UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL

Prctica de laboratorio No. 4

TCNICAS DE SEPARACIN: ELECTROFORESIS DE PROTENAS SRICAS.

Figura No.1. Electroforesis en papel. Este tipo de soporte en la actualidad solo reviste importancia desde el punto de vista histrico, debido a la baja resolucin que ofrece.

1.

INTRODUCCION

La mayora de los polmeros biolgicos y molculas existen en solucin como especies cargadas (iones). Algunos con carga positiva (aniones), otros con carga negativa (cationes). Bajo esta circunstancia, cuando se genera un campo elctrico (Ver figura No.1) y este es aplicado a una solucin de especies con caractersticas elctricas definidas, cada partcula iniciar un proceso de migracin hacia el electrodo de carga opuesta o no migrar si su carga neta es cero, es decir si el medio le ha proporcionado a la partcula su punto isoelctrico. En condiciones experimentales, la tasa de movimiento incrementar rpidamente hasta llegar a un valor constante. Esto sucede cuando la friccin ocasionada por la migracin de la partcula a travs de un soporte (papel, agarosa, poliacrilamida, acetato de celulosa) y la fuerza del campo elctrico llegan a un equilibrio. De manera que en una situacin de condiciones estables la velocidad de la partcula ser directamente proporcional a la fuerza generada por el campo elctrico. Esta constante de proporcionalidad es conocida como movilidad electrofortica. Ahora, el proceso de transporte de partculas a travs de un soporte, mediante un campo elctrico, recibe el nombre de electroforesis. Un proceso que originalmente recibi el nombre de cataforesis y que fue desarrollado hacia 1930 por Tiselius. Sus experimentos iniciales, se basaron en un proceso electrofortico frontal que consista en un medio electroltico contenido en un tubo de cuarzo, donde sumergidos los electrodos, podan separarse las protenas sricas humanas en 4 zonas conocidas como albmina, alfa, beta y gamma.

2.

FUNDAMENTO

Como se explic inicialmente, la mayora de los polmeros biolgicos poseen carga elctrica y por lo tanto son capaces de migrar bajo la influencia de un campo elctrico. El transporte de partculas a travs de un disolvente mediante un campo elctrico recibe el nombre de electroforesis. Una forma usual de caracterizar una macromolcula es la determinacin de la velocidad con que se mueve al someterla a un campo elctrico. Esta propiedad puede ser utilizada para calcular el peso molecular de una protena, para distinguir molculas por su carga neta o su forma y finalmente (lo ms importante) para separar cuantitativamente distintas especies moleculares. La teora detallada de la electroforesis es bastante compleja. La fuerza aplicada esta contrarrestada por la resultante del rozamiento de la partcula con el medio. Si una partcula con carga q suspendida en un medio aislante se encuentra en un campo elctrico E, la partcula se mover a una velocidad constante v, determinada por el balance entre la fuerza elctrica Eq y la resultante del rozamiento con el medio fv, donde f es el coeficiente de friccin, esto es:

Eq = fv
Basados en estas premisas fisicoqumicas es que se logra la separacin de diferentes mezclas de complejos moleculares. De hecho, el fenmeno electrofortico es permitido por factores como peso molecular, que est directamente relacionado con el coeficiente de friccin, la carga de la partcula, directamente relacionada con la velocidad de movimiento y el campo elctrico dado por un ctodo y un nodo (cmara electrofortica). FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ELECTROFORESIS La migracin de partculas (proteicas en nuestro caso) esta influenciada, no solo, por el coeficiente de rozamiento dado por el peso molecular, sino tambin por una serie de factores dentro de los que se cuentan el pH, el voltaje dado por la fuente de poder, temperatura y tiempo. Influencia del pH Las protenas son molculas anfteras, esto significa que ellas se cargan positivamente o negativamente de acuerdo al pH del buffer de corrida electrofortica. Basndose en el conocimiento del punto isoelctrico, que es aquel pH en el cual una protena no porta carga neta y por la tanto no se mueve en un campo elctrico, el buffer de separacin puede ser escogido. El buffer, adems de dar una carga a las protenas, ayuda a mantener un pH constante y esto a su vez hace que cada protena mantenga una carga constante durante el curso de la separacin. El buffer ms comnmente usado es buffer barbital a 8.6, donde las protenas se cargan negativamente y su comportamiento en un campo elctrico es migrar hacia el nodo. Voltaje, temperatura y tiempo La finalidad de la tcnica electrofortica es la separacin en bandas de migracin de protenas. El tiempo de separacin en bandas esta directamente relacionado con el voltaje, esto significa que si aumento el voltaje disminuye el tiempo en que se separan las protenas y ocurre el fenmeno contrario si disminuyo el voltaje. Se tiene como valor de referencia que de 90 a 100 voltios sobre una lmina de electroforesis, se logra la separacin de las protenas en 50 minutos. En cuanto a la temperatura es un problema muy comn que se puede}an desnaturalizar las protenas si aumenta demasiado durante la corrida electrofortica, por esto se sugiere realizar el procedimiento bajo refrigeracin cuando se utilice un voltaje muy alto.

