Implementacion de Un Protocolo Por HPLC para La Cuantificacion de Acido Gamma Aminobutirico y Glutamato en Cerebro de Rata

1
INSTITUTO TECNOLGICO DE COSTA RICA

Escuela de Biologa

Informe del Trabajo Final de Graduacin

IMPLEMENTACIN DE UN PROTOCOLO POR HPLC PARA LA
CUANTIFICACIN DE ACIDO GAMMA-AMINOBUTRICO Y GLUTAMATO
EN CEREBRO DE RATA

Andrea A. Monge Acua

Cartago, 2007

2

3
INSTITUTO TECNOLGICO DE COSTA RICA

Escuela de Biologa

Informe del Trabajo Final de Graduacin

EN CEREBRO DE RATA


Cartago, 2007

4
EN CEREBRO DE RATA

*

RESUMEN

La iniciativa de implementar nuevas herramientas de investigacin surge en
respuesta a la necesidad de ampliar el conocimiento relativo a mejores formas de
diagnstico y tratamiento de afecciones neuropsiquitricas, como la depresin y la
ansiedad. El presente trabajo, consiste en una contribucin al estudio de la
neuroqumica de las emociones y su lado patolgico. La labor se enfoca en la
estandarizacin de un protocolo por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin de
deteccin electroqumica (HPLC-EC), para la cuantificacin de aminocidos
transmisores, involucrados en el desarrollo de dichas patologas. Este protocolo se
desarroll en el Laboratorio de Investigaciones en Neurociencias de la Universidad
de Costa Rica. El principal objetivo es el de evaluar las caractersticas qumico-
fsicas necesarias para la separacin efectiva de los aminocidos GABA y
Glutamato, basndose en el trabajo de Rowley, et al (1995). Para cumplir con dicho
objetivo, se evaluaron los parmetros cromatogrficos: intensidad de corriente,
temperatura, pH, ndice de flujo y concentracin de metanol, en funcin de la
resolucin y la deteccin de los aminocidos. Asmismo, se hizo uso de una tcnica
para el marcaje qumico de analitos de baja deteccin: la tcnica de derivatizacin.
Adicionalmente, se realizaron pruebas para determinar la repetibilidad, la linealidad
y el efecto que tiene la matriz sobre la deteccin de los aminocidos. Con base en
estos ensayos, fue posible desarrollar un protocolo repetible y lineal para la
cuantificacin efectiva de GABA y Glutamato. El nuevo protocolo consiste en la
utilizacin de una fase mvil con metanol:agua al 23% y un pH 5,5; bajo condiciones
de corrida de 0,65ml/min; 850mV; 10:50nA ;un rango de temperatura entre 18-23C;
y una cantidad de reactivo de derivatizacin de 22L (OPA 86mM)/mL de solucin
acuosa de aminocidos.

*
Informe de Trabajo Final de Graduacin, Escuela de Biologa, Instituto Tecnolgico de
Costa Rica,Cartago, Costa Rica. 2005

5
IMPLEMENTATION OF A HPLC PROTOCOL FOR QUANTIFICATION OF
GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID AND GLUTAMATE IN RAT BRAIN

*

ABSTRACT

In response to the need for better diagnostic measures and treatments for
neuropsychiatric affections such as depression and anxiety a new initiative to expand
knowledge and implement new investigative tools arises. This work represents a
contribution to the research of the neurochemistry of emotions and their pathological
aspects. This document, developed in the Neurosciences Research Laboratory-
University of Costa Rica, focuses on the standardization of a protocol by high
performance liquid chromatography of electrochemical detection (HPLC-EC), for the
quantification of amino acid transmitters, involved in the development of these
pathologies. The main objective is the evaluation of the chemico-physical
characteristics for the effective separation of the amino acids GABA and glutamate,
being based on the work of Rowley (1995). In order to fulfill this objective, the
chromatographic parameters evaluated were: intensity of current, temperature, pH,
flow rate and concentration of methanol based on the resolution and the detection of
amino acids and additionally, a derivatization technique was used for the chemical
labeling of low detection analites. Tests were run to determine the repeatability, the
linearity and the effect of matrix on amino acid detection. Based in these tests, it was
possible to develop a repeatable and linear protocol for the effective quantification of
GABA and glutamate. The new protocol consists of a mobile phase with 23%
methanol; pH 5,5; and chromatographic conditions of 0,65ml/min, flow rate ; 0,85V,
voltage; 10:50nA, current intensity; 18-23C, temperature range; and an amount of
derivatization reagent of 22L (OPA 86mM) per mL of amino acids aqueous solution.

*
Informe de Trabajo Final de Graduacin, Escuela de Biologa, Instituto Tecnolgico de Costa Rica,
Cartago, Costa Rica. 2005

6
CUANTIFICACIN DE ACIDO GAMMA-AMINOBUTRICO Y
GLUTAMATO EN CEREBRO DE RATA

Informe presentado a la Escuela de Biologa del Instituto Tecnolgico de
Costa Rica como requisito parcial para optar al ttulo de Bachiller en
Ingeniera en Biotecnologa

Miembros del Tribunal

_______________________________
Miguel Rojas Chvez, PhD
Profesor asesor

____________________________ __________________________
Jaime Fornaguera Tras, PhD Silvia Benavides Varela, Bach
Asesor externo Lectora

7
DEDICATORIA

A papi y a mami, por su amor incondicional

8

AGRADECIMIENTOS

La autora desea dejar constancia de su agradecimiento:

A Dios por darme el milagro de la vida, por mostrarme su amor y sencillez a travs
de la creacin y por ensearme que las contrariedades no son motivo de
desesperacin, sino el inicio de una nueva leccin sobre la vida.

A Ral, mi futuro esposo, por estar siempre a mi lado, por ser mi apoyo en
momentos difciles y por ser una razn importante de mi vida, de mi amor y de mi
felicidad.

A papi por su amor, su apoyo, su dedicacin constante y su enorme deseo de que
nosotros sus hijos, logremos una educacin universitaria y una vida plena.

A mami, por su amor, su apoyo, su cuido, sus consejos y por ensearnos a ser
personas crticas, independientes y de buen corazn.

Al Doctor Miguel Rojas, por estar siempre pendiente de mi formacin profesional y
por brindarme tan valiosos consejos en lo personal.

A Silvia Benavides, cuyo desempeo en el laboratorio constituy en todo momento
un desafo para mi misma y una inspiracin, pero sobre todo por ser una amiga tan
especial.

A Liz Vega por su colaboracin en el desarrollo de este trabajo, por ser una persona
honesta y servicial, y por su maravillosa amistad.

A la Master Elvira Salas, por su ayuda profesional y su preocupacin a lo largo de la
realizacin de este trabajo.

Al Doctor Jaime Fornaguera, por permitirme disfrutar de tan valiosa oportunidad, por
haber sido en todo momento, un mentor y un amigo, pero muy especialmente, por
haber puesto su confianza en mi persona, porque eso signific un crecimiento
personal y profesional muy grande.

A todo el equipo de neurociencias, por hacerme sentir parte de su familia.
9
NDICE GENERAL

RESUMEN.................................................................................................................. i
DEDICATORIA.............................................................................................................ii
AGRADECIMIENTOS.................................................................................................iii
INDICE GENERAL......................................................................................................iv
INDICE DE CUADROS................................................................................................v
INDICE DE FIGURAS.................................................................................................vi
1.INTRODUCCIN....................................................................................................15
1.1 OBJETIVO GENERAL Y ESPECFICOS.............................................................18
2. REVISIN DE LITERATURA................................................................................20
2.1Fundamentos de la neurotransmisin...................................................................20
2.2 Neurotransmisores...............................................................................................25
2.3Glutamato y GABA................................................................................................27
2.4 Sistema Lmbico..................................................................................................36
2.5 Miedo y Estrs.....................................................................................................37
2.6 Depresin y Ansiedad..........................................................................................38
2.7 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin......................................................... 46
3. METODOLOGA....................................................................................................52
3.1 Evaluacin del protocolo de referencia para el anlisis de aminocidos
transmisores..............................................................................................................52
3.2 Extraccin y Procesamiento de Cerebros de Rata para su
anlisis.......................................................................................................................57
3.3 Evaluacin de la resolucin del mtodo en homogeneizados de cerebro
(protocolo de Rowley, 1995)......................................................................................58
3.4 Optimizacin del protocolo para el anlisis de GABA y
Glutamato..................................................................................................................59
3.5 Pruebas de calidad en el mtodo desarrollado....................................................63
3.6 Calibracin de equipos y pruebas de idoneidad al sistema HPLC......................67
3.7 Bsqueda de Hojas de Seguridad (MSDS, por sus siglas en ingls)..................68
3.8 Protocolo de limpieza...........................................................................................68
4.RESULTADOS........................................................................................................70
transmisores..............................................................................................................70
(protocolo de Rowley, 1995)......................................................................................72
4.3 Optimizacin de protocolo para el anlisis de GABA y Glutamato......................73
10
5.DISCUSIN............................................................................................................89
6.CONCLUSIONES.................................................................................................103
7.RECOMENDACIONES.........................................................................................105
8.BIBLIOGRAFA.....................................................................................................107
9.ANEXOS...............................................................................................................117

11

INDICE DE CUADROS

Nm. Ttulo Pg.
1
Ocho criterios para determinar si un compuesto
neuroregulatorio es un verdadero neurotransmisor
26
2
Categoras de Neurotransmisores y sus estructuras
27
3
Concentraciones de los aminocidos transmisores e
interferentes (en moles/L) para anlisis de linealidad
66
4
Tiempos de retencin aproximados de cada aminocido
transmisor por separado en fase mvil (25% metanol, pH
4,5), a una sensibilidad de 20nA, a temperatura ambiente
(25,4 + 0,05C).
70
5
Valores de R de cada aminocido e interpretacin
obtenidos segn la frmula: R= 2 * [(T
R
)
B
-(T
R
)
A
/ W
A
+ W
B
)
71
6
Tiempos de retencin de cada aminocido segn la
composicin qumica de la fase mvil. Temperatura de
anlisis 26-27C.
73
7
Comparacin de los tiempos de retencin de cada
aminocido segn el pH de la fase mvil.
75
8
Comparacin de las tres mejores fases mviles
desarrolladas y del protocolo de referencia. Temperatura
de evaluacin: 21,0+ 1C
78
9
Relacin entre la intensidad aplicada y la respuesta en
Mv.s de los transmisores: glutamato, glutamina y GABA.
81
10
Resultados obtenidos de las pruebas de repetibilidad en un
solo da para los distintos aminocidos en matriz
83
11
Coeficiente de correlacin asociado a cada transmisor,
segn la concentracin de OPA agregada (puntos
inferiores de la curva de linealidad)
86
12
Coeficiente de correlacin asociado a cada aminocido,
segn la concentracin de OPA agregada (puntos
superiores de la curva de linealidad).

86

12
NDICE DE FIGURAS

Nm. Ttulo Pg.
1 Representacin esquemtica de una neurona y sus partes 20
2 Representacin esquemtica de una sinpsis 21
3 Representacin esquemtica de las uniones espaciosas 22
4 Sinapsis qumica: liberacin de neurotransmisores. 24
5 Flujo de iones a travs de un canal abierto en la membrana de
una neurona postsinptica.
24
6 Diagrama de uno de los mecanismos de accin por mensajeros
secundarios mediados por protena G
39
7 Modelo ms complejo de la activacin de cascadas celulares por
medio de receptores metabotrpicos.
30
8 Accin del neurotransmisor GABA y sus agonistas (las
benzodiazepinas), en la apertura del canal de Cl
-
de su receptor
GABA
A
.

33
9 Diagrama del ciclo GABA/Glutamato-Glutamina y localizacin
especfica de las enzimas involucradas.
35
10 Modelo del sistema lmbico segn Papez y Mac Lean. 36
11 Tomografa de emisin de positrones de una persona con
desorden bipolar
39
12 Posibles reas cerebrales afectadas en episodios depresivos
unipolares y bipolares
41
13 Propuesta del balance bioqumico en personas sanas y en
personas con depresin
42
14 . Probables vas serotonrgicas y regiones blanco en desrdenes
de ansiedad.
45
15 Esquema general de un sistema cromatogrfico 47
16 Representacin qumica de un aminocido derivatizado con OPA 50
17 Representacin de la reaccin qumica entre OPA, un grupo
sulfito y un aminocido.
51
18 Procedimiento de extraccin y procesamiento de la muestra 60
19 Sistema de enfriamiento con hielo Gel

61
20 Cromatograma de los cinco aminocidos evaluados y sus
respectivos tiempos de retencin, a una temperatura de 25,4+1C;
un flujo de 0,65ml/min, un potencial de 850mV; y una intensidad
de 20nA.
70
21 Interferencia entre los picos de GABA (100M) y OPA (43mM), a
una temperatura de anlisis de 26,0 1C; un flujo de 0,65ml/min,
un potencial de 850mV; y una intensidad de 20nA

71
22 Cromatograma de homogenizados de corteza temporal de
cerebro, bajo las condiciones cromatogrficas del protocolo de
Rowley (1995)
71
23 Comparacin de las cuatro fases mviles creadas a
concentraciones crecientes de metanol (pH 4,5).
73
24 Cromatogramas representativos de cada concentracin de
metanol; a pH 4,5; para cinco aminocidos (100M).
73
25 Grfica comparativa de las fases mviles de igual concentracin
de metanol (23%) y diferente pH para cinco aminocidos
(100M).
75
26 Cromatogramas representativos de cada pH; en fase mvil al 23% 75
13
de metanol para cinco aminocidos (100M).
27 Cromatogramas de las tres mejores fases mviles desarrolladas. 76
28 Cromatograma de una muestra de corteza temporal diluda 1/10.
Condiciones cromatogrficas: 23% MEOH; pH 5,5
77
29 Representacin grfica de la relacin entre pH y temperatura 78
30 Grfica del comportamiento de los tiempos de retencin de cada
aminocido frente a variaciones en la temperatura.
79
31 Cromatogramas de la misma fase mvil (23% metanol, pH 5,5)
realizados a diferentes flujos
80
32 Intensidad de corriente ptima para el anlisis de Glutamato,
Glutamina y GABA
81
33 Respuesta comparativa porcentual de las reas de los picos de
los cinco aminocidos (100M) por cromatograma, segn la
cantidad de L de solucin de derivatizacin aadida
82
34 La grfica muestra una comparacin entre las reas relativas de
los aminocidos por cromatograma, al variar la cantidad de
solucin de derivatizacin aadida (OPA 43mM).
83
35 Curvas de linealidad de las cuatro ltimas concentraciones de
Glutamato (A) y Glutamina (B) en matriz, y de las ltimas cinco de
GABA (C); derivatizadas con 22 L de solucin de derivatizacin
(OPA 86mM).
86
36 Producto de la reaccin entre OPA, -ME y una amina primaria. 90
37 Representacin de la reaccin qumica entre OPA, un grupo
sulfito y un aminocido.
91
38 Corridas realizadas bajo los mismos valores de pH evaluados
pero bajo condiciones cromatogrficas y de fase mvil distintas
95
39 Cromatograma de una muestra de homogeneizado de corteza
temporal (azul). Fase mvil 23%,pH 5,5; flujo 0,3ml/min,
temperatura: 5-7C
116
40 Cromatograma obtenido con una fase mvil al 23% pH 5,0 a partir
del anlisis de una muestra de corteza temporal.
116

14
NDICE DE ANEXOS

Nm. Ttulo Pg.

1
Cromatograma logrado tras la optimizacin de las
condiciones recomendadas en este trabajo para el
anlisis de muestras de cerebro

2 Protocolo de referencia

3 Hojas de calibraciones por PROCAME

117
4 Gua de calibracin del electrodo

5 Hojas para el registro de datos

6 Protocolo de limpieza del electrodo de trabajo

15
1. INTRODUCCIN

A partir de 1999, el Ministerio de Salud de Costa Rica, ha coordinado
actividades de investigacin con el fin de valorar el estado actual de los servicios de
atencin de la Caja Costarricense de Seguro Social (CCSS). En dicha investigacin,
fue revelada la necesidad de plantear nuevos lineamientos y estrategias de accin
en el rea de la salud mental, fundamentalmente por la falta de prioridad concedida
a este tema en el pasado. A pesar de la constante reestructuracin que se ha venido
dando en los servicios de la CCSS, an existen debilidades en el sistema de salud
como la inexistencia de polticas y de un plan de salud mental integrador de
acciones o proyectos intersectoriales de salud mental nacionales. Adicionalmente,
existe una gran necesidad de llevar a cabo investigaciones cientficas para llenar
vacos de conocimiento en esta rea de la salud (Ministerio de Salud, 2002;
Ministerio de Salud, 2004).

Segn, las ltimas encuestas realizadas por la CCSS, en el perodo 1987-
2002, la proporcin de consultas externas psiquitricas respecto al total de
consultas, presentaba valores de alrededor del 4% (Ministerio de Salud, 2004). No
obstante, los trabajos estadsticos realizados hasta el momento, no incluyen un
sondeo muestral al azar de la poblacin, lo cual constituye una interrogante en
cuanto a la verdadera incidencia de las enfermedades mentales en Costa Rica. Sin
embArgo, aunque en el pas no existen estudios epidemiolgicos recientes, se
estima que los trastornos mentales se han incrementado en funcin de las
variaciones ocurridas en el perfil demogrfico y los cambios sociales, econmicos y
culturales que han tenido impacto en la sociedad costarricense en los ltimos
decenios. El impacto negativo de esos factores en la salud mental, se hace evidente
en situaciones que comprometen el funcionamiento social del individuo y la familia,
su equilibrio emocional y el despliegue de sus potencialidades (Ministerio de Salud,
2004).

Adicionalmente, los trastornos mentales y, particularmente, la depresin,
tienen un impacto socioeconmico muy importante, al constituir una de las primeras
causas de discapacidad y de enfermedad en el mundo (Institute of Medicine, 2001).
Los datos generados por un estudio, sobre la carga global impuesta por las
enfermedades somticas y psicolgicas, realizado por la Organizacin Mundial de la
Salud, el Banco Mundial y la Universidad de Harvard, revelaron que las
enfermedades mentales, incluyendo el suicidio, ocupan el segundo lugar de la cArga
global por enfermedades, en economas mundiales establecidas. Los desrdenes
16
neuropsiquitricos constituyeron en el 2004, un 13% de la carga global por
enfermedades, una carga mayor que la producida por el Sndrome de
ImMunodeficiencia Humana (SIDA), la tuberculosis y la malaria juntas (11,4%). A
pesar de esto, las enfermedades mentales y sus efectos sobre la salud y la
productividad de un pas, tienden a ser subestimados. (Banco Mundial, 2004;
Institute of Medicine, 2001).

