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LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA

Una prueba para el seguimiento y control en Diabetes mellitus

La glucosa es una molécula relativamente rica en energía y su oxidación hasta


CO2 y agua provee de los metabolitos necesarios para la producción de ATP
(molécula de alto contenido energético). La glucosa pertenece al grupo de los
monosacáridos, es el compuesto orgánico más abundante en la naturaleza y es
el componente principal de polímeros como la celulosa, el almidón y el
glucógeno. La forma química D-glucosa es muy importante para los seres vivos.

Los organismos autótrofos (plantas) son capaces de sintetizar glucosa por medio
de la fotosíntesis, a partir de compuestos inorgánicos; mientras que los seres
heterótrofos (animales) toman la glucosa a partir de los alimentos, o bien la
producen por una vía metabólica (anabólica) llamada neoglucogénesis.

Para obtener la energía contenida en esta molécula, la glucosa entra a la célula


a través de un proceso de transporte mediado por proteínas de membrana
llamadas GLUT (transportador de glucosa). Es así, como las células de algunos
tejidos, como por ejemplo el músculo, presentan GLUT cuya expresión en la
membrana se realiza a expensas de la concentración de la hormona Insulina
(llamados tejidos Insulino-dependientes), en tanto que en otros tejidos (cerebro)
se presentan GLUT que permanecen expresados en las membranas de sus
células, permitiendo la entrada de glucosa independientemente de la
concentración de insulina presente.

La insulina es una hormona peptídica de origen pancreático, cuya concentración


en la sangre (insulinemia) depende principalmente del estimulo realizado por el
aumento fisiológico de la concentración de glucosa en sangre luego de ingerir
alimentos. La unión de esta hormona con un receptor de membrana específico
para ella desencadena una serie de eventos en cascada que permite, por una
parte, la entrada de glucosa a algunos tejidos insulino-dependientes y, por otra,
lleva a la activación de algunas enzimas claves para la oxidación de la glucosa,
proceso llamado glicolisis que se realiza en el citoplasma de las células. Esta
hormona lleva a la disminución de la concentración en sangre de la glucosa, es
decir, tiene actividad hipoglucemiante.

La disminución de la concentración de glucosa en sangre conlleva a la


estimulación de las células α pancreáticas las que liberan la hormona glucagon.
El glucagon, hormona hiperglucemiante, se une a su receptor de membrana, el
cual esta acoplado a una proteína G y produce el aumento de AMPc, un
segundo mensajero que actúa como modulador alostérico positivo de la enzima
PKA la cual es capaz de disminuir (inhibir) la actividad de algunas enzimas de la
glicolisis y activar otras cuya finalidad es la formación de glucosa a partir de
compuestos no carbohidratos, proceso metabólico llamado neoglucogénesis.

Estos dos procesos: la glicolisis y la neoglucogénesis están en contraposición,


es decir, que mientras uno esta activo el otro debe estar inhibido y viceversa.
Esto permite una concentración de glucosa estable en la sangre y garantiza que
el suministro de glucosa para las células sea el adecuado.

El desequilibrio en estos procesos debido a alguna causa, como por ejemplo,


disminución de la cantidad de insulina, ausencia, o mutación de su gen lleva a la
acumulación de glucosa en la sangre, lo que se traduce en aumento de su
concentración por encima de los valores de referencia tomados como normales
de glucosa (60-110 mg/dL), en situación de ayuno de 12 horas máximo. Si esta
situación es mantenida en el tiempo, da lugar a una serie de complicaciones en
diferentes órganos. Por lo tanto, la determinación de la concentración de
glucosa en sangre (glucemia) es útil para el diagnostico de numerosas
enfermedades metabólicas, fundamentalmente de la diabetes mellitus. La
determinación de glucosa en orina (glucosuria) suele formar parte rutinaria de
los análisis de orina, donde no aparece en condiciones normales. Sin embargo,
cuando los valores de glucosa en sangre superan concentraciones de 180
mg/dL ésta puede ser filtrada por el riñón y eliminada por la orina, apareciendo la
glucosuria.
Determinación de glucosa (método glucosa - oxidasa)
Está basado en el esquema indicado a continuación. La glucosa oxidasa oxida a
la glucosa originando ácido glucónico y H2O2. El peróxido de hidrógeno liberado
reacciona con un cromógeno (fenol/4-aminoantipirina) por la reacción de Trinder,
para dar una quinona que absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color
producida es directamente proporcional a la concentración de glucosa.