3. METODOLOGIA GENERAL DE LA ELECTROFORESIS

El mtodo usado para la realizacin de una corrida electrofortica, ya sea en materiales como agarosa, acetato de celulosa, gel de poliacrilamida o papel, sigue los mismos pasos generalmente. (Ver figura No.2):

Figura No. 2. Tcnica de la electroforesis de zona en acetato de celulosa. A: una pequea cantidad de suero o de otro lquido se aplica a la tira de acetato de celulosa. B: se realiza la electroforesis de la muestra en solucin amortiguadora. C: Las bandas de las protenas separadas se hacen visibles en suposicin caracterstica despus de haber sido teidas. D: La exploracin de la tira de acetato de celulosa en un densitmetro convierte las bandas a los picos caractersticos de albmina, globulina 1, globulina 2, globulina y globulina .

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS SERICAS El procedimiento electrofortico de la prctica tiene como finalidad separar los componentes proteicos de una muestra de suero. Entre los constituyentes que pueden hallarse se encuentran enzimas, factores de coagulacin, protenas transportadoras, inhibidores enzimticos, entre otros, cuyas concentraciones sricas totales y las proporciones individuales se modifican en diversos estados fisiolgicos y patolgicos Cuando se utiliza la agarosa y como amortiguador una solucin de Buffer Barbital a pH 8.6 la mayora de los polipptidos presentan una carga neta negativa y se fraccionan generalmente en 6 zonas bien definidas: Albmina, globulina alfa-1, globulina alfa-2, globulina beta-1, globulina beta-2 y globulina gamma. (Observacin: puede encontrarse la banda de pre-albumina con alguna frecuencia y la Regin Beta generalmente en este tipo de soporte se estudia como una sola banda) MUESTRA Al tratarse de muestra de origen humano se prefiere el suero (se extrae de una muestra que se ha tomado sin anticoagulante), aunque la separacin electrofortica de plasma, permite visualizar una banda de migracin que corresponde a fibringeno (protena importante en la coagulacin). Cuando se trabajan muestras con baja concentracin proteica como extractos de cultivos celulares, liquido cefalorraquideo y otros especmenes, se necesita que la muestra sea concentrada por ultracentrifugacin, dilisis, evaporacin en fro, microfiltracin u otros mtodos. REACTIVOS

Buffer Barbital Beckman Paragon B-2 Barbital Buffer No. 655780 (vial comercial) Disolver el contenido de un frasco de 18.2 gramos en 1500 ml de agua destilada. Se obtiene una solucin tampn con una fuerza ionica de 0.050 micras y pH 8.6 +/- 0.01. Si no se dispone del vial comercial, preparar una solucin amortiguadora de barbital pH 8.6, 75 mmoles/l y lactato de calcio 2mmol/l. Preparar el amortiguador de la siguiente manera: Disolver 10.35 g de cido dietilbarbiturico (Merck Art. 276) en aproximadamente 1 litro de agua destilada, adicionar 2.88 g de lactato de calcio y 65.7 g de dietilbarbiturico de sodio (Merck. Art. 6318). Diluir con agua destilada a un volumen final de 5 litros. Colorante Azul de Coomasie al 0.8% En volumtrico aforado de 250 ml medir: 2.0 g de azul de Coomasie (Sigma No. B-0.630) 75 ml de Metanol 35 ml de Acido Actico Glacial. Aforar el volumen con agua destilada. Disolver el colorante completamente. Solucin Decolorante Mezclar: 135 30 135 ml ml ml de Metanol de Acido Actico de Agua destilada.