En este contexto, le atae al cientfico, la implementacin de mtodos que
permitan el estudio de la enfermedad de forma complementaria a los esfuerzos
realizados por diversas entidades a nivel nacional e internacional, con el objetivo
ltimo de hallar mejores formas de diagnstico temprano y de tratamiento, y de
contribuir al conocimiento sobre el origen y naturaleza de las enfermedades
mentales.

Las tcnicas modernas para investigar el funcionamiento del cerebro, han
hecho una contribucin significativa a la biologa de las emociones y a la
neurofisiopatologa. Dichas tcnicas abarcan herramientas para el estudio
psicolgico, fisiolgico y bioqumico del cerebro. Algunas de las tecnologas
empleadas en mediciones psicofisiolgicas son: el electroencefalograma (EEG)
(para detectar la actividad elctrica del cerebro), potencial cerebral en relacin a un
evento (ERP) (que consiste en el registro de fluctuaciones de voltaje asociadas en el
tiempo con un evento fsico o mental), electromiograma (EMG, que mide la actividad
del msculo), pupilometra (medida en el cambio del tamao de la pupila),
electrooculografa (EOG, medida del movimiento del ojo), actividad electrodermal
(EDA, medida del nivel de electricidad en la superficie de la piel), fMRI (sistema de
proyeccin de imgenes in vivo por resonancia magntica) y tomografa de emisin
de positrones (PET) para estudios funcionales corticales y subcorticales (Andreassi,
2000; Johansson, et al, 1999; Picton; 2000). Por otro lado, algunas de las
herramientas bioqumicas utilizadas en el estudio de compuestos neuroactivos,
actividad neuronal y relaciones espaciales de los sistema neuronales, son: la
histoqumica de hibridizacin in situ (por medio del uso de sondas oligonucleotdicas
para la localizacin de sitios de transcripcin de neuropptidos), la
imMunocitoqumica (ICC, para el mapeo celular y subcelular de neurotransmisores
aminoacdicos y neuropptidos), radioinmunoensayos (RIA) y ensayos
imMunoenzimticos (ELISA), (complementos de la cuantificacin de neuropptidos),
hibridizacin in situ cuantitativa (para la cuantificacin exacta, especfica y
17
reproducible de transcritos de ARNm presentes en secciones de tejido) y la
cromatografa de gases o lquida (Johansson, et al, 1999; Rayne, 1997).

Una variante de esta ltima tcnica, es la cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC, por sus siglas en ingls), que es una herramienta de
cuantificacin qumica de alta sensibilidad y especificidad (Cazes, et al; 2002).

Dado que el comportamiento est gobernado por regiones especficas del
cerebro y por la presencia de neurotransmisores sinpticos particulares, que se
encuentran en baja concentracin (ng/ml pg/ml), la cromatografa lquida de alta
resolucin, se perfila como herramienta clave para el estudio de eventos fisiolgicos
y fisiopatolgicos en regiones especficas del cerebro (Wilbourn, et al; 2003;
Lingeman,H, et al; 1990).

En el pas, el Programa de Investigacin en Neurociencias (PIN), de la
Universidad de Costa Rica (UCR), posee un inters especial por el estudio de los
fenmenos psicofisiolgicos, involucrados en la incidencia especfica de la
depresin y la ansiedad. Dichos trastornos figuran en segundo y tercer lugar de
prioridad nacional dentro del conjunto de enfermedades mentales de mayor
trascendencia e inters comunitario, segn el informe realizado en el 2002, por el
Ministerio de Salud (Ministerio de Salud, 2002). La fuerte relevancia que tiene el
estudio de estas enfermedades en la sociedad actual, condujo a una coordinaron de
esfuerzos con el PIN para la realizacin de este trabajo. La labor, se centra
primordialmente en el desarrollo de un protocolo por HPLC para la cuantificacin
fiable de dos neurotransmisores, en cerebro de ratas. Eventualmente, el PIN podr
desarrollar modelos experimentales para el estudio por HPLC, de las
concentraciones de estos dos neurotransmisores, en trastornos mentales de
depresin y ansiedad, entre otros. Algunos de los neurotransmisores, que en niveles
anormales, han sido asociados con la fisiopatologa de la depresin y la ansiedad,
son: la dopamina (DA), la noradrenalina (NA), la serotonina (5-HT), el cido gamma-
aminobutrico (GABA) y el Glutamato (Johansson, et al, 1999; Wilbourn, et al; 2003).
Sin embArgo, el laboratorio ya cuenta con los protocolos necesarios para el anlisis
de DA, NA y 5-HT. Adicionalmente, se analizaron los neurotransmisores: GABA y
Glutamato, que tambin han sido implicados en dichos desrdenes. Sin embArgo, la
informacin especficamente asociada a la concentracin de GABA y Glutamato en
cerebro o regiones especficas del mismo es limitada, y por tanto, es necesario que
18
estos aminocidos sean estudiados con mayor profundidad en sujetos normales e
individuos con depresin y/o ansiedad.
Para lograr la cuantificacin exitosa de estos dos neurotransmisores, es
imprescindible la correcta seleccin, recoleccin y procesamiento de la muestra.
Existen diferentes tipos de muestras que podran ser utilizadas para las
determinaciones cuantitativas de GABA y Glutamato, como por ejemplo: Lquido
Cefalorraqudeo (LCR) obtenido por puncin cervical en ratas (Huang, S; 2004;
Wang,1988); lquido extracelular cerebral obtenido por la tcnica de microdilisis,
prctica que consiste en la perfusin de regiones especficas cerebrales, con
soluciones de Ringer y en la difusin y posterior recoleccin de molculas (i.e
neurotransmisores) a travs de una cnula de dilisis de pequeo dimetro
(<300m) (Rayne, 1997); y homogeneizados de cerebro, muestra obtenida de la
fragmentacin del tejido cerebral total (espacios intra y extracelulares) proveniente
de regiones especficas del cerebro. El personal del PIN cuenta con un protocolo
para la extraccin y homogenizacin de tejido cerebral de rata, por consiguiente, se
utilizaron homogeneizados de cerebro, como tipo de muestra, en esta investigacin.

Finalmente, el protocolo implementado para la cuantificacin de GABA y
Glutamato, fue seleccionado a partir del anlisis de varios trabajos publicados en
revistas cientficas calificadas. El procedimiento elegido para el anlisis de dichos
neurotransmisores deba cumplir con tres condiciones principalmente: en primer
lugar, ser eficiente en la separacin y cuantificacin especfica de GABA y
Glutamato, principalmente, en segundo lugar, ser econmicamente viable y en
tercer lugar, ser compatible con el sistema de cromatografa lquida de deteccin
electroqumica presente en el PIN.

El protocolo desarrollado en esta investigacin, podr ser utilizado como
mtodo de apoyo en el estudio de la depresin y la ansiedad y al mismo tiempo,
generar conocimientos cientficos al respecto en beneficio del rea de la salud.

OBJETIVO GENERAL

- Implementar y optimizar un mtodo confiable de cromatografa lquida de alta
resolucin con deteccin electroqumica, para la cuantificacin de GABA y
Glutamato.

19

OBJETIVOS ESPECFICOS

- Implementar un procedimiento por Cromatografa Lquida para la cuantificacin
de los neurotransmisores GABA y Glutamato, que posea los mejores resultados
(buena resolucin de picos correspondientes a GABA y Glutamato; menor
tiempo total de anlisis, alta sensibilidad) y que sea conveniente para el
laboratorio del Programa de Investigaciones en Neurociencias de la UCR.

- Evaluar aquellas condiciones qumicas y fsicas necesarias (modificacin
qumica de la fase mvil: porcentaje de metanol y pH; flujo en mL/min,
temperatura en C, corriente aplicada en mV.s, concentracin de o-ftalaldehdo y
cantidad de reactivo de derivatizacin ms adecuada para la derivatizacin de
aminocidos en un rango de concentracin), tomando como base los resultados
obtenidos en estudios anteriores, as como, los fundamentos qumico-fsicos de
la experimentacin.

20
2. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Fundamentos de la Neurotransmisin

- Neuronas y neuroglia

Dentro del sistema nervioso existen dos tipos celulares: las clulas
neurogliales y las neuronas. Las neuronas son las clulas responsables de transmitir
el impulso nervioso. Todas las neuronas poseen un cuerpo celular, un axn, botones
terminales y dendritas (figura 1). El cuerpo celular contiene el ncleo, el cual
controla la actividad celular. El axn, se extiende fuera del cuerpo de la neurona y
permite la transmisin de seales a otras neuronas. Las dendritas, que son
extensiones celulares permiten la transmisin del impulso nervioso. (Stirling, 2002;
Andreassi, 2000).

Figura 1. Representacin esquemtica de una neurona y sus partes
Modificado de: Stirling; 2002

Las clulas gliales por su parte son las clulas encArgadas de brindar sostn
al sistema nervioso, aunque ms recientemente se les han atribuido otras funciones.
Los tipos de clulas gliales incluyen: los oligodendrocitos, la microglia, los astrocitos
y las clulas de Schwann (Stirling, 2002)

- Comunicacin interneuronal

La comunicacin intercelular existe en los diversos tipos zoolgicos y entre
los diferentes tejidos y tipos celulares (Fanjul, et al; 1998). A continuacin, se
describen las caractersticas propias de las relaciones interneuronales, los subtipos
21
de comunicacin existentes entre clulas nerviosas y los tipos de molculas que
intervienen en este proceso.

Las clulas nerviosas estn conectadas a travs de sinapsis (contactos)
(figura 2). El trmino sinapsis fue introducido por Charles Sherrington a principios del
siglo pasado para describir la zona especializada de contacto, en la cual, una
neurona se comunica con otra. El anatomista, Ramn y Cajal, describi la sinapsis
como un sitio de comunicacin interneuronal compuesto de tres elementos: una
terminal nerviosa presinptica, una terminal postsinptica y un espacio sinptico.
Adems de las sinapsis que una neurona establece con otra, algunas neuronas
establecen sinapsis con clulas musculares o con clulas secretoras (Ruiz; 2005;
Nestler, et al; 2001; Haris, J, et al; 2000).

Figura 2. Representacin esquemtica de una sinpsis
Modificado de: Asociacin educar, 2006

Existen dos tipos de comunicacin interneuronal: una de tipo elctrica y otra
de tipo qumica. Las relaciones entre clulas neuronales en contacto directo, se dan
por medio de impulsos elctricos. En una sinapsis elctrica, las membranas
presinptica y post sinptica se tocan y el citoplasma de las clulas est
estrechamente interconectado por medio de canales inicos especiales llamados
uniones espaciosas, formados a su vez, por subunidades proteicas llamadas
conexinas (figura 3). Estos canales, permiten el flujo de una corriente elctrica (flujo
22
de iones), entre una clula y otra. Las uniones espaciosas presentes entre las
clulas neuronales proveen una va de baja resistencia (alta conductancia) para el
paso de la corriente entre la membrana presinptica y postsinptica. Dicha corriente
deposita, a su paso, una carga positiva, lo que provoca una depolarizacin de la
membrana presinptica primero, y la postsinptica despus. En consecuencia, el
flujo de iones a travs de uniones espaciosas permite la comunicacin entre una
clula y la siguiente. Anlogamente, a la cada de las piezas de domino colocadas
en fila, el impulso nervioso se expande de una neurona a la siguiente, con la
diferencia de que una vez que ha pasado por ellas, las neuronas vuelven a su
estado de reposo inicial, a la espera de un nuevo impulso nervioso (Matthews,G;
2000; Kandel, et al; 2000; Stirling; 2002).

Figura 3. Representacin esquemtica de las uniones espaciosas.
Modificado de: Aidley, D,1998

Por otra parte, la sinapsis qumica, consiste en el paso de informacin, a
travs de pequeas molculas que actan como mensajeros qumicos. Dichos
mensajeros qumicos son llamados neurotransmisores (Fanjul, et al; 1998).

En las sinapsis qumicas, la llegada de impulsos (tambin llamados
potenciales de accin), producen la liberacin de transmisores al espacio sinptico,
los cuales, son reconocidos por receptores especficos ubicados en la membrana
postsinptica (Fanjul, et al; 1998).

Conexinas
Canales de iones
23
El orden de eventos ocurridos en una sinapsis qumica es el siguiente:

a. Ocurre un cambio en el potencial presinptico
b. Se da una depolarizacin de la terminal sinptica
c. Se liberan los neurotransmisores
d. Los neurotransmisores se unen a receptores especiales en la clula
postsinptica
e. Ocurre un cambio en la permeabilidad inica de la clula postsinptica
f. Se da un cambio en el potencial de membrana de la clula postsinptica

Los potenciales de accin que llegan a la terminal de una neurona
presinptica, inducen la liberacin de neurotransmisores al espacio sinptico (figura
4). El espacio sinptico contiene lquido extracelular, el cual, a su vez, contiene
iones y enzimas disueltos en agua. Los neurotransmisores que sern liberados al
espacio sinptico se encuentran almacenados en pequeas vesculas llamadas
vesculas sinpticas. Una vez en el espacio extracelular, los neurotransmisores se
dirigen hacia receptores sinpticos particulares en la membrana postsinptica.
Cuando los neurotransmisores alcanzan sus receptores correspondientes en la
membrana postsinptica, se abren canales transmembranales que permiten el flujo
de iones al interior de la clula postsinptica (figura 5), produciendo un efecto
especfico: excitatorio o inhibitorio, dependiendo de la selectividad inica del canal
postsinptico. Finalmente, la accin de un neurotransmisor es detenida por la accin
de las enzimas presentes en el espacio sinptico (por ejemplo: la
monoaminooxidasa) o bien mediante un proceso de recaptacin de transmisores por
la clula presinptica (Stirling; 2002; Fanjul, et al; 1998; Ruiz; 2005).

Las sinapsis qumicas y elctricas mantienen diferencias funcionales
importantes, que deben ser consideradas. Por una parte, la sinapsis elctrica se
utiliza en depolarizaciones simples de la membrana y no para acciones inhibitorias o
cambios de larga durabilidad en terminales postsinpticas. De forma contraria, las
sinapsis qumicas pueden transmitir seales de intensidad y tiempo variable, tanto
de tipo excitatorio como inhibitorio y por tanto, pueden producir comportamientos
ms complejos. Ms an, parece existir una relacin entre el nivel de
neurotransmisores y los estados de concentracin, una mejor o peor memoria, la
ansiedad y la depresin, entre otros. Adems, se ha demostrado que manipulando
los niveles de neurotransmisores mediante el uso de ciertas drogas pueden
modificarse el humor, las emociones y las facultades cognitivas ( Ruiz; 2005).
24

Figura 4. Sinapsis qumica: liberacin de neurotransmisores.
Modificado de: Stirling, 2002

Figura 5. Flujo de iones a travs de un canal abierto en la membrana de una neurona
postsinptica. Modificado de: Matthews; 2003.
25
2.2 Neurotransmisores

Los neurotransmisores son sustancias qumicas que se encuentran
en el sistema nervioso y guan la transmisin de los impulsos entre las neuronas a
travs de las sinapsis (Nemiah, 1996). Se han establecido ocho criterios para
determinar si un compuesto es un verdadero neurotransmisor (Nemiah, 1996).
Dichos criterios se exponen en el cuadro 1.

Cuadro 1. Ocho criterios para determinar si un compuesto neuroregulatorio es
un verdadero neurotransmisor

a. La sustancia debe estar presente en neuronas presinpticas, usualmente
en una distribucin desigual a travs del cerebro.
b. Los presursores de neurotransmisores y las enzimas sintticas deben
estar presentes en la neurona, usualmente prximas al sitio de accin.
c. La estimulacin de sitios aferentes (terminales presinpticas) deben
provocar la liberacin de la sustancia en cantidades fisiolgicamente
significativas.
d. Los receptores especficos que interacan con la sustancia deben
encontrase prximos a las neuronas presinpticas.
e. La interaccin de la sustancia con sus receptores debe inducir cambios en
la permeabilidad de la membrana postsinptica provocando un potencial
inhibitorio o excitatorio postsinptico en la clula postsinptica.
f. Deben existir mecanismos especficos de inactivacin que detengan la
interaccin de la sustancia con su receptor en un rango de tiempo
fisiolgico razonable.
g. Las intervenciones de drogas de tipo agonista en sitios postsinpticos
deben imitar la accin de la sustancia y los antagonistas deben bloquear
su efecto.

Fuente: Brown ,R;1994

Existen varias categoras de neurotransmisores que incluyen:
neurotransmisores aminoacdicos como cido -aminobutrico (GABA) y Glutamato;
aminas biognicas como la dopamina y la norepinefrina; pptidos; gases como el
xido ntrico y nuclesidos como adenosina (Stirling,2002). Algunos
neurotransmisores promueven un efecto exclusivamente excitatorio como el
Glutamato, o inhibitorio, como el GABA. Otros neurotransmisores, pueden ser
inhibitorios en ciertas sinapsis o excitatorios en otras. La versatilidad con la que un
26
transmisor induce respuestas de carcter opuesto, se basa en que ciertas molculas
neurotransmisoras pueden unirse a receptores distintos. Por ejemplo, la acetilcolina
(Ach), posee una influencia excitatoria en los receptores llamados Ach nicotnicos y
una influencia inversa en otro tipo de receptores llamados: Ach muscarnicos
(Stirling,2002). En el cuadro 2 se mencionan algunos de los neurotransmisores ms
importantes del sistema nervioso, su clasificacin y estructura qumica.

Cuadro 2. Categoras de Neurotransmisores y sus estructuras
Categora Neurotransmisor Estructura

A.Transmisores
aminoacdicos

- Inhibitorios:
GABA
Glycina
- Excitatorios:
Glutamato
Aspartato
B.Monoaminas
- Catecolaminas:
Norepinefrina

Dopamina

Epinefrina

- Indolaminas

Serotonina

C.Neurotransmisores
colinrgicos
Acetilcolina

D. Neuropptidos
Sustancia P
Met- encefalina (endorfina)

F. Nuclesidos Adenosina

27
G.Gases Oxido Ntrico
N=O
Fuente: Arslan, 2001; Nestler, et, al; 2001.
2.3 Glutamato y GABA

- El Glutamato

El Glutamato, es el neurotransmisor excitatorio por excelencia de la corteza
cerebral humana y est involucrado en forma crtica con el aprendizaje y la
memoria, as como con la percepcin y el desempeo (Golan, 2004; Kasper, et al;
2003). Nuevas evidencias sugieren que el Glutamato contribuye con la fijacin de
memorias traumticas. Por lo tanto, podra estar involucrado con desrdenes de
ansiedad como el estrs post-traumtico. Asimismo, ste se ha asociado con el
aprendizaje del comportamiento evasivo presente en ataques de pnico y en
desrdenes de ansiedad social. Una de las teoras de la ansiedad propuestas,
apunta a que en el aprendizaje de la ansiedad, el Glutamato cumple una funcin
mediadora. Adicionalmente, varios autores sugieren, que el simple aumento de las
concentraciones de Glutamato puede provocar ansiedad (Kasper, et al; 2003).