Puede analizarse por este método cualquier muestra: suero libre de hemólisis,
plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, un hidrolizado de muestras de hígado
para valorar glucógeno, etc.

1. Paso primero: Pipetear en tubos marcados como: blanco, estándar y


muestras, los reactivos indicados (composición en Anexo). Incluir tantos tubos
de muestras como se considere conveniente. Añadir en último lugar el reactivo
para comenzar la reacción.

Reactivos Blanco Estándar Problema


Estándar - 20 μL -
(glucosa, 100 md/dL)
Muestra - - 20 μL
Reactivo 2 mL 2 mL 2 mL

2. Paso segundo: Incubar, 15 min a 37 ºC ó 30 min a temperatura ambiente.


3. Paso tercero: Ajustar el espectofotómetro a cero de absorbancia (DO) a la
longitud de onda de 500 nm y utilizando el tubo blanco, y leer los tubos
restantes.

Con los valores de absorbancia (DO) del estándar y de los tubos problema se
puede calcular la concentración de glucosa en la muestra.
Conc. problema = DO problema x concentración estándar
DO estándar
Valores normales:
Suero o plasma: 70 - 110 mg/ dL
L.C.R.: 50 - 70 mg/ dL
Orina: No contiene, en condiciones fisiológicas normales.

La diabetes mellitus es una enfermedad que cursa con niveles aumentados de


glucosa en sangre por encima de los normales. Existen dos tipos: La tipo 1, cuya
etiología es por déficit de insulina o destrucción de las células β del páncreas en
la cual los pacientes son isulino-dependientes y se presenta en niños y jóvenes,
y la tipo 2 que se presenta generalmente en personas mayores de 40 años que
presentan obesidad; se debe principalmente a la disminución en la producción
de insulina o daño (mutaciones) en los receptores para esta hormona, estos
pacientes no necesitan inyectarse insulina y pueden ser controlados con dietas
bajas en carbohidratos. (Link a recurso Web:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/es/index.html)

En el organismo hay proteínas que de manera natural se unen a carbohidratos,


este proceso generalmente es llevado a cabo en el aparato de golgi de las
células. Sin embargo, en la diabetes existe una hiperglicemia permanente, lo
que puede llevar a la unión de la glucosa con algunas proteínas. En los últimos
50 años se encontró que la hemoglobina puede combinarse de manera no
enzimática e irreversible con la glucosa.

La hemoglobina de los individuos sanos adultos está compuesta por tres


variedades denominadas hemoglobina A del adulto (HbA), hemoglobina A2
(HbA2) y hemoglobina F o fetal (HbF). La hemoglobina A es la más abundante
(97 %). A su vez, dentro de la fracción de hemoglobina A, se pueden distinguir
varios grupos con distinta movilidad durante el procedimiento de electroforesis.
Así se observan variedades de hemoglobina A de movilidad rápida denominadas
HbA1a, HbA1b y HbA1c. Existen diversas combinaciones de grupos de
aminoácidos y carbohidratos que dan lugar a diversas formas moleculares de
hemoglobina glicosilada y así a una amplia nomenclatura (Fig. Nº 1). A la
determinación de Hemoglobina glicosilada se la puede encontrar en la literatura
con otros nombres, como por ejemplo: Índice de control diabético; HbG; Gluco-
hemoglobina; A1C

Fig. Nº 1

La HbA1c es la más abundante de las hemoglobinas del tipo A1 (Link a Recurso


Web: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003640.htm). Se
trata de una molécula de hemoglobina que incorporó glucosa en la porción N-
terminal de la cadena beta (Fig. Nº 2).