PROCEDIMIENTO

Preparar agarosa (Merck Art. 6013) al 0.8 % en amortiguador Barbital pH 8.6 Para disolverlo llevar la solucin a ebullicin. Colocar la solucin de agarosa en un tubo de ensayo con capacidad para 50 ml y dejarla en bao Mara a 55C durante su uso. Seleccionar varios portaobjetos (placas de vidrio) segn l numero de muestras. Servir en cada uno 3 mililitros de agarosa y dejar que solidifique (aproximadamente 5 minutos). Observacion: se pueden trabajar placas mas grandes, para la prctica se trabajan placas con capacidad para 25 ml de agarosa y con 10 sitios de siembra. Con una regleta de impresin (peine de acrlico) se hacen suaves marcas de 1.5 cm del borde de la lamina sobre el rea que previamente se ha secado. Preparar una dilucin 1:2 del suero en amortiguador Barbital pH 8.6 Depositar en cada marquilla de la lmina 3 uL de muestra diluida o en su defecto depositar la muestra con un capilar. Debe hacerse un diagrama en el cuaderno de registro de experimentos para saber donde se siembran controles y donde las muestras en estudio. Dejar difundir las muestra por 5 minutos. Llevar las lminas ya sembradas a la cmara de electroforesis que previamente se ha preparado con amortiguador barbital pH 8.6 y se han sumergido en l, tiras de papel Whatmman No.1 para hacer el puente elctrico. Se colocan las lminas y en cada extremo (1.0 cm) se coloca una tira de papel impregnada con el amortiguador. Seleccionar el nodo en el extremo opuesto de donde se hizo la siembra de las muestras. Correr las muestras a una intensidad de 7 mA por cada portaobjeto que haya dentro. Observacin: Para la placa utilizada en la prctica se usa 50 mA. Dejar migrar las protenas durante 90 minutos. Cuando se cumpla el tiempo de migracin, desconectar la cmara y sacar las placas. Sumergir las lminas en solucin fijadora. (Etanol-cido acetico) Retirar excesos con agua y sumergir en colorante azul de Coomasie durante 15 minutos. Sacar las lminas con unas pinzas y quitar el exceso de colorante con agua corriente, dejar la lamina sumergida durante 12 horas. Decolorar ms tiempo si es necesario. Llevar a secado y decolorar con solucin decolorante.

INTERPRETACION

En algunos casos en un proceso electrofortico se pretende identificar cualitativamente una banda de migracin, entonces solo con la valoracin visual es suficiente. Sin embargo cuando se necesita cuantificar se utiliza un densitmetro que hace un barrido por las bandas de migracin integrndolas en un 100% y luego discrimina el valor en (%) que le corresponde a cada una. Para el caso de una muestra de suero humano el proceso muestra el siguiente resultado (Ver tambin Figura 3 y Tabla de protenas sricas humanasAnexo al final): Proteina total suero * 6 - 7.8 g/dl

Albumina 52 - 67 % 2-5% Globulina 1 6 -14 % Globulina 2 8 -16 % Globulina 10 -22 % Globulina * Cuantificacion por el mtodo de Biuret

Figura No.3. Patrn de electroforesis de protenas plasmticas. La separacin en gel de agarosa forma seis patrones de migracin, cada uno de las cuales est compuesta de muchas especies individuales de protenas. Esta esquematizacin ofrece alguna claridad sobre la distribucin de estos componentes. (Tomado de Laurell, C.B., Clin. Chem., 1973.) Pre-A: Prealbumina, Alb: Albmina, LP: Alfa-1 lipoproteina (HDL), 1-At: Alfa-1 Antitripsina, 1Ag: Alfa-1 Glucoproteina, Gc: Gc-globulina, Cer: Ceruroplasmina, Hpt: Haptoglobina, 2-M: Alfa-2 macroglobulina, -LP: Beta-liproteinas (LDL), Tf: Transferan, Hpx: Hemopexina, AT3: Antitrombina III, C3-C4-C5: protenas de complemento, IgA-D-E-G-M: Inmunoglobulinas, Fibr: Fibringeno, CRP:

COMENTARIOS Chequear los primeros 5 minutos de corrida de la electroforesis, es el tiempo de estabilizacin del voltaje.

Las protenas son estables 24 horas a temperatura ambiente, 8 das a 4C y 6 meses si la muestra se congela a -20C. PROCESO EXPERIMENTAL

a.

Debido a que en la prctica anterior no se realiz la determinacin de BIURET, en el trabajo experimental de esta prctica si se llevar a cabo. Para tal efecto har la determinacin de la muestra asignada por triplicado (Realizar las lecturas en el espectrofotometro) y para los procedimientos de clculo de concentracin de desconocidos tendr en cuenta los siguientes datos para efectos de establecer la curva de patrn: CURVA DE CALIBRACION DE PROTEINAS POR BIURET CONCENTRACION g/dl ABS 1 BLANCO 0.172 2 0.125 3 0.206 4 0.281 6 0.399 8 0.558 ABS2 0.170 0.133 0.204 0.271 0.399 0.545

Observacin: Los valores obtenidos de absorbancia para cada estandar ya tienen restado el blanco es decir que la absorbancia para el estandar 2 g/dl con el blanco sera de 0.172 + 0.125 = 0.297

b. c.