Por otra parte, el Glutamato cumple junto con la neurotransmisin, otra
funciones biolgicas: es un precursor del GABA; es un componente intermediario del
metabolismo; forma parte de protenas y es adems, un substrato enrgtico (Bak;
et, al; 2006).

Se ha demostrado, que el Glutamato puede ser neurotxico bajo ciertas
condiciones de concentracin y tiempo de exposicin celular. Por ejemplo, si una
vez que el Glutamato ha sido liberado al espacio sinptico, no es recaptado
nuevamente o degradado, y permanece en el espacio extracelular por un tiempo
prolongado, puede resultar neurotxico (Bak, et, al; 2006).

Se estima que la concentracin normal de Glutamato en cerebro es de 10mM
intracelularmente, y de 2-5m extracelularmente. Ms especficamente, se estima
que la concentracin de Glutamato en las vesculas sinpticas puede alcanzar un
rango de 60-210mM y en el momento en el que se propaga el impulso nervioso, se
pueden liberar en cada sinapsis, entre 2000 y 5000 molculas de Glutamato. Con la
activacin de la sinapsis, el espacio sinptico puede alcanzar concentraciones de 1-
5 mM de Glutamato. Las molculas de Glutamato pueden recorrer por difusin, una
28
distancia de 0.5 a 1 m para poder activar los receptores Glutamatrgicos
correspondientes en la membrana postsinptica (Bak, et, al; 2006).
Los receptores de Glutamato pueden dividirse en dos tipos: ionotrpicos y
metabotrpicos. Los primeros corresponden a canales inicos especficos para
cationes y segn el tipo de molcula que los active (agonista), se clasifican en
receptores MMDA (N-metil-D-aspartato), AMPA (-amino-3.hidroxi-5-metil-4-
isoxasolpropionato) y kainato. Los receptores AMPA median la actividad excitatoria
rpida y son permeables al in sodio (Na
+
), principalmente, aunque tambin
permiten el paso del in Ca
2+
, dependiendo de las subunidades proteicas que lo
conformen. La actividad de los receptores MMDA es dependiente de la activacin de
AMPA, debido a que los receptores MMDA son bloqueados fisiolgicamente por el
ion Magnesio (Mg
2+
). Al ser activados los receptores AMPA, el Mg
2+
que bloquea el
poro del receptor MMDA se libera, por depolarizacin membranal, permitiendo al
Glutamato y a la glicina (otro neurotransmisor), activar al receptor MMDA. Este
mecanismo, finalmente induce la entrada de iones Na
+
y Ca
2+
dentro del receptor
MMDA y por lo tanto, la excitacin de la neurona. Por ltimo, los receptores de
kainato no son bien conocidos an, por lo que su papel fisiolgico en la transmisin
sinptica debe ser estudiado (Conn, 1994; Garca, et al; 2004; Bak, et al; 2006;
Siegel et al; 1994;).

Como fue mencionado anteriormente, otro tipo de receptores de Glutamato,
son los receptores metabotrpicos. Los receptores metabotrpicos se encuentran
acoplados a protenas G, las cuales, permiten el acoplamiento del receptor a
enzimas citoplsmicas (figura 6). Estos receptores inducen en distintos tipos
celulares el aumento de los niveles de calcio intracelular por medio de la hidrlisis
de molculas de fosfatidilinositol, lo que implica otro mecanismo de transduccin de
seal, en el cual, se desencadenan cascadas metablicas complejas cuyo resultado
es la activacin de la funcin celular. Para una idea ms clara, el mecanismo de
activacin de los receptores metabotrpicos y por ende de cascadas metablicas
intracelulares se genera de la siguiente forma (figura 7): la unin de un agonista al
receptor produce la activacin de una fosfodiesterasa (fosfolipasa C o PLC), la cual,
cataliza la hidrlisis de fosfatidilinositoles de membrana. El primer producto de la
reaccin es el fosfatidilinositol-4,5 bis fosfato (PIP
2
), el cual tambin es hidrolizado
enzimticamente, produciendo inositol 1,4,5 trifosfato (IP
3
) y diacil glicerol (DAG).
Dichos productos actan como mensajeros secundarios, intracelularmente. Por un
lado, IP
3
libera calcio de almacenes celulares, lo que incrementa los niveles de Ca
2+

intracelular. Los iones de Ca
2+
interactan a su vez con una gran variedad de
29
blancos celulares (quinasas, fosfatasas, canales inicos, otros). DAG por su parte,
reduce el requerimiento de calcio de una enzima dependiente de Ca
2+
, llamada
quinasa C (PKC ), lo que consecuentemente aumenta su actividad. La activacin de
receptores metabotrpicos resulta tambin en la activacin de otros mensajeros
secundarios como el cido araquidnico, el cual, influye en la produccin de
leucotrienos y prostanglandinas (relacionados con la comunicacin celular y
actividad hormonal); y en la activacin de guanilil ciclasa y adenilil ciclasa,
importantes en la produccin de GMP cclico y AMP cclico respectivamente (figura
7). Entre otras cosas, el papel que desempean los receptores metabotrpicos, en
el momento en el que se genera el impulso nervioso, es la modulacin del
comportamiento elctrico neuronal. Lo ltimo, se debe a que los canales inicos,
son uno de los sustratos de los mensajeros intracelulares generados a partir de la
activacin de los receptores metabotrpicos (figura 6). Al mismo tiempo, parece que
los receptores metabotrpicos son capaces de influenciar la transmisin sinptica
tanto en el sitio presinptico como en el postsinptico. Existen al menos siete
subtipos de receptores metabotrpicos (mGluR I,II,III,etc), clasificados y agrupados
segn su homologa de secuencia, farmacologa y acoplamiento a mecanismos de
sealizacin intracelular (Conn, 1994; Garca, et al; 2004; Bak, et al; 2006; Siegel et
al; 1994;).

Figura 6. Diagrama de uno de los mecanismos de accin por mensajeros secundarios
mediados por protena G. El neurotransmisor se une a su receptor de membrana generando
la activacin de la protena G, la cual, a su vez produce la activacin de enzimas que
generan mensajeros secundarios intracelulares. Estos ltimos inducen la apertura de
canales inicos, cuyo resultado final es el potencial postsinptico.
Modificado de: Nestler, 2001.

30

Figura 7. Modelo ms complejo de la activacin de cascadas celulares por medio de
receptores metabotrpicos. La va de la hidrlisis de fosfatidilinositoles de membrana, se
ilustra al lado derecho de la figura. A la izquierda y al centro, se ilustran otras vas de
activacin de mensajeros secundarios involucrados en la activacin de canales inicos.
VOCC: canales de calcio operados por voltaje; iGluR: receptores ionotrpicos de Glutamato
(i.e MMDA); CaMKII: protena quinasa C II, dependiende de calcio/calmodulina; cAMP: AMP
cclico; AC: Adenilil ciclasa; PKA: protena quinasa A; PLC: Fosfolipasa C; PI: fosfatidil
inositol; IP3: inositol 1,4,5 trifosfato (IP
3
) DAG: diacil glicerol. La figura muestra otros
procesos involucrados: la transcripcin de ADN y la plasticidad neuronal. Fuente: Herman, et
al; 2002.

31
- El cido gamma aminobutrico (GABA)

El estudio de este neurotransmisor, en el sistema nervioso de crustceos
permiti el descubrimiento de su naturaleza inhibitoria (Iversen, 2004). Como se
menciona anteriormente, el GABA es usado por la gran mayora de interneuronas
(conexiones neuronales) del SNC, como neurotransmisor de tipo inhibitorio. Algunos
estudios sugieren que el GABA est involucrado, aproximadamente, en un cuarto de
todas las sinapsis que se dan en el cortex cerebral (Shulman,R; 2004). Otros
autores sugieren que el GABA constituye al menos un 40% de todas las sinapsis
(Tanaka, et al; 1996).

La evidencia definitiva de que el GABA era un neurotransmisor surgi hace
30 aos, gracias al trabajo de Krnjevic y colegas (1966), quienes observaron que
esta sustancia formaba parte de la sinapsis inhibitoria en cortex de mamferos, y
mediaba un aumento de la conductancia de la membrana, al paso de iones Cl
-
(pueden ser tambin iones HCO
3
-
) (Tanaka, et al; 1996; Alger, et al; 2001).

El paso de iones Cl
-
es un evento importante en la prevencin del inicio de un
potencial de accin. Este flujo de iones Cl
-
hacia el interior de la clula constituye
una va rpida de hiperpolarizacin de la clula, a lo que tambin se le llama
corriente rpida postsinptica inhibitoria. Lo anterior lleva a la clula a un potencial
lejos del rango de activacin sinptica dependiente de corriente, como por ejemplo,
lejos de aquel mediado por receptores Glutamatrgicos MMDA que permiten la
entrada de Na
+
(Alger, et al; 2001).

Adicionalmente, se sugiere que el GABA tiene una accin inhibitoria sobre
otros sistemas de neurotransmisores como dopamina y norepinefrina (Kasper et al;
2003).
Se estima que la concentracin normal de GABA en cerebro es de 2-5mol/g
de tejido fresco. Adems, se sugiere, que la concentracin de GABA en cierto tipo
de clulas cerebelares llamadas clulas de Purkinge, puede alcanzar
concentraciones de 50 a 100mM. Por otro lado, la concentracin de GABA en el
lquido intersticial se mantiene a niveles muy bajos (<1M) (Kasper et al; 2003).

A nivel fisiopatolgico, la obtencin de datos clnicos y farmacolgicos
sugieren que el GABA se encuentra alterado durante desrdenes afectivos como la
depresin y la ansiedad. Varios investigadores han reportado concentraciones
32
considerablemente bajas de GABA en pacientes con depresin a diferencia de
grupos control de pacientes no depresivos (Golan, 2004; Hayward, 2003; Kasper et
al, 2003). Recientemente, se demostr que los niveles de GABA en el lbulo
occipital de pacientes depresivos presentan un decrecimiento de hasta un 52%.
(Kasper, et al; 2003).

Adems, se ha propuesto que los efectos del GABA en la depresin y la
ansiedad podran no influir en forma directa, sino como resultado de la mediacin de
otros sistemas de neurotransmisin serotoninrgicos y noradrenrgicos (Hayward,
2003).

Respecto a los tipos de receptores de GABA, al igual que los receptores
Glutamatrgicos, se subdividen en dos grupos: ionotrpicos (GABA
A
) y
metabotrpicos (GABA
B
). Se ha sugerido una tercera divisin de receptores
GABAnrgicos: los receptores GABA
C
(Tanaka, et al; 1996).

El tipo de Receptor GABA
A
pertenece a la familia de receptores de canales
inicos rpidos. El receptor est constituido por una estructura pentamrica, en la
cual, las protenas se distribuyen alrededor de un poro central, a travs del cual, los
iones de Cl
-
fluyen de manera selectiva (figura 8). La composicin y disposicin
proteica de este tipo de receptor puede variar, por lo que la familia de receptores
GABA
A
, presenta una alta heterogeneidad (Tanaka, 1996).

Por otra parte, los receptores GABA
B,
pertenecen tambin a una familia de
alta heterogeneidad. Este tipo de receptor se caracteriza por mediar eventos
postsinpticos lentos, caracterizados por un aumento de conductancia de iones
potasio (K
+
) y una supresin de conductancia de iones Ca
2+
en las terminales
nerviosas (Tanaka, 1996).

Los receptores de GABA han sido importantes sitios blanco para la accin de
ciertos medicamentos. En especial, los receptores GABA
A
,

han demostrado tener
sitios afines a medicamentos como las benzodiazepinas (de accin sedante y
msculo-relajante), lo cual, permite manipular la respuesta bioqumica de los
receptores y modificar la respuesta a GABA (Doble, A, et al; 2004).

33

Figura 8. Accin del neurotransmisor GABA y sus agonistas (las benzodiazepinas), en la
apertura del canal de Cl
-
de su receptor GABA
A
.
Fuente: Rusmidlernes biologi, 2000

34
- Ciclo GABA/Glutamato- Glutamina

Las clulas neuronales no son capaces de sintetizar GABA o Glutamato de
novo a partir de la Glucosa. Por ello, dependen de clulas especiales de sostn
llamadas astrocitos. Estas ltimas, permiten el mantenimiento de las reservas de
estos dos neurotransmisores en el cerebro. Se ha descrito un mecanismo de
produccin y recaptacin de GABA y Glutamato llamado ciclo GABA/Glutamato-
Glutamina. Dicho mecanismo, involucra las terminales sinpticas de neuronas
Glutamatrgicas y GABArgicas y astrocitos circundantes.

As, en la sinapsis Glutamatrgica, el Glutamato es tomado por los astrocitos
donde es amidado (con amonio libre, NH4
+
), y convertido en Glutamina por la
enzima Glutamina sintetasa. En las neuronas, la enzima Glutaminasa dependiente
de ATP (PAG), genera nuevamente Glutamato a partir de la Glutamina, liberando
amonio (figura 9a) (Bak,L;2006; Schulman,R et al; 2004).

Por otra parte, en la sinapsis GABArgica, el neurotransmisor GABA es
tomado en la terminal presinptica o bien, captado por los astrocitos circundantes.
En los astrocitos, el GABA es metabolizado en dos pasos a succinato, el cual, es
posteriormente metabolizado en -ketoGlutarato (-KG). Este ltimo compuesto, es
a su vez transformado en Glutamato. En la neurona, el GABA es sintetizado de
nuevo, a partir de Glutamato, por medio de la enzima Glutamato descarboxilasa
(GAD). (figura 9b) (Bak,L;2006; Schulman,R et al; 2004).

Adicionalmente, se sugiere que la Glutamina podra ser sintetizada a partir
de succinato va el ciclo de los cidos tricarboxlicos (Bak,L;2006; Schulman,R et al;
2004).

35

Figura 9. Diagrama del ciclo GABA/Glutamato-Glutamina y localizacin especfica de las
enzimas involucradas. En la figura a se muestra el ciclo Glutamato-Glutamina en una
sinapsis Glutamatrgica. La figura b muestra el ciclo GABA-Glutamina en una sinapsis
GABArgica. Abreviaturas: GAD:Glutamato descarboxilasa; GABA: cido gamma
aminobutrico; Gln: Glutamina; Glu: Glutamato GS: Glutamina sintetasa; -KG: -
cetoGlutarato; PAG: Glutaminasa dependiente de ATP; Suc:succinato; TCA: ciclo de los
cidos tricarboxlicos.
Fuente: Bak, et al; 2006
36

2.4 Sistema Lmbico

En 1937, James Papez introdujo el concepto de sistema lmbico definindolo
como el circuito que constitua el mecanismo neural de las emociones. Segn
Papez, este circuito consista de cuatro regiones en el cerebro: hipocampo,
hipotlamo, giro cingulado y tlamo anterior. Aos ms tarde, Mac Lean (1949),
vincul el circuito de las emociones con el hipocampo, la amgdala, el septum y el
crtex cingulado. Las contribuciones que realiz, Mac Lean diferan del modelo
original del sistema lmbico segn Papez, en cuanto a una menor relevancia del rol
del giro cingulado y una mayor relevancia del rol que cumplan el hipocampo y la
amgdala. Esto condujo a un renombramiento del modelo: Sistema Lmbico de
Papez y Mac Lean (figura 10). Actualmente, el concepto de sistema lmbico ha
evolucionado. Hoy en da se sabe que este circuito no solo se relaciona con el
desarrollo de emociones sino tambin con la percepcin, la memoria y algunos tipos
de comportamiento. Livingston, describi el sistema lmbico como un continuo que
vincula el cerebro, a la mente y al comportamiento. En trminos, del estudio de la
ansiedad y la depresin dicho circuito cobra importancia en el sentido de que las
estructuras mencionadas, conforman blancos potenciales para el estudio de dichas
patologas (Puri, B; 1998).

Figura 10. Modelo del sistema lmbico segn Papez y Mac Lean.
Fuente: Eysenck, et al; 2004

37

2.5 Miedo y estrs

El miedo consiste en una serie de estados motivacionales y emocionales que
promueven la organizacin de respuestas especficas ante situaciones de peligro,
permitiendo la resolucin de problemas y la adaptacin a situaciones amenazantes.
El estrs por su parte, es definido como una respuesta no especfica del cuerpo
ante cualquier demanda. (Eysenck, 2004).En este sentido, el cerebro es el
intrprete de lo que es un estresor y coordina las respuestas fisiolgicas y de
comportamiento necesarias previas, durante y posteriores a dicho evento
(Panksepp, 2003; Schulkin; 2004; Shumake,J; 2003).

En estudios psicolgicos, bioqumicos y fisiolgicos recientes, en humanos y
animales de laboratorio, se seala al miedo y al estrs como detonantes potenciales
desrdenes afectivos tales como la depresin y la ansiedad (Nutt; 2004; Shumake,
et al; 2003).

Existe un concenso en cuanto a que estos desrdenes afectivos, son el
resultado de la interaccin entre factores ambientales y genticos, y que adems
podran estar modulados por factores desencadenantes como el estrs (Wilbourn, et
al; 2003; Miller, et al; 2005; Shumake,2003). Sin embargo, es necesario aclarar que
la condicin de estrs per s, podra no ser suficiente para causar depresin. Por
ejemplo, la mayora de las personas no desarrollan un cuadro clnico depresivo, por
el solo hecho de padecer estrs crnico (Shumake,J; 2003).

Por otra parte, la interaccin ambiente-gentica del individuo podra
influenciar la modelacin y remodelacin de las vas que involucran el
condicionamiento al miedo ante situaciones especficas (Miller, et al; 2005). Se ha
propuesto que los mecanismos subyacentes a la depresin y la ansiedad, podran
compartir con el miedo condicionado y no condicionado, algunas rutas metablicas
(Gorman et al, 2004; Rosen; 2004). Por otro lado, se sugiere tambin que la
depresin y la ansiedad son posiblemente mecanismos sobreexpresados o de
retroalimentacin sostenida del miedo (Shulkin; 2004). Es decir, que las personas
que sufren de ansiedad patolgica o depresin, podran responder en forma
inapropiada ante estmulos moderados de amenaza inclusive cuando sta no es
inminente (Schulkin, 2004).