Debido a que el promedio de vida de un eritrocito es de 120 días, se puede


analizar (medir, cuantificar) el porcentaje de hemoglobina que se ha glucosilado
en este periodo de tiempo; esto puede brindar información sobre el nivel de
glucosa en sangre en un período previo de cuatro meses. Esta evaluación tiene
una clara ventaja sobre el análisis directo de la concentración de glucosa en
sangre, en función de evaluar el seguimiento y control de un paciente diabético,
debido a que la medición de hemoglobina glicosilada está libre de las amplias
fluctuaciones que se observan durante el análisis de glucosa en sangre, las
cuales dependen de diversos factores como el momento del día de la toma de la
muestra, el consumo de alimentos y la actividad física realizada antes de realizar
el ensayo. La prueba de hemoglobina glicosilada es muy importante, puesto que
con ella se evalúa el comportamiento en el tiempo de los valores de glucosa, es
decir, la adherencia del paciente con respecto a la terapéutica y su respuesta
ante ella. Sin embargo, la medición del porcentaje de hemoglobina glucosilada
no puede sustituir al monitoreo de glucemias, ya que ésta no puede medir su
control diario y, por lo tanto, no le permite ajustar sus dosis de insulina e ingesta
de alimentos en el día a día a aquellos pacientes que así lo necesiten. Estas dos
pruebas se complementan, ya que buscan evaluar al paciente desde
perspectivas distintas.

“HbA1c es la hemoglobina glicosilada en la porción


N-Terminal de la cadena ß [ß-(N-deoxyfructosyl)
hemoglobina]”
HbA
o
Hi Le Th Pr Gl Gl Se
Val Lys
s u r o u u r
....
HbA1
Solo el Cadena -
c primer
AA es ß
glicosilado

Va Hi Le Th Pr Gl Gl Ly Se
Gluc
l s u r o u u s r
....
Fig. Nº 2
Existen varias técnicas que se utilizan para medir esta fracción de la
hemoglobina y los diferentes métodos analíticos detectan diversas fracciones:
• Procedimientos Inmunológicos (inmunoturbidimétricos)
• Electroforesis, Isoelectroenfoque
• Cromatografía:
– Cromatografía de intercambio iónico (Fig. Nº 3).
Link a recurso Web:
Aniones: http://www.scooterbomb.com/images/Chromatography/Anion.svg
Cationes: http://www.scooterbomb.com/images/Chromatography/Cation.svg
– Cromatografía de la afinidad (Fig. Nº 4).
Link a recurso Web:
http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_a
finidad.pdf
– HPLC o LPLC (Fig. Nº 5).
Link a recurso Web: http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l
%C3%ADquida_de_alta_resoluci%C3%B3n

Fig. Nº 3.
Cromatografía de
intercambio iónico.
(Tomado de

http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/intercambio.jpg)
Fig. Nº 4.
Cromatografía de
afinidad. Basado en
la interacción
específica entre dos
moléculas (Ag-Ac,
Enz-Sustrato,
Lectina-HC, Metal-
aa). Una de las
moléculas, el
ligando, se
inmoviliza en la
resina.
(Modificado por Br. Ricardo
Bello, de

http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf)
Fig. Nº 4. Sistema de HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Eficacia). El
uso de partículas de menor diámetro (<10 micras) mejora drásticamente el
poder de separación. La HPLC emplea bombas y columnas diseñadas para
soportar las altas presiones que son necesarias para vencer la mayor
resistencia al flujo que ejercen estas partículas.
(Modificado por Br. Ricardo Bello, de http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10049055)

La Asociación Americana de Diabetes (ADA) reconoció la importancia de la


medición de la hemoglobina glicosilada en el control de la diabetes en el año
1986, cuando recomendó el uso de dos medidas anuales de hemoglobina
glicosilada para realizar el seguimiento de la patología. En el año 1993 se
presentaron los resultados de un trabajo conocido como Estudio de Control y
Complicaciones de la Diabetes (Diabetes Control and Complications Trial o
DCCT). En esta investigación se observó por primera vez que la reducción en el
valor de la hemoglobina glicosilada estaba asociada con una disminución en el
riesgo de desarrollar complicaciones de la diabetes a largo plazo.
(Link a recurso Web http://www.fbpba.org.ar/fabainforma/396/peec01.htm)

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