Escriba los resultados en la gua para informe entregada en la prctica.

Para el procedimiento electrofortico, debido al poco tiempo asignado para la prctica, los reactivos estarn listos para usarse y se llamara a cada estudiante a realizar una siembra en los pozos del gel de agarosa. La prctica finaliza cuando se deje en decoloracin la placa.

4.

BIBLIOGRAFIA

*KAPLAN LAWRENCE A. & PESCE AMADEO. Clinical chemistry theory, analysis and correlation. The C.V. Mosby Co. St. Louis, p. 43- 73 .1984. *ALPER CHESTER, FORMAN DONALD, TUCKER ERNEST & KRUSE LINDA. Agarose gel electrophoresis. Clin. Chem. vol. 25 No. 4, 629-638 (1979). *HAMES B.D. & RICKWOOD D. Gel electrophoresis of proteins. First published. IRL press limited. Oxford, 1987. *MATHEWS C. & VAN HOLDE K.E. Bioqumica. Segunda Edicin, Editorial McGraw-Hill- Interamericana p. 56 1998 *URIBE A. & TONGUINO T. Valoracin de la electroforesis en gel de agarosa para la deteccin de bandas oligoclonales en lquido cefalorraqudeo. Tesis de grado. 1989

CARACTERISTICAS DE LAS BANDAS PROTEICAS DETECTABLES POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AISLADAS DE SANGRE HUMANA * PROTEINA (Concentracin) Pre- Albmina ( 2- 7 % ) Albmina (50 70 %)
RE P-AL*** ALB ***

PM Kd 62 66

SINTESIS

FUNCION/ALTERACION **
Funcin: Transportador de tiroxina, transportador de vitamina A. Alteracin: Desnutricin, Dao Heptico severo. Funcin: Fijacin y transporte de numerosas sustancias (como aminocidos, cidos grasos, enzimas, entre otros); tambin es responsable del control del equilibrio de lquidos entre los compartimientos intravascular y extravascular del organismo. Alteracin: Aumentada. Deshidratacin y Disminuida. Enfermedad heptica y desnutricin. Funcin: Neutralizacin de las enzimas proteolticas tripsina (derivada de leucocitos del pulmn, pncreas y otros rganos). Alteracin: aumentada. Reacciones inflamatorias disminuida enfermedad pulmonar y deficiencia hereditaria. Funcin: Transporte en reversa del colesterol (de los tejidos al Hgado) para su eliminacin. Alteracin: Aumentada: Deportistas, bajo riesgo de enfermedad cardiovascular Disminuida. Enfermedad heptica, en particular enfermedad de Tangier (deficiencia hereditaria) Funcin: Conocida tambin como orosomucoide, se le asigna la funcin de reactante de fase aguda****. Se le ha dado adicionalmente la funcin de transportar la testosterona. Alteracin: Aumentada en procesos infecciosos o inflamatorios. Funcin: Transportadora de la vitamina D. Alteracin: La ausencia congnita de dicha protena se considera una mutacin letal, en Razn a que la vitamina D es extremadamente apolar y no puede desplazarse en los medio sanguneos en forma libre. Funcin: Protena enzimtica fundamental de la coagulacin. Alteracin: Disminuida en enfermedad heptica. Funcin: Transportador de hormonas tiroideas. Alteracin: Disminuida en enfermedad heptica o dao renal. Funcin: Inhibidora de proteasas, neutraliza enzimas proteolticas como tripsina y plasmina, entre otras. Alteracin: aumento severo en enfermedad renal grave ( con perdida de protenas). Funcin: Protena fijadora de hemoglobina (Hb). Los complejos Hb-haptoglobina conservan los depsitos de hierro del organismo para su reutilizacin. Alteracin: Aumentada Inflamacin aguda y crnica (reactante de fase aguda), disminuida en procesos hemolticos o dao heptico. Funcin: Protena srica fijadora de cobre. El cobre unido a la ceruloplasmina no es txico, pero libre es txico para los tejidos.Alteracin: Disminuida por enfermedad congnita en la cual no se produce ceruloplasmina. Funcin: Transporte de lpidos de sntesis endgena. Alteracin: Aumentada Desordenes del metabolismo lipdico. Disminuida. Enfermedad heptica severa. Funcin: Hormona esencial para la eritropoyesis (formacin de glbulos rojos) normal. Alteracin: Aumentada. Ciertas anemias Disminuida. Enfermedad renal, ciertas enfermedades autoinmunes. Funcin: Lipoprotena producto del catabolismo de las VLDL, transporta el colesterol y Puede depositarlo l en tejidos perifricos. Alteracin: Aumentada Desordenes del metabolismo lipidico. Disminuida en inanicin. Funcin. Protena especfica transportadora del grupo Hem. Alteracin: Aumento o disminucin igual que la Haptoglobina. Funcin: La transferrina acta como protena de transporte ya que transfiere hierro entre los tejidos (como el hgado) y la mdula sea. Alteracin: Aumentada. Anemias por deficiencia de hierro. Disminuida. Enfermedades hepticas. Funcin: sistema complejo formado por nueve protenas sricas que actan en las reacciones inflamatorias. Defensa humoral inespecifica. (reactante de fase aguda). Alteracin: Disminuidas en enfermedades autoinmunes. Funcin: Regulador de la coagulacin. Es el inhibidor mas potente de la trombina. Alteracin: Disminuida en forma Hereditaria. Funcin: Inmunidad de superficie, evita adherencia de microorganismos a las mucosas. Alteracin: Ver regin Gamma.