38
2.6 Depresin y Ansiedad

La depresin y la ansiedad, son trastornos emocionales que pueden
presentarse simultneamente o no en un individuo. Su etiologa se halla en la
incidencia conjunta de factores genticos, evolutivos, hormonales, fsicos y
psicolgicos. Por lo tanto, estos trastornos, de ndole multifactorial, podran ser
abordados desde diferentes disciplinas a fin de explicar su ocurrencia. En el
presente trabajo, se hace particular nfasis en los factores fsicos y psicolgicos
involucrados en estos dos trastornos (Stein, et al; 2002).

- Depresin - Definicin y sintomatologa

Histricamente, la depresin fue bien caracterizada por pensadores y
filsofos griegos como Hipcrates y Galeno. La persona depresiva fue descrita como
sombra y pesimista, tendiente a esconderse y a padecer de insomnio, irritable y
malhumorada (Gilbert,1992).

Actualmente, la depresin ha sido descrita como un desorden afectivo, en el
cual, ocurre una disminucin del estado de nimo, que inhabilita a la persona a
sentir placer y que crea sentimientos de desesperanza y una prdida en el inters
por las actividades diarias (Wilbourn, et al; 2003).

Otros sntomas asociados con la depresin son la prdida de la confianza y
la autoestima, sentimientos injustificados de culpa, ideas de muerte y suicidio,
menor capacidad de concentracin y la aparicin de trastornos del sueo y la
alimentacin. (Ministerio de Salud, 2002). Adems, la depresin puede presentar un
traslape con manifestaciones somticas como dolores de cabeza, de espalda y
problemas genitourinarios (Institute of medicine, 2001).

Esta enfermedad puede aparecer en cualquier momento de la vida aunque la
incidencia es mucho mayor en la madurez. En Costa Rica, la depresin afecta a
ms mujeres que hombres. Tiene una incidencia de 3,2% en las mujeres y un 1,9%
en los hombres. La depresin puede ser aguda o crnica, leve, moderada o grave y
es responsable del 4.4% del total de aos de vida perdidos, ndice que se estima ir
en aumento en los prximos aos. Como se cita en el anlisis sectorial de salud
presentado por el Ministerio de Salud (2002), expertos a nivel mundial estiman que
39
en menos de 10 aos la depresin se convertir en la principal enfermedad mundial
(Ministerio de Salud, 2002).

- Tipos de depresin

La depresin puede tomar varias formas, dependiendo del tipo de
sintomatologa e intensidad. Por una parte, se encuentra la depresin unipolar, que
es aquella en la que el trastorno afectivo se caracteriza por sentimientos de tristeza
o prdida nicamente. Caso contrario de los desrdenes afectivos bipolares, en
donde la depresin alterna con estados de hiperactividad o de extrema mana (ver
figura 11) (Wilbourn, et al; 2003; Peacock;2000).

Figura 11. Tomografa de emisin de positrones de una persona con desorden bipolar. La
imagen muestra una alternancia entre estados depresivos y de mania, en un curso de 10
das. Los colores azul y verde indican niveles bajos de actividad cerebral, mientras que los
colores rojo, anaranjado y amarillo indican altos niveles de actividad. Fuente: Phelps, sin
fecha.

Durante los episodios de mana, las personas se encuentran llenas de
energa, descansadas y entusiasmadas. Pueden ser inclusive irritables. Durante los
episodios depresivos tienen constantes sentimientos de tristeza y desesperanza
(Peacock; 2000, Wilbourn, et al; 2003).

Otra modalidad de la depresin, es la distimia, que es una enfermedad de
ndole depresivo ms leve, pero de sintomatologa frecuente. En algunos pacientes
40
puede presentarse por perodos de tiempo considerables, inclusive aos. Esta
enfermedad es ms frecuente en mujeres que en hombres. Pese a la levedad de
sus sntomas, la distimia, puede verse traslapada con episodios depresivos graves
(Wilbourn,et al; 2003).

Otro de los trastornos depresivos descritos, es el desorden afectivo
estacional, el cual parece estar directamente relacionado con la cantidad de luz
percibida durante el ao. Un cierto nmero de personas, en latitudes nrdicas, han
observado que su estado de nimo es afectado adversamente durante los meses de
invierno, cuando las lArgas horas del da se acompaan con niveles bajos de luz
(Wilbourn, et al; 2003).

- Fisiopatologa de la depresin

reas cerebrales involucradas:

A nivel fsico, la depresin puede generar cambios fisiolgicos importantes.
La tomografa de emisin de positrones, es una herramienta que ha permitido a los
neurlogos descubrir los cambios fisiolgicos producidos, a nivel cerebral, en
personas con trastornos depresivos. Algunos de estos cambios incluyen una
reduccin del flujo sanguneo y una reducida actividad en la corteza temporal-frontal
y en el ncleo caudado (figura 12) (Wilbourn, et al; 2003).

Tambin se ha sugerido que el hipocampo es una estructura cerebral
importante en la fisiopatologa de la depresin porque podra ser mediador en los
dficits cognitivos y en la hipercortisolemia encontrada en este desorden (Fujita, et
al, 2000). Adicionalmente, se ha sugerido que durante episodios de estrs se
reduce la tasa neurognica en el giro dentado, lo cual, aumenta la probabilidad de
padecer depresin (Jacobs, et al; 2000). Aunado a esto parece haber una
disminucin de la unin de serotonina a receptores ubicados en el lbulo temporal
medial y otras regiones neocorticales (Fujita, et al; 2000). Finalmente, se han
propuesto otras reas que podran estar afectadas durante la depresin como: el
cortex cingulado anterior, la amgdala, el cerebelo y los ncleos basales (figura 12)
(Wilbourn, et al; 2003).

41

Figura 12. Posibles reas cerebrales afectadas en episodios depresivos unipolares y
bipolares. Modificado de: Wilbourn,et al; 2003.

- Aspectos Bioqumicos de la depresin

Los estados de nimo se encuentran gobernados por neurotransmisores
especficos. Recientes estudios sobre la relacin entre neurotransmisores y
depresin permiti a un grupo de cientficos proponer la hiptesis sobre aminas
biognicas. sta ltima, establece como causa de la depresin, el agotamiento de
los neurotransmisores: noradrenalina, dopamina y serotonina en las sinapsis del
sistema nervioso central. Esto es respaldado por investigaciones donde se han
encontrado niveles alterados de noradrenalina, su metabolito 3-metoxi-4-hidroxi-
fenilglicol (MHPG) y dopamina, en orina y lquido cefalorraqudeo (LCR) de
pacientes depresivos. Del mismo modo, se ha encontrado una insuficiencia de cido
5-hidroxiindolactico (5-HIAA), un metabolito de la serotonina, en el LCR de
pacientes con tendencias suicidas. Aunque la hiptesis de aminas biognicas
contina siendo vlida, evidencias recientes sealan la influencia de otros
neurotransmisores en los trastornos depresivos. Por ejemplo, algunos pacientes con
episodios graves depresivos han demostrado tener niveles anormales de cido
gamma amino butrico (GABA). Adicionalmente, nuevas hiptesis sugieren que los
desbalances en el sistema colinrgico, podran generar episodios depresivos,
especialmente cuando los niveles de acetilcolina se encuentran elevados y fuera de
balance junto con otros neurotransmisores (Wilbourn, et al; 2003) (ver figura 13).
42

Figura 13 . Propuesta del balance bioqumico en personas sanas y en personas con
depresin. Modificado de: Wilbourn, et al; 2003

Adicionalmente, la depresin produce una respuesta de estrs, por lo que las
hormonas de estrs crnico (hormona adrenocorticotrpica y cortisol) tienden a
estar elevadas (Wilbourn, et al; 2003). Igualmente, Meijer, at al (1998), indica que la
depresin es una condicin combinada de hipercortisismo (alta produccin de
hormonas esteroideas, como el cortisol) y una aparente hipoactividad de la
transmisin serotonrgica, como se indic anteriormente.
(Meijer,et al; 1998; Stockmeier,1997).

Por otro lado, nuevas evidencias sugieren que la hipersecrecin de
Glucocorticoides (como el cortisol) y citoquinas proinflamatorias (molculas
mediadoras de la comunicacin intercelular y el sistema imMunolgico) resulta en un
mal funcionamiento de la neurotransmisin noradrenrgica y serotonrgica en el
cerebro de personas con depresin (Leonard,2001).

- Ansiedad

Definicin y sintomatologa

La ansiedad forma parte de la vida cotidiana. Sin embArgo, la ansiedad, al
igual que la depresin puede ser una emocin normal o un trastorno psiquitrico.
Mientras que niveles bajos de ansiedad pueden ser positivos, grados moderados o
altos de ansiedad pueden prevalecer en forma de una intensa angustia (Pary,R, et
al, 2003; Emilien, G, et al, 2002).
43

Una cierta cantidad de ansiedad, puede mejorar el desempeo de una
persona en su vida diaria, ayudarla a adaptarse, e inclusive, lidiar con el estrs.
Cuando la ansiedad, se presenta en forma leve, agudiza los sentidos y expande el
campo de percepcin, lo que permite adquirir destrezas durante el aprendizaje y en
situaciones que requieren la resolucin de problemas. No obstante, existen
personas que experimentan altos niveles de ansiedad ms all de los niveles
normales, ya sea como una reaccin anormal a situaciones normales o como
reaccin normal a situaciones anormales. Las personas con ansiedad patolgica,
pierden la capacidad de funcionar en forma normal, tanto socialmente como
profesionalmente y experimentan un deterioro en su percepcin: los sentidos de la
vista, el odo, el tacto, el gusto y el olfato se entorpecen y la capacidad de pensar se
ve afectada. Durante niveles altos de ansiedad, el campo de percepcin de una
persona disminuye, limitndose a un solo detalle y el procesamiento de nueva
informacin se ve comprometido. En casos ms severos, como por ejemplo, durante
ataques de pnico, la persona se vuelve incapaz de interpretar estmulos externos
(Pary,R, et al, 2003; Emilien, G, et al, 2002).

Los trastornos de ansiedad estn caracterizados por una combinacin de
varios sntomas: excesiva ansiedad, desasosiego, tensin, aprensin, preocupacin,
evasin y rituales compulsivos. Existen algunos criterios para diferenciar la ansiedad
patolgica de la ansiedad normal:

1. Cuando se presenta con mayor intensidad y/o duracin de lo esperado
usualmente. Para ello es importante considerar el contexto familiar, social y
cultural, as como su comportamiento y expectativas.
2. Cuando conlleva a una incapacidad en la interaccin social, ocupacional o
interpersonal.
3. Cuando las actividades diarias se ven interrumpidas a causa de la evasin
de situaciones u objetos, en un intento por disminuir el nivel de ansiedad.
4. Cuando se presentan sntomas fsicos significativos y/o obsesiones,
compulsividad y memorias de traumas. (Estos sntomas son muy comunes
en personas que no padecen de trastornos de ansiedad) (Pary,R, et al, 2003;
Emilien, G, et al, 2002).

44
Las estadsticas mundiales acerca de la incidencia de la ansiedad, varan
ampliamente segn los criterios aplicados para su diagnstico, pero en general la
frecuencia es elevada. En Costa Rica, segn estudios de Recursos Humanos de la
CCSS, los trastornos de ansiedad ocuparon el quinto lugar como causa de
incapacidad laboral entre empleados de la institucin. Adicionalmente, un estudio
llevado a cabo hace ms de diez aos, por Adis Castro, en el cantn de
Desamparados, revel en la poblacin estudiada una prevalencia de 26,7% de
sintomatologa ansiosa. Sin embArgo, no existen estudios epidemiolgicos actuales
de la incidencia o prevalencia de la ansiedad en la poblacin costarricense
(Ministerio de Salud, 2004).

No obstante, en estudios llevados a cabo dentro de los Estados Unidos, se
estim que 25% de los adultos, sufrirn en algn punto de sus vidas, una de las seis
formas de ansiedad descritas: desorden de pnico, que consiste en ataques
impredecibles y rpidos de intensa ansiedad; desorden de ansiedad generalizada,
caracterizado por una preocupacin excesiva en mltiples reas; desorden de
ansiedad social, caracterizado por miedo y evasin de situaciones sociales; fobias
especficas, notables por un intenso temor a detonantes especficos; desorden de
estrs postraumtico, causado por el recuerdo de memorias traumticas; y desorden
de obsesividad-compulsividad, caracterizado por comportamientos obsesivos-
compulsivos como un intento de la persona que lo padece por reducir la ansiedad.
(Gordon, 2004).

Es importante resaltar que la ansiedad y la depresin son enfermedades que
pueden presentarse simultneamente. Muy frecuentemente, ambas enfermedades
coexisten, de forma que se da un traslape de sntomas entre ambas condiciones,
que pueden dirigir a confusiones en el diagnstico. En estudios, realizados en los
Estados Unidos, se estim que la cormobilidad de dichas enfermedades, se
encuentra por encima de un 50%. Evidencia de ello ha sido el uso de cierto nmero
de agentes para tratar ambas enfermedades; los mismos neurotransmisores estn
involucrados en ambas condiciones; y el estrs puede crear una predisposicin a
padecer cualquiera de las dos condiciones o ambas (Nutt; 2004).

45
- Fisiopatologa de la ansiedad

reas cerebrales involucradas en la ansiedad:

Los estudios de imgenes, as como estudios de lesin y microinyeccin en
animales, han implicado varias estructuras del cerebro en desrdenes de ansiedad,
incluyendo la amgdala, el hipocampo, el giro cingulado, el hipotlamo y otras
regiones cerebrales (figura 14).

Figura 14. Probables vas serotonrgicas y regiones blanco en desrdenes de ansiedad.
Abreviaturas: GAD: desorden generalizado de ansiedad; SAD: desorden de ansiedad social;
OCD: desorden de obsesividad-compulsividad; PD: desorden de pnico.
Modificado de: Nutt, 2004

- Bioqumica de la ansiedad

El estudio de la accin farmacolgica de ciertas sustancias, el anlisis
neurobiolgico de los desrdenes de ansiedad y el empleo de modelos de ansiedad
en animales, ha permitido la identificacin de neurotransmisores y sistemas neurales
involucrados en la incidencia de la ansiedad. Dentro de los medicamentos ms
utilizados para el tratamiento de la ansiedad, se encuentran las benzodiazepinas y
los inhibidores de la recaptacin selectiva de serotonina (SSRIs, por sus siglas en
ingls), que modulan la neurotransmisin mediada por serotonina y cido -
aminobutrico (GABA), respectivamente. Estos dos neurotransmisores han
demostrado tener un papel importante en desrdenes de ansiedad. Asmismo, en
estudios farmacolgicos de la ansiedad, se ha visto implicado el sistema
46
noradrenrgico, especialmente en desrdenes de pnico. Estudios sobre la
fisiologa del estrs en animales y humanos ha sugerido un rol preponderante del
sistema adrenocortical (implicado tambin en depresin) y su regulador
neuropeptdico, la hormona liberadora de corticotropina (CRH), en desrdenes de
ansiedad, como se menciona anteriormente en este trabajo (Gordon, 2004).

2.7 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin

Fundamentos

La cromatografa es un mtodo de separacin fsica, en la cual, los
componentes a ser separados se distribuyen selectivamente entre dos fases
imMiscibles: una fase mvil fluye a travs de una fase estacionaria (Niessen, et al;
1999). Los componentes de una mezcla se separan cromatogrficamente al
interaccionar con dichas fases. Aquellos solutos con mayor afinidad por la fase mvil
se movern ms rpidamente que aquellos solutos con mayor afinidad por la fase
estacionaria. Las diferencias en afinidad se deben al tamao y estructura molecular,
a la distribucin de cArgas, a la fuerza de los campos electrostticos de grupos
cArgados, al grado de hidrofobicidad y a la presencia de puentes de hidrgeno. Por
lo anterior, la distribucin de los solutos a travs de una columna puede
considerarse como el resultado de diversos tipos de fuerzas moleculares de distinta
naturaleza y magnitud. En trminos fsico-qumicos, cuando el soluto interacta con
la fase estacionaria, sufre un cambio en su energa libre, que se debe a cambios en
la entalpa representada por fuerzas intermoleculares; y a cambios en la entropa
reflejada en una restriccin del movimiento o bien en un impedimento para moverse
en forma aleatoria (Cazes; 2001; Cazes, et al; 2002).

Uno de los mtodos cromatogrficos ms utilizados en la actualidad, es la
Cromatografa Lquida de Alta Resolucin o HPLC (por sus siglas en ingls). La
tcnica es utilizada en un amplio rango de actividades industriales cientficas y
acadmicas, tales como el anlisis de alimentos, drogas y agroqumicos. Asimismo,
esta tcnica ha desempeado un papel importante en la investigacin de
desequilibrios moleculares caractersticos en procesos patolgicos. Por ejemplo, el
anlisis cuantitativo de neurotransmisores presentes en el lquido cefalorraqudeo,
productos de microdilisis y homogeneizados del cerebro de mamferos, ha
permitido la deteccin de anomalas relacionadas con enfermedades del sistema
nervioso central y perifrico, tales como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson,
47
Huntington, trastornos depresivos, de ansiedad, epilepsia y esquizofrenia. De la
misma forma, esta tcnica ha sido utilizada para estudiar los rangos fisiolgicamente
normales, en pacientes sanos (Hyman, et al; 2006).

Sistema cromatogrfico

De manera general, un sistema cromatogrfico est conformado por las
siguientes partes: inyector, bomba, columna, detector y sistema de registro (ver
figura 10).

Figura 15. Esquema general de un sistema cromatogrfico. Modificado de Niessen,
et al; 1999.

El proceso del anlisis cromatogrfico inicia con la inyeccin de la muestra a
analizar, en el puerto de inyeccin. Es entonces cuando la muestra se incorpora al
caudal de la fase mvil, la cual, a su vez es impulsada a travs de las tuberas del
sistema por medio de la accin de una bomba de alta presin. La muestra
incorporada al caudal es transportada hasta la columna, donde es separada en
diferentes partes, de acuerdo al tipo de interaccin qumica de cada uno de sus
componentes (Niessen, et al ; 1999).

