolica in grado di esplicare la maggiore attivit antiossidante negli oli extravergini di oliva (Gallina Toschi et al.,

Fig. 4 - Confronto tra i valori di stabilit ossidativa (OSI time), espressi in ore, negli oli vergini di oliva, in funzione delle modalit di conservazione. ABI e ACI, campioni di olio da olive raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre 2003.
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fresco con il conservato a tre mesi alle diverse temperature, si evince come le differenze siano sostanziali e signicative; e quindi come labbattimento della temperatura (4C) abbia determinato un abbassamento del potere antiossidante della frazione fenolica, cos come anche la conservazione protratta nel tempo ed in maggior misura per quella effettuata a temperatura ambiente (invece che a -18C). Il test del DPPH (tab. 1) evidenzia maggiormente le differenze del confronto fra olio fresco e olio conservato 15 giorni a 4C e fra olio conservato a -18C rispetto a quello mantenuto a temperatura ambiente per lo stesso periodo (3 mesi). Il prolo fenolico quali-quantitativo relativo ai campioni di olio permette di individuare le inuenze esercitate dalle diverse modalit di conservazione su tale frazione. Nella tab. 1 riportato il contenuto in fenoli totali quanticato mediante HPLC. Come mostrato dai dati in tabella e dalla g. 5, appare evidente la tendenza alla diminuzione delle sostanze fenoliche in seguito alla conservazione a 4C, rispetto ai campioni appena prodotti (Freschi). Daltra parte, la conservazione a -18C seppur protratta per un tempo superiore (tre mesi), non sembra inciare tali contenuti.

Fig. 5 - Quanticazione (mg/kg di olio espressa in acido 3,4-diidrossifenilacetico) mediante analisi HPLC con rivelazione con serie di fotodiodi (DAD) alla lunghezza donda di 280 nm, dei fenoli totali, nei quattro campioni considerati, in funzione delle diverse modalit di conservazione. Poli, curva polinomiale. ABI e ACI, campioni di olio da olive raccolte il 21 ottobre 2003; ABII e ACII, campioni di olio da olive raccolte il 5 novembre 2003.

CONCLUSIONI
I valori di acidit libera ed il numero di perossido degli oli appena prodotti rientravano largamente allinterno dei limiti stabiliti dal Reg. CEE 2568/91 e successive modiche. Entrambi i parametri valutati subivano un aumento signicativo in seguito a conservazione a -18C, per tre mesi, anche se meno marcato rispetto a quello relativo alla conservazione a temperatura ambiente. Per quanto riguarda invece la conservazione dei campioni di olio a 4C apparso evidente un signicativo decremento della stabilit ossidativa (misurata tramite Oxidative Stability Instrument) rispetto ai campioni appena prodotti. Il decremento dellOSI time

arrivava a superare addirittura il 50%, quando si paragonavano i valori relativi allolio fresco e a quello conservato per tre mesi, a temperatura ambiente. Anche il confronto tra la conservazione per tre mesi a -18C e a temperatura ambiente faceva registrare una signicativa essione della stabilit ossidativa a scapito di questultima seppur in modo meno consistente (35%). La conservazione dellolio a bassa temperatura pu quindi influire positivamente rallentando le cinetiche delle reazioni ossidative. Il contenuto in fenoli totali, valutati per via spettrofotometrica, rispecchiava landamento osservato per le prove di stabilit ossidativa (correlazione di Pearson r=0,77 con p<0,001); la stessa tendenza si aveva per gli o-difenoli, valutati con la stessa tecnica. Per quanto concerne le determinazioni dellattivit antiradicalica, eseguite sulla frazione fenolica, degli oli oggetto di studio, il test del DPPH, rispetto allABTS- forniva un andamento complessivamente in linea con quello mostrato dallOSI (correlazione di Pearson r=0,81 con p=0,001). Il prolo fenolico quali-quantitativo valutato mediante
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HPLC-DAD-MSD, ha messo in luce un calo sostanziale, soprattutto dei fenoli semplici, in seguito alla conservazione a bassa temperatura. In generale, stato evidenziato come la conservazione a bassa temperatura, a causa di cambiamenti dello stato sico, determini un abbattimento signicativo della componente fenolica e quindi della resistenza allossidazione dellolio (confrontando lolio appena prodotto con quello posto a 4C). Se, tuttavia, gli effetti dovuti allabbattimento della temperatura che possono essere ipotizzati sono due, che agiscono in modo contrario, dai risultati ottenuti appare chiaro come, prolungando la conservazione, quello di rallentamento dellossidazione delle sostanze antiossidanti prevalga sulla perdita generata, a loro carico, allinizio dal cambiamento dello stato sico.

BIBLIOGRAFIA
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