Heptica Heptica

REGION ALFA-1: (2-5%)

Alfa-1 Antitripsina Alfa-1 Lipoprotenas (HDL) Alfa-1 Glucoprotena GC-Globulina Protrombina Globulina fijadora tiroxina
ALFA-1 ALFA-1 ALFA-1 ALFA-1 ALFA-1 ALFA-1 ALFA-2 ALFA-2 ALFA-2 ALFA-2 ALFA-2 BETA BETA BETA BETA BETA BETA

45 300 44 51 72 36 820 100 132 >1000 30 >3000 80 80 185 a 417 62 160

Heptica Heptica intestino Heptica Heptica Heptica Heptica Heptica Heptica Heptica Heptica Rion Heptica Heptica Heptica Heptica Heptica Linfoc. B

REGION ALFA-2: (6-14%)

Alfa-2 Macroglobulina Haptoglobina Ceruroplasmina Alfa-2 Lipoprotenas (VLDL) Eritropoyetina REGION BETA: (8-16%) Beta-lipoprotenas (LDL) Hemopexina Transferrina Protenas del complemento (C3-C4-C5) Anti-Trombina-III Inmunoglobulina A

CARACTERISTICAS DE LAS BANDAS PROTEICAS DETECTABLES POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AISLADAS DE SANGRE HUMANA * PROTEINA (Concentracin) INTER: BETA-GAMMA Fibringeno REGION GAMMA: (10-22%) Inmunoglobulina D Inmunoglobulina E Inmunoglobulina M Inmunoglobulina G RE PM
SINTESIS

FUNCION/ALTERACION **

Kd
Fibr***

340 170 190 900 150

Heptica Linfoc. B Linfoc. B Linfoc. B Linfoc. B

Funcin: Es el factor de la coagulacin mediada por protenas mas abundante, conforma el elemento estructural del coagulo de fibrina. Su migracin electrofortica se ubica en forma aislada entre la regin Beta y gamma de una muestra de Plasma. Alteracin: Disminuido o disfuncional en forma Hereditaria. Funcin: No es muy clara, se localiza en la superficie de linfocitos B. Funcin: Media en fenmenos de hipersensiblidad (alergias). Funcin: defensa mediada por anticuerpos. Funcin: defensa mediada por anticuerpos. Alteracin: Las inmunoglobulinas se encuentran Aumentadas en procesos infecciosos. En forma maligna se pueden aumentar formando clones (Cancer: mieloma multiple) Disminucin: Edad avanzada, induccin por algunas drogas, leucemias y sida. Funcin: Es el reactante de fase aguda mas sensible que tiene el cuerpo humano.

GAMMA GAMMA GAMMA GAMMA

Protena C Reactiva (PCR)

GAMMA

140

Heptica

* Estas bandas electroforticas (pre- albmina, albmina, Alfa-1, Alfa-2, Beta y Gamma) se aslan solamente con gel de agarosa, si se requiere mayor resolucin es necesario el gel de poliacrilamida que ofrece 108 bandas sricas diferentes. ** Se considera solamente la alteracin mas frecuente. *** Estas protenas migran en forma independientes, sus patrones son puros. **** Los reactantes de fase aguda son un grupo de protenas con la notable propiedad de aumentar su concentracin como una seal de alarma, frente a situaciones de inflamacin, infeccin, traumatismo fsico u otras necrosis Hsticas. RE: Regin Electrofortica. Kd: Kilodaltons. PM: peso molcular.