Se dice que las columnas son el corazn del sistema cromatogrfico. Estas
estn fabricadas con materiales como acero inoxidable y/o vidrio. Las columnas
estn usualmente empacadas con materiales porosos (0,5-2m), a travs de los
cuales se produce una interaccin entre los distintos componentes de la muestra, la
fase mvil y la fase estacionaria. El resultado es la separacin de componentes o
analitos segn su tipo de afinidad qumica. Finalmente, un detector capta las
seales producidas por cada uno de los elementos de la muestra y traduce la seal
a un ordenador que registra dicho estmulo en forma de pico, con tiempos de salida
(tiempos de retencin) distintos, los cuales pueden ser caractersticos del analito si
48
se mantienen las mismas condiciones de anlisis (pH, temperatura, componentes de
la fase mvil, fase estacionaria, voltaje e ndice de flujo) (Niessen, et al; 1999).

Tipos de cromatografa lquida

La clasificacin de las tcnicas cromatogrficas, se basa en el tipo de
mecanismo de distribucin aplicado durante la separacin. En la prctica, la mayora
de las separaciones son el resultado de mecanismos de separacin mixtos
(Niessen, et al; 1999).

Dos de los tipos de separacin por cromatografa lquida ms conocidos, son
la separacin en fase normal y la separacin en fase reversa (Niessen, et al; 1999).

La cromatografa de fase normal, consiste en una fase estacionaria
relativamente polar y en una fase mvil relativamente no polar. En este tipo de
separacin, los analitos menos polares son los que eluyen de primero (Niessen, et
al; 1999; Bidlingmeyer; 1992).

Por otro lado, la separacin en fase reversa consiste en una fase
estacionaria no polar y una fase mvil polar. Es decir, que en el mtodo de
cromatografa en fase reversa, las molculas se unen hidrofbicamente a ligandos
no polares en presencia de un solvente polar. Los ligandos ms comunes son los
grupos octil (C8) y octadecil (C18). Contrariamente, al tipo de separacin en fase
normal, en la cromatografa en fase reversa, los analitos ms polares son los que
eluyen de primero (Cazes, 2001; Niessen, et al ; 1999; Bidlingmeyer; 1992).

La tcnica de cromatografa en fase reversa es de gran valor para el anlisis
de sustancias polares y analitos inicos, incluyendo el anlisis de aminocidos y
pptidos. En los ltimos aos, la cromatografa en fase reversa a permitido un gran
avance en el estudio de pptidos y aminocidos. La resolucin y la eficacia del
mtodo, ha permitido el aislamiento de pptidos y aminocidos, de analitos de
estructura qumica similar (Cazes, 2001; Niessen, et al ; 1999).

Deteccin electroqumica

Existen diversos tipos de detectores en cromatografa. Algunos de stos
incluyen los de deteccin ultravioleta-visible, refractmetros, de fluorescencia y
49
electroqumicos. Aqu se hace referencia al tipo de deteccin utilizada en este
protocolo: la deteccin electroqumica (Niessen, et al; 1999; Parvez; 1987).

Los detectores electroqumicos se basan en la medicin de la corriente
elctrica resultante de la conversin oxidativa o reductiva de un analito en la
supeficie del electrodo (Niessen, et al; 1999; Parvez; 1987).

El mecanismo especfico de deteccin electroqumica consiste en lo
siguiente: un potencial elctrico de suficiente magnitud es aplicado a un electrodo de
trabajo, usualmente hecho de carbn (puede ser metal), sobre el cual, pasa el
analito a medida que se libera de la columna, lo cual produce una reaccin de
oxidacin o reduccin. El flujo de electrones procedentes del electrodo de trabajo
hacia el analito o viceversa, puede medirse como una corriente cuya magnitud es
proporcional a la concentracin del analito que pasa a travs del detector.
Generalmente, el potencial (voltaje) del electrodo se escoge de forma que la
velocidad de la reaccin (transferencia de cArga) en la superficie del electrodo, sea
ms rpida que la transferencia de masa a travs de dicha superficie (Parvez;
1987).

Para mejorar la sensibilidad y selectividad del mtodo cromatogrfico se han
creado electrodos duales. El primer electrodo, tambin llamado electrodo de
referencia, funciona como pantalla para el segundo electrodo, removiendo seales
indeseables procedentes de especies que son ms fcilmente oxidables que el
analito de inters. El electrodo de trabajo se mantiene dentro de un potencial fijado
por el electrodo de referencia, el cual, limita el potencial bajo el cual, se detecta el
analito de inters. Un electrodo de referencia muy commMente utilizado es el
electrodo de Ag/AgCl. Este ltimo, reduce o elimina, la seal producida por la fase
mvil, siempre y cuando sta mantenga una velocidad y composicin constante
(Ahuja, 1989; Parvez, 1987).

Los tipos ms comnes de deteccin electroqumica son: la deteccin
amperomtrica; colorimtrica, conductimtrica y potenciomtrica. En este trabajo, la
deteccin de tipo amperomtrica es el tipo de deteccin utilizada para el anlisis y
cuantificacin de GABA y Glutamato. La tcnica amperomtrica ha probado ser de
gran valor en combinacin con la cromatografa de fase reversa, no solo por su gran
sensibilidad, sino tambin por la selectividad demostrada en algunos casos. Lo
anterior, se debe a que la deteccin se limita a aquellas sustancias capaces de
50
oxidarse o reducirse en la celda electroqumica, con la aplicacin de un potencial
elctrico (Packer, et al; 2001; Parvez, 1987).

Deteccin electroqumica de neurotransmisores Tcnica de derivatizacin
precolumna

Con el objetivo de mejorar la sensibilidad y selectividad del mtodo
cromatogrfico con deteccin electroqumica, se han desarrollado tcnicas de
marcaje qumico. Una de las tcnicas actualmente utilizadas, es la tcnica de
derivatizacin (Lingeman; et al; 1990; Giddings, et al; 1987).

La tcnica de derivatizacin, consiste en la transformacin bioqumica de
analitos de inters, por adicin de un grupo qumico en la estructura. El marcaje de
los analitos por medio de esta tcnica, ha permitido la deteccin selectiva y sensitiva
(M-fM) de analitos biolgicos, bioactivos y metales en tejidos, fludos corporales
(como Lquido Cefalorraqudeo) y contaminantes. La alta sensibilidad del mtodo, se
debe a que los productos de la derivatizacin se oxidan ms fcilmente en su paso a
travs del detector electroqumico (Arslan, O; 2001; Webster; 2001; Jacobs, 1987).

El progreso en las tcnicas de derivatizacin, ha hecho posible el marcaje
selectivo de grupos funcionales de molculas orgnicas de bajo peso molecular y la
diferenciacin entre estos grupos funcionales y otros del mismo tipo, presentes en
molculas ms grandes (Giddings, et al; 1987). Se ha demostrado que la tcnica de
derivatizacin en HPLC-EC puede utilizarse en el marcaje de pptidos de pequeo
tamao, alquilaminas y aminocidos. Los grupos funcionales marcados en este tipo
de molculas, son las aminas primarias (Cazes, et al; 2001; Phyllis, et al; 1995).

Algunos de los reactivos utilizados para el marcaje qumico de aminocidos
transmisores son el oftaldehdo (OPA) (figura16), el 4-Fluoro-7-nitrobenzofurazan
(NBD-F) y el Cloruro de 5-Dimetilaminonaftaleno-1-sulfonilo (DNS-Cl)(Cazes, et al;
2001).

Figura 16. Representacin qumica de un aminocido derivatizado con OPA. En turquesa:
anillo de OPA; en rojo: el aminocido; en morado: -mercaptoetanol. Fuente: Cazes, et al;
2001.
51

El marcaje de aminocidos ha sido comnmente llevado a cabo con OPA en
presencia de grupos tiol (figura 16), como el -mercaptoetanol y el tert-butil tiol (que
contienen un grupo mercapto:-SH ) o en presencia de grupo sulfito (i.e Na
2
SO
3
)
(figura 17). Se ha observado que la sustitucin del grupo tiol por el grupo sulfito
produce una mayor estabilidad del producto de la reaccin (N-alquilo-1-isoindol
sulfonato) (Cazes et al; 2001; Rowley et al, 1995). La reaccin de derivatizacin
entre aminocidos, OPA y grupos tiol o sulfito, debe hacerse a un pH alcalino, tal
como lo indica la figura 17 (Packer et al; 2001; Jacobs, 1986).

Fig 17. Representacin de la reaccin qumica entre OPA, un grupo sulfito y un aminocido.
La molcula final corresponde a un grupo N-alquilo-1-isoindol sulfonato
Fuente: Jacobs, 1986.

Adicionalmente, el proceso de derivatizacin puede realizarse de dos formas:
postcolumna o precolumna. En la derivatizacin postcolumna la derivatizacin tiene
lugar entre la columna y el detector, mientras que la derivatizacin precolumna se
lleva a cabo previo a su inyeccin en el aparato. La separacin de aminocidos
marcados se lleva a cabo generalmente mediante la tcnica de separacin
precolumna, ya que ofrece ventajas sobre la derivatizacin poscolumna como: una
necesidad limitada de instrumentos para el proceso de derivatizacin; y una mejor
sensibilidad, resolucin y selectividad. Por ejemplo, an cuando la tcnica permite el
marcaje de aminas primarias, no es posible utilizarla para el marcaje de aminas
secundarias, tal es el caso del iminocido prolina (Cazes, et al; 2001; Lingeman, et
al; 1990).

52
3. METODOLOGA

transmisores

- Descripcin de la metodologa de estandarizacin:

Se evalu el protocolo descrito por Rowley, et al; 1995, para la cuantificacin
de GABA y Glutamato; con algunas modificaciones (ver condiciones cromatogrficas
iniciales).

- Preparacin de la Fase Mvil

En un baln aforado de 250 ml, se agregaron 0,1M de fosfato monosdico y
0,5mM de EDTA. Despus, se afor con 25% metanol/agua (v/v). El pH se ajust a
4,5 con cido fosfrico (1M). La fase mvil fue filtrada dos veces a travs de filtros
hidroflicos de membrana de polipropileno (GH Polypro) con porosidad 0,20m y
dimetro de 47mm, marca Pall. Posteriormente, fue desgasificada durante 15 min en
un bao ultrasnico Steri-cleaner de Sturdy Industrial co; LTD; a temperatura
ambiente. Las fases mviles fueron almacenadas en erlemMeyers de 250 mL,
cubiertos con papel aluminio y rotulados apropiadamente.

- Preparacin del Material de Referencia:

Soluciones madre de aminocidos:

Se prepararon cinco soluciones madre (alta concentracin) de cada uno de
los aminocidos: cido -amino butrico (GABA), glutamato (Glu), glutamina (Gln),
taurina (Tau) y arginina (Arg); a una concentracin de 0,02M. Los aminocidos
(marca Sigma) se pesaron uno a uno, en una balanza analtica marca Explorer de
la corporacin OHAUS, modelo E12140 (mx 210g). Para la preparacin de las
soluciones madre, se pesaron cantidades equimolares de cada aminocido que
fueron posteriormente diludas en 3ml de agua desionizada. As, de Glutamato, se
pes una cantidad aproximada de 8,9mg; de GABA, 6,2mg; de Glutamina, 8,9mg;
de Taurina 7,6mg y de Arginina-HCL 12,9mg. Para el clculo de la molaridad fue
tomado en cuenta el grado de pureza del reactivo y la molaridad del compuesto
presente en el envase. Adicionalmente, se calcul la molaridad real de cada
53
aminocido, segn la cantidad real pesada en balanza analtica. Las soluciones
madre de cada aminocido fueron preparadas semanalmente y almacenadas a -
20C, en viales de 10mL de polietileno para evitar la adherencia que presentan los
aminocidos cuando son puestos en contenedores de vidrio.

Soluciones de trabajo de los aminocidos:

Las soluciones de trabajo son soluciones de concentracin intermedia,
preparadas a partir de las soluciones madre. Las soluciones de trabajo, se preparan
con el fin de facilitar la elaboracin de soluciones ms diludas (soluciones acuosas),
y para reducir la exposicin de la solucin madre a la degradacin por efecto de la
temperatura ambiental, a lo lArgo del da de trabajo.

Se prepararon cinco soluciones de trabajo a partir de las soluciones madre
(0,02M) de cada aminocido. Para efectuar la dilucin correspondiente de cada
solucin madre, fue tomada en cuenta la cantidad real (en mg), de aminocido
pesado en balanza analtica, como se expuso anteriormente. Cada cantidad (mg)
real pesada y diluida, posee tambin una molaridad real. Por esto, a partir de esta
cantidad real pesada (mg), se efectuaron los clculos estequiomtricos respectivos,
para obtener la cantidad de L necesarios que permitieran posteriormente conseguir
por diluciones seriales, soluciones acuosas de cada aminocido solo o en conjunto,
a concentraciones exactas de 100M, 10 M y 1 M. Por ejemplo, si la
concentracin real final de Glutamina corresponda a una molaridad de 0,021211M,
la cantidad de L de aminocido tomada para preparar la solucin de trabajo de
este aminocido, sera aproximadamente de 47L, a la cual, se agregan 953L de
agua desionizada. Esta metodologa de preparacin de soluciones de trabajo,
facilit la elaboracin de soluciones acuosas, descritas a continuacin.

Soluciones acuosas de los aminocidos:

Las soluciones acuosas de aminocidos fueron preparadas a partir de las
soluciones de trabajo, por medio de diluciones seriales. El rango de diluciones
efectuadas gir entorno a las concentraciones de GABA y Glutamato evaluadas en
el artculo original. Se realizaron diluciones de cada solucin de trabajo tomando
100L de la solucin de trabajo y diluyndola en 900L de agua para preparar una
dilucin 1 en 10. La siguiente dilucin se prepar tomando 100L de la dilucin 1:10
y agregando 900 L de agua. La ltima dilucin se prepar de la misma forma que
54
las anteriores, a partir de la dilucin 1:100, para obtener una concentracin de
1:1000 equivalente a 1 mol/L de cada aminocido.

- Preparacin de la solucin de derivatizacin

Fueron pesados y disueltos 11,0 + 0,005mg de OPA en 0,5ml de etanol
absoluto al cual, fueron aadidos 0,5ml de sulfito de sodio (1M) y 0,9 ml de buffer
tetraborato de sodio (0,1M) ajustado a pH 10,4 con Hidrxido de Sodio (5M). El
reactivo se prepar diariamente y se verific que permaneciera estable a travs del
da de trabajo. Dicha solucin de derivatizacin se conserv a baja temperatura
(3C), en beakers de 10mL forrados con aluminio y rotulados debidamente. La
concentracin final del reactivo OPA en la preparacin anterior es de 43mM.

Condiciones cromatogrficas iniciales:

Software de anlisis cromatografico: CSW32 Chromatography Station
Detector electroqumico: Waters 464 pulsed
Bomba: Waters 515 HPLC
Columna de separacin: *Spherisorb ODS1 C18, fase reversa (5m, 250* 4,6
mm)
Fase mvil: 0,5mM EDTA; 0,1M Buffer Fosfato monobsico; 25% metanol, llevada
a pH 4,5 con Ac. Fosfrico (5M).
Flujo: 0,65ml/min
Volumen del Lazo de inyeccin: 50L
Volumen inyectado: 100 L (en dos inyecciones)
Temperatura: ambiental
Potencial aplicado: 850mV
Intensidad de corriente del electrodo de trabajo: 20nA.
Tipo de circulacin de la fase mvil: circuito cerrado

* la marca de la columna de separacin sugerida es Rainin Dynamax (no se
encuentra en el mercado), sin embArgo, las propiedades bsicas de la columna
seleccionada, son las mismas.

Las modificaciones al protocolo original se realizaron con el fin de adaptarlo a
los recursos del laboratorio. Las modificaciones realizadas incluyen la filtracin de la
fase mvil a travs de filtros de 0,22m y no de 0,45 m, como lo establece el
55
protocolo original. Distinto tipo de circulacin de la fase mvil, la cual, difiere de la
metodologa establecida por Rowley, et al (1995); en que sta es de tipo abierto y no
cerrado, con el fin de economizar el uso de reactivos. Por otra parte, para aumentar
la cantidad de muestra disponible para anlisis, se utiliz un lazo de inyeccin de 50
L y no de 20 L, como se sugera. Por ltimo, el tipo de solvente utilizado fue agua
desmineralizada y no doblemente desmineralizada. El agua desmineralizada fue
suministrada por el Centro de Investigacin en Biologa Celular y Molecular (CIBCM)
y por el Laboratorio de Qumica Analtica de la UCR.

- Pruebas Analticas preliminares:

Estandarizacin de la sensibilidad del mtodo durante pruebas preliminares

Con el fin de definir una sensibilidad adecuada durante las pruebas de
resolucin del mtodo, la concentracin propuesta fue evaluada a sensibilidades de
100nA, 50 nA y 20nA. La concentracin de OPA utilizada fue de 43mM y se
utilizaron 2 L de solucin de derivatizacin por mL de solucin acuosa (1M). La
reaccin fue llevada a cabo en viales de polietileno de 1,5mL, durante 10 minutos
previa inyeccin en el sistema cromatogrfico. Los criterior de seleccin de la
sensibilidad ms adecuada fueron: calidad de la deteccin de los picos y limpieza de
la lnea base.

Identificacin de los tiempos de retencin asociados a aminocidos
transmisores y evaluacin de la resolucin del mtodo

Las primeras evaluaciones fueron de carcter cualitativo y consistieron en la
inyeccin de una concentracin media (1M) tomada del estudio de linealidad
descrito en el protocolo de referencia, con la finalidad de identificar los tiempos de
retencin correspondientes a cada aminocido. Para dichos anlisis se agregaron
0,8 uL de OPA (43mM), por mL de solucin acuosa de aminocidos (1M). Cada
uno de los aminocidos fue inyectado individualmente a los 10 minutos de haber
sido puestos en reaccin con la solucin de derivatizacin, en forma aislada.
Adicionalmente, se inyectaron blancos de solucin estndar (agua desmineralizada),
y blancos con OPA, con el objetivo de identificar picos diferentes de los aminocidos
de inters y sus tiempos de retencin.

56
Por otra parte, se prepararon soluciones acuosas de los aminocidos de
inters (GABA y glutamato), y de otros aminocidos potencialmente interferentes:
glutamina, taurina y arginina. Dichas soluciones fueron preparadas a una
concentracin de 1M y derivatizadas con 2 uL de solucin de derivatizacin (OPA
43mM), durante 10 minutos, previa inyeccin en el sistema cromatogrfico. Se
verific que este volumen de derivatizacin no produjera contaminacin de la lnea
base (formacin de picos fantasma) y que marcara a los aminocidos en solucin.
Se realizaron tres corridas de las soluciones de aminocidos en matriz.

En este ensayo, se evalu la calidad de la resolucin de los picos de inters.
La resolucin provee una medida cuantitativa de la habilidad para separar dos
componentes en una mezcla. Para una mezcla de dos compuestos A & B, la
resolucin puede ser definida mediante la siguiente ecuacin:

R= 2 * [(T
R
)
B
-(T
R
)
A
/ W
A
+ W
B
)

(T
R
)
B
= tiempo de retencin de un componente B que es ms fuertemente retenido.
(T
R
)
A
= tiempo de retencin de un componente A que es menos fuertemente
retenido.
W
B
= ancho del pico para un componente B en la lnea base
W
A
= ancho del pico para el componente A en la lnea base

Si R es menor que 1, los componentes se estn sobrelapando
Si R es igual que o mayor que 1, esto indica una buena separacin

Los criterios anteriores fueron utilizados para evaluar cuantitativamente la resolucin
del mtodo.

3.2 Extraccin y Procesamiento de Cerebros de Rata para su anlisis

Los cerebros de rata fueron extrados de ratas Wistar macho, jvenes (peso
desconocido), sin tratamiento previo. La muerte de las ratas fue realizada por
decapitacin con guillotina. La extraccin de los cerebros fue realizada
cuidadosamente dejando un poco de la mdula. Rpidamente, el cerebro extrado
se coloc en un beaker con solucin salina fra al 0,9%. Posteriormente, se
disectaron sobre hielo las cortezas temporales derecha e izquierda. En total se
extrajeron ocho regiones cerebrales de cuatro ratas.
57

A continuacin, las regiones cerebrales extradas fueron colocadas, en viales
de polietileno de 1,5mL con agua doblemente desionizada. Seguidamente, stas se
homogenizaron y almacenaron a -20C, con el fin de disminuir la accin de enzimas
proteolticas y la degradacin de la muestra.

Las muestras fueron desalmacenadas, una vez establecido y optimizado el
protocolo, para valorar la utilidad del mismo. Cada muestra fue centrifugada por 20
minutos a 10 000 rpm, a 3C y a continuacin, fue filtrada a travs de filtros de
membrana de nitrato de celulosa (RC58) de porosidad 0,20 m y dimetro 9mm,
marca Schleicher & Schuell, Micro Science. Por ltimo, las muestras que seran
analizadas, se diluyeron, derivatizaron e inyectaron en el sistema HPLC. El resto de
las muestras, que no seran utilizadas el da del anlisis fueron almacenadas
nuevamente a -20C.

El procedimiento utilizado para la extraccin y pretratamiento de la muestra
fue implementado por la Msc. Elvira Salas, investigadora del Programa de
Neurociencias. Dicho protocolo se ilustra en la figura 18 con algunas modificaciones.

(protocolo de Rowley, 1995)

Se evalu la resolucin de los picos en homogeneizados de cerebro
provenientes de corteza temporal, con el fin de valorar la efectividad del mtodo en
cuanto a la resolucin de los aminocidos de inters, frente a otro tipo de
interferencias presentes en la matriz biolgica (homogeneizados de cerebro de rata).
Se utilizaron las condiciones iniciales cromatogrficas, mencionadas anteriormente:
temperatura ambiente, 0,65ml/min, 20nA de sensibilidad y 850mV. Adems, se
realizaron diluciones 1/10 de las muestras con el objetivo de detectar cada pico en
forma completa. Por otra parte, las muestras fueron derivatizadas con 2 L de
reactivo de derivatizacin (OPA 43mM) durante 10 minutos.

58

Figura 18. Procedimiento de extraccin y procesamiento de la muestra.

3.4 Optimizacin de protocolo para el anlisis de GABA y Glutamato

La optimizacin del protocolo consisti, bsicamente, en la eliminacin de
picos interferentes y picos fantasma del cromatograma y la optimizacin de la
resolucin de los picos correspondientes a los aminocidos de inters en matriz
blanca (aminocidos estndar en agua desionizada) y en matriz biolgica
59
(homogeneizados de cerebro). Esto ltimo con el fin de facilitar la cuantificacin de
aminocidos, descrita ms adelante.

Efecto de la concentracin de metanol sobre la resolucin de los picos

Se evaluaron cuatro concentraciones de metanol cercanas al 25%
(concentracin del protocolo original). Para esto, se prepararon fases mviles de
igual pH (4,5), con concentraciones crecientes de metanol : 22-23%-25%-27%. Las
concentraciones de soluciones acuosas evaluadas fueron de 100M. Estas se
inyectaron a los 10 minutos del tiempo de derivatizacin con 2L de OPA (43mM), a
una sensibilidad de 20nA, a un potencial 850mV y a un ndice de flujo de
0,65mL/min. La evaluacin de cada concentracin de metanol requiri la inyeccin
por triplicado de las soluciones acuosas y la inyeccin de los cinco aminocidos en
forma nica, con el fin de identificar sus respectivos tiempos de retencin.

Efecto del pH sobre la resolucin de los picos

Una vez realizadas estas pruebas fue seleccionada aquella fase mvil con
mejor resolucin de picos y menor tiempo de corrida A esta fase mvil, se le vari el
pH a: 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 y 6,0. Para medir el pH, se utiliz un pHmetro marca
CORNING, modelo Pinnacle 530, que fue calibrado, una vez al da, cada vez que
fuera a ser utilizado, obtenindose curvas de calibracin cercanas al 100% (+2%).
Cada fase mvil fue evaluada en das consecutivos, despus de dejarse en
circulacin cerrada al menos 12 horas, durante la noche, para que el sistema
cromatogrfico se estabilizara. Para esta prueba, se utilizaron las mismas
condiciones cromatogrficas que para la prueba anterior. Del mismo modo, se
realizaron inyecciones de soluciones acuosas de aminocidos por triplicado e
inyecciones de aminocidos nicos con el fin de identificar sus respectivos tiempos
de retencin.

Seleccin de la mejor fase mvil

La eleccin de la mejor fase mvil fue realizada con base en los siguientes
criterios: calidad de la resolucin de los picos correspondientes a GABA y glutamato;
menor tiempo total de corrida y tiempo de retencin de picos contaminantes propios
de la solucin de derivatizacin (no deban ser interferentes). No obstante, en este
punto se le dio prioridad a la separacin del aminocido glutamina. Despus de que
60
las mejores fases mviles fueron sometidas a evaluacin, fueron realizadas otras
pruebas de estandarizacin y optimizacin del protocolo.

Pruebas preliminares en cerebro de rata (nuevo protocolo)

Las pruebas preliminares en homogeneizados de cerebro de rata, se llevaron
a cabo con el objetivo de medir la efectividad del mtodo seleccionado, en la
separacin de GABA y glutamato. Para tal efecto, se utiliz un flujo de 0,65ml/min, y
se determin la temperatura ms adecuada de separacin, mediante la inyeccin de
una muestra a temperatura ambiental y a una temperatura baja (8,1C).
Posteriormente, fueron realizados otros ensayos de optimizacin del protocolo.

Efecto de la temperatura sobre el pH de la fase mvil

Durante el proceso de elaboracin de una nueva fase mvil fue necesario,
evaluar el efecto de la temperatura sobre el pH. Para tal efecto, se midi el pH de
una fase mvil al 23% de metanol, enfriada hasta 10 C, la cual, fue calentndose
paulatinamente hasta una temperatura de 16C. Con este fin, se realizaron treinta
mediciones en forma consecutiva. Para la medicin de pH y temperatura se emple
el pHmetro marca CORNING modelo Pinnacle 530.

Esta evaluacin permiti valorar la robustez del mtodo, en cuanto al efecto
que podran tener las variaciones de la temperatura, en el pH de la fase mvil y por
ende en los tiempos de retencin de los analitos. Asimismo, se estableci una
relacin cuantitativa entre temperatura y pH.

Efecto de la temperatura sobre los tiempos de retencin

Se evaluaron temperaturas comprendidas entre 10-16C, con el fin de
evaluar el efecto que tiene la temperatura sobre los tiempos de retencin de los
aminocidos de inters. En esta prueba se utilizaron soluciones acuosas 100M
derivatizadas con 20L de solucin de derivatizacin 43mM. Para lograr
temperaturas bajas cercanas a los 10C, se implement un sistema de enfriamiento
(figura 19), con una caja de estereofn perforada en ambos extremos para sostn
de la columna. En el fondo de la caja se coloc hielo gel, y envolviendo la columna
se coloc una bolsa de agua fra para conservar la temperatura temporalmente
61
estable. El ndice de flujo utilizado fue el mismo que para el artculo de referencia, es
decir, 0,65ml/min. La siguiente figura ilustra el sistema de enfriamiento creado.

Figura 19. Sistema de enfriamiento con hielo Gel

Efecto del ndice de flujo sobre los tiempos de retencin

Se determin el efecto que tiene el ndice de flujo sobre los tiempos de
retencin y la resolucin de aminocidos. Para cumplir con este objetivo, fue
utilizada aquella fase mvil de resultados cromatogrficos ptimos (23%metanol, pH
5,5). Los ndices de flujo evaluados fueron: 0,45; 0,5; 0,55; 0,60 y 0,65 ml/min. Se
procur una misma temperatura (a 17,0 + 0,5C), a lo largo del anlisis.

Efecto de la concentracin de OPA sobre la deteccin qumica de aminocidos
transmisores (100M) para anlisis de repetibilidad

Con el fin de evaluar el efecto que tiene el marcaje qumico con OPA sobre la
deteccin de aminocidos transmisores y sobre las reas relativas de los
aminocidos en matriz, se realiz un ensayo en el cual se aadieron cantidades
crecientes de solucin de derivatizacin (OPA 43mM), por mL de solucin acuosa
de concentracin constante (100M). El objetivo primordial de este ensayo, fue
determinar la concentracin de OPA ptima necesaria para derivatizar los
aminocidos glutamato, glutamina, GABA, arginina y taurina en solucin acuosa
100M; destinados a anlisis de repetibilidad. Este ensayo se llev a cabo a una
sensibilidad de 20nA, a un potencial de 850mV y a un flujo de 0,5ml/min. Adems,
se procur realizar cada corrida en un rango de temperatura entre los 18-23C.

62
Reajuste de la concentracin de OPA para anlisis de linealidad

Se realiz un ensayo similar al descrito anteriormente para la determinacin
de la concentracin de OPA ptima durante la derivatizacin de aminocidos
100M. Esta vez, se estableci una cantidad de OPA adecuada para la
derivatizacin de la concentraciones correpondientes al rango superior de la curva
de linealidad es decir: 1500 M de GABA; 437,5 M de glutamato; 437,5 M
glutamina; 350 M de taurina y 350 M de arginina. Para la derivatizacin de estas
concentraciones de aminocidos, se realizaron adiciones crecientes de solucin de
derivatizacin (concentracin de OPA 43mM), de 20L a 44L por mL de solucin
acuosa de aminocido.

Reajuste de la intensidad de corriente aplicada en la deteccin para anlisis de
linealidad

El nuevo protocolo desarrollado requiri un reajuste de la intensidad utilizada
sobre todo para la elaboracin de una curva de calibracin a concentraciones
proporcionalmente decrecientes. Para esto, se evaluaron las siguientes
intensidades: 10, 10/20, 20/50 y 10/50nA. Los tres ltimos ensayos fueron
realizados en forma mixta alternando una primera intensidad con una segunda
intensidad, de forma que a los 12-13 minutos de corrida se cambiaba a una
intensidad mayor, hasta lograr un mejor ajuste en la deteccin de aminocidos
transmisores de menor y mayor rea (respuesta en mV*s). La concentracin de
aminocidos utilizada para este anlisis corresponde a la mayor concentracin del
rango de linealidad, expuesta anteriormente.

3.5 Pruebas de calidad en el mtodo desarrollado

Para estimar la aplicabilidad del nuevo mtodo desarrollado en la determinacin
cuantitativa de los aminocidos GABA, glutamato y glutamina, se realizaron algunas
pruebas de calidad, recomendadas por la IUPAC (Unin Internacional de qumica
pura y aplicada) y AOAC International. Las pruebas realizadas definen la veracidad
(repetibilidad), linealidad y el efecto de la matriz general. Asmismo, a lo largo de
este trabajo, se realizaron pequeos cambios en el procedimiento para valorar, otro
parmetro de calidad: la robustez del mtodo. Este ltimo, se define como la
resistencia al cambio en los resultados obtenidos por un mtodo analtico. Las
63
condiciones evaluadas incluyen: porcentaje de metanol, pH, temperatura de
preparacin, temperatura de corrida y efecto de la matriz. La evaluacin de la
robustez se hizo con base en los cambios observados en la resolucin de los
aminocidos de inters.

Prueba de veracidad (repetibilidad)

Se realiz un anlisis de repetibilidad por medio de la inyeccin sucesiva de
quince patrones (material de referencia no certificado) de igual concentracin, en un
mismo da. El anlisis de repetibilidad se llev a cabo por medio de la preparacin
de una solucin de aminocidos cercana a 100M (0,015g/L de cada
aminocido), en balones aforados de plstico de 100mL. Para esto, se prepar una
solucin madre de todos los aminocidos a una concentracin de 0,1g/L. A
continuacin se tom una alcuota de 15mL, que a su vez, fue disuelta en 100mL de
agua desionizada.

Las calibraciones de los patrones se hicieron por el mtodo de estndar
externo, por comparacin de las reas de los picos. Se analizaron los datos
obtenidos despus de quince inyecciones de solucin patrn y se obtuvo el
promedio, el porcentaje de variacin, la desviacin estndar y la desviacin estndar
relativa.

Para el anlisis de los datos obtenidos para el ensayo de repetibilidad, se
siguieron los criterios establecidos por la revista de Cromatografa B (Journal of
Chromatography B) ( De Bivre, et al ; 2005); en donde el mximo porcentaje de
desviacin estndar relativa aceptada es de un 10%. Sin embargo, se han aceptado
porcentajes de hasta un 20% para materiales de referencia de menor calidad ( De
Bivre, et al ; 2005).

Pruebas de Linealidad

El ensayo de linealidad consisti en la inyeccin de seis concentraciones
diferentes de los aminocidos: GABA, glutamato, glutamina, taurina y arginina
preparados en matriz blanca (ensayo de los calibradores en forma conjunta). Los
rangos de linealidad fueron seleccionados con base en las concentraciones
normales de GABA, glutamato, glutamina, arginina y taurina encontradas en cerebro
de rata; y con base en las sugerencias hechas en la gua de Recomendaciones
64
Armonizadas para la Validacin de Mtodos de Anlisis de un solo Laboratorio
(Resolucin OENO 8/2005) (Castelucci; 2005). En dicho informe, se sugiere la
utilizacin de rangos de linealidad entre 0-150% o entre 50-150% de la
concentracin susceptible a ser hallada. Con base en esto, se analiz un rango que
abarca aproximadamente del 6 al 174% (14-435M) de la concentracin esperada
en cerebro (250M), en el caso de Glutamato (Lasley, 1984) y del 9 al 301% (45-
1455 M) de la concentracin promedio esperada de GABA (276-690 M; o bien 2-
5M/g tejido) (Kasper et al; 2003; Lasley, 1984). Tambin se tom en cuenta un
rango del 6 al 175% (14-438 M) de la concentracin de glutamina (250 M),
susceptible de ser hallada en cerebro de rata (Lasley, 1984). Del mismo modo, las
distintas concentraciones de taurina y arginina, fueron determinadas con base en la
concentracin aproximada de cada una de ellas, en cerebro de rata (250M)
(Lasley, 1984). El rango de estos dos aminocidos abarca aproximadamente de un
4 a un 130% de la concentracin esperada.

La preparacin de las distintas concentraciones de aminocidos (cuadro 4),
fue realizada de forma serial (es decir, que las diluciones seriales realizadas son
cada una la mitad de la concentracin anterior), para los cinco aminocidos en
matriz.

Los estudios de linealidad fueron llevados a cabo dos veces en das
consecutivos, utilizando concentraciones de OPA de 43mM el primer da y de
86mM, el segundo da de anlisis, manteniendo la misma concentracin de los
dems componentes en la solucin de derivatizacin (etanol, sulfito de sodio y
tetraborato de sodio).

Las calibraciones en el estudio de linealidad se hicieron por el mtodo de
estndar externo. Al final del estudio, se determin el coeficiente de correlacin de
los aminocidos GABA, glutamato y glutamina en matriz; y se analizaron los datos
de la siguiente forma:

1. Determinacin del coeficiente de correlacin incluyendo en el clculo (ver cuadro
3):

a) Las seis concentraciones de los aminocidos en matriz.
b) Las cinco concentraciones menores de los aminocidos en matriz
c) Las cuatro concentraciones menores de los aminocidos en matriz
65
d) Las cinco concentraciones mayores de los aminocidos en matriz
e) Las cuatro concentraciones mayores de los aminocidos en matriz

2. Comparacin de los coeficientes de correlacin obtenidos en los cinco casos
anteriores(ae).

3. Comparacin entre los coeficientes de correlacin obtenidos a 43mM y 86mM

Lo anterior, se realiz con el fin de determinar la linealidad del mtodo y el
efecto de la concentracin de OPA sobre la linealidad obtenida a diversas
concentraciones.

Las concentraciones de los calibradores preparados se exponen en el cuadro3.

Cuadro 3. Concentraciones de los aminocidos transmisores e interferentes
(en moles/L) para anlisis de linealidad
Concentracin (moles/L)

Calibrador

GABA

Glutamato

Glutamina

Arginina

Taurina
1
2
3
4
5
6
1455
727
363
182
91
45
435
217
109
54
27
14
438
219
109
55
27
14

320
159
80
40
20
10

332
166
83
42
21
10

Efecto de la matriz general

Para estudiar un posible desemparejamiento general de la matriz sobre la
cuantificacin de transmisores aminoacdicos, se realizaron curvas de calibracin
para cada uno de los calibradores de inters (GABA, glutamato y glutamina). La
prueba se realiz de manera que ofrece la misma dilucin final que la diseada para
el anlisis en matriz blanca y abarca el mismo rango que la curva de calibrado
expuesta en el cuadro 3. Para saber si existe un efecto de matriz considerable, se
compara la curva de calibracin de los aminocidos en matriz contra la pendiente
66
resultante de las adiciones sucesivas del analito en forma nica. (Castellucci, 2005).
La divisin de las pendientes debe ser cercana a 1. Finalmente, se realiza un
estudio de significancia. Para todos los anlisis de linealidad de aminocidos
transmisores nicos, se emple una concentracin 86mM de OPA.

3.6 Calibracin de equipos y pruebas de idoneidad al sistema HPLC

Balanza analtica y micropipetas:

La balanza analtica marca Explorer OHAUS, modelo E12140 (mx 210g) y
las dos micropipetas marca y modelo Eppendorf Research (10-100L) y Eppendorf
Reference (100-1000 L) respectivamente, fueron calibradas por medio de
PROCAME (UNA) (acreditados con el ISO 17025) (en anexos, certificados de
calibracin respectivos).

pHMetro:

El pHmetro marca CORNING modelo Pinnacle 530 con electrodo CORNING
(3 in 1 Combo w/RJ); se calibr cada da de trabajo, haciendo uso de soluciones
buffer para calibracin pH 4 y pH 7, obteniendo una pendiente de calibracin
siempre cercana al 100% ( +2% ).

Sistema HPLC:

Bomba (Waters 515 HPLC):

Se verific el flujo programado con la recoleccin de fase mvil en una
probeta clase A de 10 mL. Se program un ndice de flujo de 1ml/min durante 10
minutos y se verific la recoleccin exacta de 10 mL. Posteriormente, se evalu la
continuidad del bombeo desconectando la manguera de salida de la precolumna y
columna. Se increment la velocidad de bombeo a 5ml/min y se observ la
continuidad del flujo (el cual no deba cortarse).

Detector (Waters 464 pulsed):

Fue calibrado de acuerdo con la gua de calibracin propia del detector
electroqumico Waters (ver anexo). Adicionalmente, la solucin de Cloruro de plata
67
(AgCl) del electrodo de referencia fue sustituida por el tcnico de la Corporacin
Waters, C.R. Adems, se lav y puli el electrodo de trabajo, segn el protocolo
diseado en cada caso (ver Protocolos de Limpieza y Pulido del Electrodo de
Trabajo, en anexos).

3.7 Bsqueda de Hojas de Seguridad (MSDS, Material Safety Data Sheets)

Para garantizar la seguridad del laboratorio y sus trabajadores, se cre un
archivo con informacin de seguridad de todas las sustancias qumicas, que seran
empleadas para el desarrollo de este protocolo. La informacin disponible incluye la
naturaleza qumica y fsica de los reactivos; el manejo, almacenamiento y
disposicin de los mismos y medidas de precaucin y de primeros auxilios en caso
de inhalacin, ingestin o contacto con la piel. Las hojas de seguridad fueron
obtenidas de los archivos disponibles en la red para la marca Sigma-Aldrich y de la
dcima edicin del manual Merck.

3.5 Protocolo de limpieza

- Lavado de cristalera:

Todo recipiente de vidrio o pyrex fue lavado de la siguiente forma:

Se lav con jabn Liquinox ( 1 parte de jabn por cada 9 partes de agua), toda la
cristalera haciedo uso de hisopos dispuestos para tal fin. Cada recipiente se
enjuag diez veces con agua de caera. Se verific visualmente ausencia de
partculas o jabn. Por ltimo se enjuag dos veces con un volmen pequeo de
agua destilada.

- Lavado de puntas para micropipetas y viales de polietileno:

Las puntas y viales de polietileno fueron colocadas imMediatamente despus
de su uso, en agua destilada y se dejaron en sta, hasta el proceso de lavado.
Cuando lleg el momento de lavar, se colocaron en agua con jabn (1/10), y se
colocaron en agitacin magntica durante media hora. Pasado este tiempo, fueron
colocadas en el bao ultrasnico por 15 min, a 30C. Despus, se enjuagaron todas
las puntas y tubos con agua del tubo haciendo uso de un colador grande.
68
Finalmente, se hizo un ltimo enjuague con agua destilada en agitacin durante 15
minutos y ultrasonificacin por 15 minutos a 30C.

- Secado de cristalera:

La cristalera se sec en un horno Digisystems hasta sequedad a 50,0 +
0,05C.

- Secado de puntas y viales de polietileno:

Las puntas y tubos, se secaron en Horno Digisystems a 40C + 0,05C. Cada
5 minutos se vigilaban las puntas y se sacudan para evitar deformaciones en el
material.

69
4. RESULTADOS

transmisores

Estandarizacin de la sensibilidad del mtodo durante pruebas preliminares

Al evaluar las intensidades de 100 y 50nA (datos no mostrados), se observ
una deteccin deficiente de los aminocidos transmisores en solucin acuosa
(1M). Mientras que la intensidad de 20nA produjo una seal adecuada para los
derivatizados, tanto desde el punto de vista de deteccin de los picos, como de
limpieza de la lnea base. Ms adelante, se muestran los cromatogramas obtenidos
a esta sensibilidad.

Identificacin de los tiempos de retencin asociados a aminocidos
transmisores y evaluacin de la resolucin del mtodo

Las primeras evaluaciones resultantes (cuadro 4) de la inyeccin de
aminocidos en solucin acuosa (1M) mostraron los siguientes tiempos de
retencin para cada aminocido:

Cuadro 4. Tiempos de retencin aproximados de cada aminocido transmisor por
separado en fase mvil (25% metanol, pH 4,5), a una sensibilidad de 20nA, a
temperatura ambiente (25,4 + 0,05C).

Aminocido transmisor Tiempo de retencin (minutos)
Glutamina 7,9
Taurina 7,9
Glutamato 10,6
Arginina 11,7
GABA 20,8

Como se puede apreciar en el cuadro 4 y la figura 20, bajo las condiciones
cromatogrficas del protocolo de referencia, ocurre un traslape entre los
aminocidos taurina y glutamina. Sin embargo, GABA y glutamato no presentan
traslapes aparentes con el resto de los aminocidos.

70

Figura 20. Cromatograma de los cinco aminocidos evaluados y sus respectivos tiempos de
retencin, a una temperatura de 25,4+1C; un flujo de 0,65ml/min, un potencial de 850mV; y
una intensidad de 20nA. De izquierda a derecha, se observan los picos traslapados de la
Glutamina y la Taurina; y los picos nicos, del Glutamato, la Taurina y el GABA.

Al aplicar las frmulas (indicadas en la seccin metodolgica), para
determinar la resolucin de cada aminocido, se obtiene que el factor de resolucin
(R) es mayor a 1 en la mayora de los casos exceptuando para Taurina y Glutamina
(cuadro 5).

Cuadro 5. Valores de R de cada aminocido e interpretacin obtenidos segn la
frmula: R= 2 * [(T
R
)
B
-(T
R
)
A
/ W
A
+ W
B
)
Aminocidos Valor de R Interpretacin
Tau-Gln 0 Se traslapan
Tau/Gln-Glu 3,64 No hay traslape
Glu-Arg 1,56 No hay traslape
Arg-GABA 11,01 No hay traslape

No obstante, al realizar inyecciones de blancos (agua desionizada sin
aminocidos) con reactivo de derivatizacin (0,8L de solucin de derivatizacin;
con OPA 43mM /mL) se observ un tiempo de retencin para este reactivo de 20
minutos, a una temperatura de 26,0 1C. Posteriormente, al realizar inyecciones
de soluciones acuosas de aminocidos (1-100M) se observ el mismo tiempo de
retencin para GABA (derivatizado con 0,8L de solucin de derivatizacin; con
OPA 43mM /mL), a una temperatura de 26,1C (figura 21). Lo anterior, indica que el
valor de R para GABA respecto a OPA es de 0.

71

Figura 21. Interferencia entre los picos de GABA (100M) y OPA (43mM), a una temperatura
de anlisis de 26,0 1C; un flujo de 0,65ml/min, un potencial de 850mV; y una intensidad
de 20nA


La evaluacin del protocolo en homogeneizados de corteza temporal de
cerebro, demuestra el pico poco resuelto en el tiempo de retencin correspondiente
al glutamato. La baja selectividad de este mtodo en cuanto a este neurotransmisor
aminoacdico, impide su cuantificacin. En la figura 22, se muestra el cromatograma
obtenido del anlisis de homogeneizados de corteza temporal de cerebro.

Figura 22. Cromatograma de homogenizados de corteza temporal de cerebro de rata, bajo
las condiciones cromatogrficas del protocolo de Rowley (1995). En azul, se muestra el
cromatograma resultante de la evaluacin del mtodo en homogeneizados de cerebro de
rata. En rosado, se presenta el patrn contra el cual, se compararon los tiempos de retencin
de los picos incgnita del homogeneizado. La temperatura de anlisis fue de 27,0 + 0,5C; el
Tau-Gln
Glu
Arg
GABA/OPA
GABA
OPA
Muestra
Patrn
72
flujo de 0,65ml/min, el potencial de 850mV; y la intensidad de 20nA. Composicin de la fase
mvil: 25% metanol; pH: 4,5.

Debido a la baja resolucin encontrada y a la potencial dificultad para
cuantificar los aminocidos transmisores de inters, se plantearon modificaciones al
protocolo inicial y nuevas estrategias metodolgicas, a fin de desarrollar un
protocolo que permitiera la cuantificacin efectiva de GABA y glutamato. Los
resultados obtenidos en esta segunda fase de experimentacin, se describen en
detalle a continuacin.

4.3 Optimizacin del protocolo para el anlisis de GABA y glutamato

-Anlisis cualitativos:

Efecto de la concentracin de metanol sobre la resolucin de picos

Las cuatro concentraciones de metanol evaluadas, mostraron amplias
variaciones en los tiempos de retencin de los aminocidos y en el tiempo total de
corrida. Si se comparan los resultados obtenidos a concentraciones de metanol
entre 22 y 27%, se observa una tendencia clara en la disminucin de los tiempos de
retencin (ver figura 23). No obstante, dicha tendencia es variable en puntos
intermedios. El cuadro 6, resume los tiempos de retencin obtenidos a temperatura
ambiental y el orden en el que aparecen los aminocidos.

Cuadro 6. Tiempos de retencin de cada aminocido segn la composicin qumica
de la fase mvil. Temperatura de anlisis 26-27C.
Concentracin
de MEOH
Tiempo de retencin de cada aminocido (minutos)
GLN GLU TAU ARG GABA
22% 7,4 8,9 7,9 10,9 19,6
23% 7,2 7,8 8,6 10,6 18,8
25% 7,8 10,23 7,8 11,24 19,7
27% 6,6 7,3 7,8 8,93 14,6

73
0
5
10
15
20
25
22% 23% 25% 27%
[%MEOH]
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i
n

(
m
i
n
)Glutamina
Glutamato
Taurina
Arginina
GABA

Figura 23. Comparacin de las cuatro fases mviles creadas a concentraciones crecientes
de metanol (pH 4,5). La temperatura de evaluacin fue de 26-27C; el flujo de 0,65ml/min,
potencial de 850mV; e intensidad de 20nA. Abreviaturas: min: minutos; MEOH: metanol.

En las figuras 23 y 24, se observa que a una concentracin de 23% metanol,
se obtiene la mejor separacin y deteccin de todos los aminocidos estudiados. Sin
embargo, a esta concentracin de metanol, aun se da un leve traslape entre los
primeros tres aminocidos: glutamina, glutamato y taurina (R<1).

Q T E R G

Q E T R G

Q/T E R G

QET R G

Figura 24. Cromatogramas representativos de cada concentracin de metanol; a pH 4,5;
para cinco aminocidos (100M). Condiciones cromatogrficas: temperatura: 26-27C; flujo:
0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA. Abreviaturas: Arginina: R; Glutamato: E;
Glutamina: Q; GABA: G; Taurina: T.

74
Efecto del pH sobre la resolucin de los picos

Al analizar el efecto que tiene el aumento de los valores de pH en la fase
mvil seleccionada (23% metanol), se observa una tendencia decreciente de los
tiempos de retencin de la mayora de los aminocidos, los cuales, se acercan a la
lnea de frente (figura 25 y cuadro 7).

Cuadro 7. Comparacin de los tiempos de retencin de cada aminocido segn el
pH de la fase mvil.
pH Tiempo de retencin de cada aminocido (minutos)
GLU GLN TAU ARG GABA
4,0 11,0 8,3 7,9 11,9 20,8
4,5 8,6 7,2 7,8 10,6 18,8
5,0 7,7 7,2 8,2 11,0 17,3
5,5 5,9 6,6 7,9 10,5 11,7

El comportamiento descrito, puede apreciarse en el aminocido GABA, el
cual, reduce 9 minutos su tiempo de retencin, con el aumento del pH desde 4 a 5,5.
Del mismo modo, los tiempos de retencin del glutamato y la glutamina, se acortan.
Sin embargo, este tipo de tendencia en la migracin de los aminocidos, no
pareciera aplicarse a la taurina. Este aminocido, no parece tener una tendencia
clara en sus tiempos de retencin, conforme se vara el pH. La taurina mantiene un
tiempo de retencin cercano a los 7,9 0,3 minutos, a lo largo del rango de pH
evaluado.

En general, el porcentaje de variacin en los tiempos de retencin de cada
aminocido, al pasar de pH 4,0 a pH 5,5 es para Glu: 46.36%; Gln:20.48%; Tau:0%;
Arg: 11,76% y GABA:43.75%. En este sentido, las mayores variaciones en los
tiempos de retencin con el cambio del pH, se observan en los aminocidos
glutamato y GABA.

Otra consecuencia observada del cambio del pH de la fase mvil, es el
cambio en el orden, con el que aparecen los aminocidos (figura 26). As, se
observa que la taurina tiene el menor tiempo de retencin a pH 4; la glutamina
posee el menor tiempo de retencin a pH 4,5 y 5; y cuando se alcanza un pH de 5,5,
el aminocido con menor tiempo de retencin es el glutamato. Este ltimo adems,
migra desde una tercera posicin a pH 4, a una segunda a pH 5. Finalmente, el
glutamato migra hasta una primera posicin a pH 5,5, como se mencion
anteriormente.
75

Los resultados obtenidos a pH 6 (temperatura >24C), mostraron traslapes
significativos entre la Glutamina y el Glutamato y entre la Arginina y el GABA
(resultados no mostrados).

0
5
10
15
20
25
4 4,5 5 5,5
pH
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i
n
Glutamina
Glutamato
Taurina
Arginina
GABA

Figura 25. Grfica comparativa de las fases mviles de igual concentracin de metanol
(23%) y diferente pH para cinco aminocidos (100M). Temperatura: 24,5-26,C; flujo:
0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA.

En la figura 26, se puede observar el efecto que tiene el pH sobre los tiempos de
retencin de los aminocidos. Asmismo, se puede observar un cambio en la
deteccin de los mismos a una misma intensidad de corriente (20nA).

T Q E R G
Q T E R G
Q E T R G
E Q T R G

Figura 26. Cromatogramas representativos de cada pH; en fase mvil al 23% de metanol
para cinco aminocidos (100M). Condiciones cromatogrficas: temperatura: 26-27C; flujo:
0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA. Abreviaturas: Arginina: R; Glutamato: E;
Glutamina: Q; GABA: G; Taurina: T.

76
Seleccin de la mejor fase mvil

En esta segunda fase de experimentacin, se logr el desarrollo de tres
fases mviles potenciales para la cuantificacin de aminocidos transmisores. Los
tres mejores mtodos incluyen la utilizacin de las siguientes fases mviles: 23%
Metanol, pH 5,0; 23% Metanol, pH 5,5; y 27% metanol, pH 4,5. La concentracin de
sales utilizada en la preparacin de las tres soluciones, es la misma descrita en el
protocolo de referencia. Como se mencion en la seccin metodolgica, los criterios
para la eleccin de la mejor fase mvil fueron: resolucin de los picos,
correspondientes a GABA y Glu (concedindole tambin cierta prioridad al
aminocido Gln); tiempo total de corrida, tiempo de retencin de los picos
contaminantes de la solucin de derivatizacin (los cuales no deban ser
interferentes) y mejor resolucin en homogeneizados de cerebro de rata. Con base
en los criterios de seleccin, a continuacin se muestran los cromatogramas
correspondientes a las tres mejores fases mviles desarrolladas, a temperaturas
ptimas de corrida.

Q E T R G
E Q T R G

Q E T R G

Figura 27. Cromatogramas de las tres mejores fases mviles desarrolladas. En azul: fase
mvil al 23%MEOH;pH 5,5; temperatura 18,1C. En caf: fase mvil al 23%MEOH, pH 5,0;
temperatura 16,7C. En rosado: fase mvil al 27%, pH 4,5; temperatura 21,2C. Condiciones
cromatogrficas generales: Flujo: 0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA
Abreviaturas: Arginina: R; Glutamato: E; Glutamina: Q; GABA: G; Taurina: T.

El orden de los aminocidos, con el cambio del pH o la concentracin de
metanol cambia ms frecuentemente en los primeros tres aminocidos. Por otro
lado, el orden de los aminocidos en las fases mviles a distinto pH y porcentaje de
metanol, puede ser el mismo, tal y como sucede con las fases mviles: 27%
MEOH,pH: 4,5 y 23%, pH 5,0.
77

Cuadro 8. Comparacin de las tres mejores fases mviles desarrolladas y del
protocolo de referencia. Temperatura de evaluacin: 21,0+ 1C.
Protocolo

Tiempo total
de corrida
(minutos)
Valor general
de la
Resolucin(R)
Traslapes
entre
aminocidos
Interferencias
por OPA
23% MEOH; pH 5,5 17,0 >1 no no
23% MEOH pH 5,0 24,5 <1 si no
27% MEOH; pH 4,5 23,0 1 no no
25%MEOH,pH 4,5 20,0 <1 si Si, en GABA

En el cuadro 8, se observa que la fase mvil de mejores caractersticas es
aqulla que tiene una composicin de 23% de metanol y pH 5,5. Esta fase mvil
exhibi el mejor tiempo de corrida y la mejor resolucin, de los aminocidos sin
interferencias por OPA, a una temperatura de 21,0 1C.

Pruebas preliminares en cerebro de rata

Los resultados obtenidos al realizar corridas de muestras en
homogeneizados de corteza temporal de rata, utilizando la fase mvil de mejores
caractersticas (23%MEOH, pH 5,5), muestra un pico de GABA con un leve traslape.
Los picos de Glu y Gln se ven interferidos por un componente desconocido. Estos
picos, pueden apreciarse en tiempos de retencin de 8,9 y 9,9 minutos
respectivamente. El GABA por su parte, tiene un tiempo de retencin de 20,6
minutos (figura 28).

Figura 28. Cromatograma de una muestra de corteza temporal diluda 1/10. Condiciones
cromatogrficas: 23% MEOH; pH 5,5; flujo 0,65ml/min; temperatura:8,1C, potencial:850Mv.
La temperatura de corrida del patrn fue de 9C.
GABA
Glu
Gln
Muestra
Patrn
78
Efecto de la temperatura sobre el pH de una fase mvil

Las evaluaciones consecutivas de temperatura y pH permitieron evaluar el
efecto que tiene el incremento de la temperatura sobre el pH de la fase mvil,
durante su preparacin. An cuando la relacin pH vrs temperatura fue variable, las
mediciones realizadas indican que el pH puede disminuir 0,01 puntos por el
aumento mnimo de 0,1C. Sin embargo, ciertos puntos de pH se mantuvieron
estables inclusive cuando el incremento era de 0,6C en la temperatura. El pH y la
temperatura se comportan de forma inversa. Es decir, que cuando aumenta la
temperatura, disminuye el pH y viceversa (figura 29).

5,45
5,5
5,55
5,6
5,65
5,7
5,75
0 5 10 15 20
Temperatura
p
H

Figura 29. Representacin grfica de la relacin entre pH y temperatura. La figura muestra
como disminuye el pH conforme aumenta la temperatura. Las mediciones fueron hechas con
una fase mvil con metanol al 23%.

Efecto del cambio en la temperatura sobre los tiempos de retencin

Como se muestra en la figura 30, el tiempo de retencin de los aminocidos
estudiados disminuye al aumentar la temperatura. Es decir, que la temperatura y los
tiempos de retencin, se comportan de manera inversa. Adicionalmente, los tiempos
de retencin tienden a variar ms con el cambio de la temperatura, conforme ms
alejados estn de la lne de frente, tal y como sucede con los picos de los
aminocidos arginina y GABA.

79

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20
Tiempo de retencin (min)
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a

(
C
)
Glutamato
Glutamina
Taurina
Arginina
GABA

Figura 30. Grfica del comportamiento de los tiempos de retencin de cada aminocido
frente a variaciones en la temperatura.

En estudios posteriores, se observ que cuando la temperatura ascenda por
arriba de 26C, se originaban traslapes entre glutamato y glutamina. Se observ
adems, una adecuada separacin de los picos correspondientes a los aminocidos
de inters, en un rango de 17C-23C.

Efecto del ndice de flujo sobre los tiempos de retencin

Como se esperaba, la disminucin en los ndices de flujo (figura 31) provoca
un aumento en el tiempo de anlisis, pero mejora la definicin de los picos y permite
resolver un poco ms los dos primeros aminocidos (Glutamato y Glutamina) entre
s y de la lnea de frente. La mejor definicin se obtuvo a un flujo de 0,45ml/min, a
una temperatura de 17 0,5C. con un tiempo de anlisis de 20 minutos
aproximadamente.

80
Figura 31. Cromatogramas de la misma fase mvil (23% metanol, pH 5,5) realizados a
diferentes flujos (en mL/min) para los cinco aminocidos (100mM); intensidad de
corriente:20nA; potencial 850mV.

Reajuste de la intensidad de corriente aplicada en la deteccin

Utilizando una sensibilidad mixta 10-50nA, cada uno de los picos de los seis
aminocidos, pudieron ser analizados en una misma corrida como se observa en la
figura 32. El cuadro 9, resume los resultados obtenidos a las distintas sensibilidades.

Cuadro 9. Relacin entre la intensidad aplicada y la respuesta en Mv.s de los
transmisores: glutamato, glutamina y GABA.
Aminocido
Transmisor
Respuesta (mV.s) a distintas intensidades aplicadas
10nA 10/20nA 20/50nA 10/50nA
GLU
(435 mol/L)
20,279 20,888 11,341 20,280
GLN
(438 mol/L)
47,493 46,380 20,388 49,412
GABA
(1455mol/L)
f.r f.r 180,136 217,512
f.r: fuera de rango

81
10nA 50nA

Tau

GABA
Gln
Glu Arg

Figura 32. Intensidad de corriente ptima para el anlisis de Glutamato, Glutamina y GABA
(En el cromatograma: primero, segundo y ltimo pico respectivamente). Los primeros 12
minutos se realizaron a una intensidad de 10nA y el resto del tiempo a una intensidad de
50nA.

- Anlisis Cuantitativos:

Efecto de la concentracin de OPA sobre la deteccin qumica de aminocidos

Al comparar las reas relativas de los aminocidos acuosos (100M) en
matriz, marcados con concentraciones crecientes de OPA, se observa una variacin
mnima de las reas relativas correspondientes a cada aminocido,
aproximadamente a partir de los 14L/mL (figura 33). Las reas relativas de los
aminocidos en matriz, presentaron fluctuaciones ms notorias, cuando fueron
derivatizados con una cantidad de solucin de derivatizacin menor que 14L/mL.
Las variaciones de las reas relativas se observaron tambin entre inyecciones
sucesivas de aminocidos (100M), derivatizados con exactamente la misma
cantidad de solucin de derivatizacin (datos no mostrados).
82
0
10
20
30
40
50
60
70
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
L de solucin de derivatizacin (OPA 43mM)
por ml de patrn
%

r
e
a

R
e
l
a
t
i
v
a
GLU
GLN
TAU
ARG
GABA

Figura 33. Respuesta comparativa porcentual de las reas de los picos de los cinco
aminocidos (100M) por cromatograma, segn la cantidad de L de solucin de
derivatizacin aadida. Sensibilidad: 20nA, potencial: 850mV ; flujo: 0,5ml/min; rango de
temperatura 17-23C; composicin de la fase mvil:23% MEOH; pH: 5,5.

Prueba de Veracidad (repetibilidad)

Las medidas estadsticas aplicadas en el anlisis de los resultados obtenidos
tras inyecciones sucesivas de patrones acuosos aminoacdicos, de igual
concentracin, se muestran en el cuadro 10.

Cuadro 10. Resultados obtenidos de las pruebas de repetibilidad en un solo da para
los distintos aminocidos en matriz

Transmisor Promedio Porcentaje de
Variacin
Desviacin
Estndar
Desviacin
Estndar
Relativa
Glutamato 0,014714 1,9 0,000469 3,19
Glutamina 0,014765 1,6
0,000599
4,06
GABA 0,014557 2,9
0,000516
3,54

83

Reajuste de la concentracin de OPA para anlisis de linealidad

El anlisis de adiciones de reactivo de derivatizacin, no mostr variaciones
importantes, como aqullas encontradas anteriormente en las reas relativas de los
aminocidos en matriz a menor concentracin. La figura 34 muestra los resultados
obtenidos.

0
10
20
30
40
50
60
70
20ul 24ul 28ul 32ul 38ul 44ul
L de solucin de derivatizacin (OPA 43mM)
por ml de patrn
%

r
e
a

R
e
l
a
t
i
v
a
GLU
GLN
TAU
ARG
GABA

Figura 34. La grfica muestra una comparacin entre las reas relativas de los aminocidos
por cromatograma, al variar la cantidad de solucin de derivatizacin aadida (OPA 43mM).
Intensidad: 20nA, potencial: 850mV; flujo: 0,5ml/min; rango de temperatura 17-23C;
composicin de la fase mvil:23% MEOH; pH: 5,5.

Prueba de Linealidad

Tras la elaboracin de curvas de calibracin, se obtuvo una respuesta lineal
en todos los aminocidos, entre la tercera y la sexta concentracin (ver en
metodologa, el cuadro 3) que corresponden a una concentracin entre 363 y 45 M
para GABA y entre 109 y 14 M para Gln y Glu . El rango ms amplio de linealidad,
con coeficiente de correlacin satisfactorio, fue el de GABA, a partir de la segunda
(727 M) y sexta (45 M) concentracin (cuadro 11 y figura 35).

En este sentido, si se comparan los coeficientes de correlacin obtenidos en
los extremos superior e inferior del rango de concentracin evaluado (cuadro 11 y
12), se observan diferencias notables. Al evaluar las cuatro concentraciones
mayores (1-4) y menores (3-6) del rango, se observa en general, un coeficiente de
84
correlacin significativamente mayor en el extremo inferior del rango. El mismo
fenmeno se observa al comparar el coeficiente de correlacin de cinco
concentraciones que forman parte de los extremos superior (concentraciones: 1-5) e
inferior (concentraciones: 2-6) del rango.

En sntesis, los coeficientees de correlacin aumentan conforme se
disminuye la concentracin del analito.

Adems, se observa una coincidencia entre el aumento de la concentracin
de OPA y el incremento en el valor del coeficiente de correlacin de los aminocidos
(cuadro 11).

Si se comparan los coeficientes de correlacin, de las curvas de linealidad
que incluyen desde la cuarta a la sexta concentracin de aminocidos, obtenidas a
concentraciones de OPA distintas (43-86mM), se observa en general, un coeficiente
de correlacin ms alto a 86mM de OPA.

Por otro lado, si se comparan los coeficientes de correlacin obtenidos a
diferentes concentraciones de OPA, del cuadro 12, se observa que GABA posee los
coeficientes de correlacin ms altos y que estos aumentan a concentraciones de
OPA de 86mM. Asimismo, el coeficiente de correlacin de Glu se incrementa, con el
aumento de la concentracin de OPA, al evaluar las cinco concentraciones mayores
del analito.

No obstante, el coeficiente de correlacin de Glu disminuye, al evaluar las
cuatro concentraciones mayores. Del mismo modo, los coeficientes de correlacin
de Gln disminuyen tanto en las evaluaciones de cuatro como de cinco
concentraciones mayores del analito.

85
Cuadro 11. Coeficiente de correlacin asociado a cada transmisor, segn la
concentracin de OPA agregada (puntos inferiores de la curva de linealidad)

Aminocido
Transmisor
Coeficiente de Correlacin L de solucin
de
derivatizacin
/concentracin
OPA
A cuatro
concentraciones
menores de
analito
A cinco
concentraciones
menores
de analito
A seis
concentraciones
de analito
Glutamato 0,9987197 0,7409657 0,3462974 22 L/43mM
Glutamina 0,9998062 0,8840145 0,644877 22 L/43mM
GABA 0,996997 0,9994006 0,932202 22 L/43mM
Glutamato 0,9983952 0,9563667 0,456044 22 L/86mM
Glutamina 0,9984961 0,9769898 0,6102978 22 L/86mM
GABA 0,9985169 0,9997001 0,9664556 22 L/86mM

Cuadro 12. Coeficiente de correlacin asociado a cada aminocido, segn la
concentracin de OPA agregada (puntos superiores de la curva de linealidad).

Aminocido
Transmisor
Coeficiente de Correlacin L de solucin
de
derivatizacin
/concentracin
OPA
A cuatro
concentraciones
mayores de
analito
A cinco
concentraciones
mayores
de analito
A seis
concentraciones
de analito
Glutamato 0,1271719 0,1701739 0,3462974 22 L/43mM
Glutamina 0,4053104 0,5661935 0,644877 22 L/43mM
GABA 0,9051195 0,9219868 0,932202 22 L/43mM
Glutamato 0,1133958 0,331529 0,456044 22 L/86mM
Glutamina 0,3571781 0,5227769 0,6102978 22 L/86mM
GABA 0,9548216 0,962167 0,9664556 22 L/86mM

86
A.

B.

C.

Figura 35. Curvas de linealidad de las cuatro ltimas concentraciones de Glutamato (A) y
Glutamina (B) en matriz, y de las ltimas cinco de GABA (C); derivatizadas con 22 L de
solucin de derivatizacin (OPA 86mM).

87
Efecto de la matriz general

Al realizar las derivatizaciones de cada aminocido individual, para
determinar la curva de linealidad de cada uno de ellos; y al utilizar la misma
concentracin de OPA y condiciones cromatogrficas, que las utilizadas para el
estudio de linealidad en matriz de aminocidos, se encontr una respuesta (en
mV.s) incrementada de los analitos derivatizados. Lo ltimo, provoc que todas las
concentraciones evaluadas se salieran del rango, con excepcin de las dos ltimas
de Glutamato.

Condiciones cromatogrficas ptimas recomendadas:

Detector electroqumico: Waters 464 pulsed
Bomba: Waters 515 HPLC
Columna de separacin: Spherisorb ODS1 C18, fase reversa (5m, 250 * 4,6
mm)
Fase mvil: 0,5mM EDTA; 0,1M Buffer Fosfato monobsico; 23% metanol, llevada
a pH 5,5 con Ac. Fosfrico (5M).
Flujo: 0,45ml/min
Volumen del loop: 50L
Volumen inyectado: 100 L.
Temperatura: 18-23C, con sistema de enfriamiento
Potencial aplicado: 850mV
Intensidad de corriente del electrodo de trabajo: 10nA (durante primeros 12 min)
a 50nA (hasta el final de la corrida).
Tipo de circulacin de la fase mvil: circuito cerrado
Integracin: por estndar externo
Determinacin de la respuesta: por rea del pico

88
5. DISCUSIN

Las primeras pruebas realizadas para este trabajo fueron diseadas de tal
forma que permitieran una familiarizacin con el mtodo. Sin embargo, la falta de
indicaciones en el artculo de referencia tales como el valor de la intensidad de
corriente utilizada, la temperatura bajo la cual se prepar la fase mvil y la tasa de
concentracin del analito por concentracin de OPA, cre ciertas dificultades al
inicio de la estandarizacin del protocolo.

La dificultad ms clara fue la definicin de la concentracin del reactivo de
derivatizacin por concentracin de aminocido y grupo de aminocidos. La
cantidad de OPA sugerido por Rowley, et al (1995) es de 20L (OPA 86mM), para
un estndar de aminocidos. Utilizando esta cantidad de reactivo, al inicio de la
primera fase experimental (evaluacin del protocolo); se observaron una gran
cantidad de picos que no correspondan a los de cada aminocido analizado. Este
tipo de contaminante apareca en corridas de hasta 95 minutos (datos no
mostrados).

Sabiendo que el OPA podra ser el causante de la presencia de picos
fantasma en el cromatograma (Rowley et al, 1995), se vari la cantidad del reactivo
de derivatizacin de 20 a 0,4 L de reactivo de derivatizacin por mL. Esta cantidad
era sugerida en el protocolo de referencia (Rowley et al; 1995), para el marcaje de
microdializados. Dado que la cantidad de OPA que sera pesada por da
corresponda a la mitad de la sugerida en el protocolo (con el fin de evitar
desperdicios), se utiliz el equivalente de dicha cantidad, es decir, 0,8L de reactivo
de derivatizacin por mL de aminocido nico.

Por otra parte, los aminocidos en matriz fueron sometidos a
derivatizaciones cercanas a los 0,8L solucin de derivatizacin (OPA 43M) / mL
de solucin estndar (cantidades evaluadas: 2,0 y 5,0uL/mL). A partir de estos
anlisis, se observ que la cantidad ms adecuada era de 2L por mL de solucin
acuosa de aminocidos, ya que no produca contaminaciones aparentes en el
cromatograma y permita el marcaje de los aminocidos y, eventualmente, permitira
la evaluacin de la resolucin del mtodo.

89
Una estrategia utilizada para definir la cantidad de microlitros de reactivo de
derivatizacin utilizados, fue la inyeccin de blancos con solucin de derivatizacin.
Esto se hizo con el fin de identificar los posibles tiempos de retencin del reactivo.

Adems, se busc que la cantidad de reactivo utilizada no produjera
contaminacin de la lnea base y que, adems marcara qumicamente al analito o
grupo de ellos, dejando para ms tarde el problema de si la concentracin de OPA
era adecuada para la cuantificacin de cada aminocido.

Asmismo, al inicio del trabajo prctico, se contempl la posibilidad de
realizar corridas sin derivatizaciones previas. Sin embargo, los resultados obtenidos,
a concentraciones 1M de aminocido, sealaban la necesidad de utilizar
intensidades de corriente menores a 10nA. A este nivel de sensibilidad, la calidad de
la lnea base empezaba a disminuir y los picos logrados no eran todava lo
suficientemente notables o visibles, para ser analizados con precisin.

Tal y como se expone en la revisin de literatura, la alta calidad de deteccin
observada con el uso del reactivo de derivatizacin, se debe a la facilidad con la
cual se oxidan los aminocidos marcados en su paso por el electrodo de carbn
(Arslan, O; 2001; Webster; 2001; Jacobs, 1987). Por ende, la derivatizacin de
aminocidos permiti obtener respuestas de alta calidad de deteccin, con picos
bien definidos (semejantes a tringulos) y una lnea base con poco o ningn ruido
(debida a la aplicacin de intensidades mayores: 10-20-50nA).

Con el objetivo de lograr respuestas cromatogrficas de alta calidad y una
mayor estabilidad de los productos derivatizados, los investigadores han realizado
derivatizaciones con molculas que poseen grupos mercapto (-SH) en su estructura,
tales como los tioles: -mercaptoetanol (-ME) y el tert butil tiol (Rowley et al, 1995).
Estos grupos actan como cofactores de la reaccin (ya que son agentes
reductores), incorporndose a la estructura del derivatizado en conjunto con el OPA
(figura 36) (Schalkhammer, 2002; Giddings, 1984).

90

Fig 36. Producto de la reaccin entre OPA, -ME y una amina primaria.
Modificado de: Schalkhammer; 2002.

Sin embargo, el tipo de interaccin lograda entre OPA y un aminocido, en
presencia de un grupo sulfito, descrito por Rowley (1995), ofrece una ventaja sobre
las derivatizaciones realizadas en presencia de grupos tiol. Por un lado, las
derivatizaciones en presencia de -mercaptoetanol producen derivatizados
inestables en el tiempo, lo que limita la aplicabilidad del mtodo (Acworth, 1997).
Para mejorar la precisin y exactitud de la cuantificacin de aminocidos en
presencia de este tiol, debe vigilarse cuidadosamente el tiempo de reaccin, que es
de aproximadamente 1-3 minutos (Acworth, 1997; Boulton, 1985; Giddings, 1984).
Por otra parte, los tioles, son sustancias muy voltiles con olores penetrantes que
podran ser molestos durante las labores cotidianas. En este sentido, el uso de OPA
en presencia de sulfito, produce compuestos derivatizados de mayor estabilidad en
ausencia de olores penetrantes que resulten incmodos durante el trabajo (Acworth,
1997).

La figura 37, muestra la reaccin entre un grupo sulfito, OPA y un
aminocido. Al igual que los tioles, el grupo sulfito se incorpora al producto principal
de la reaccin, liberando un grupo hidroxilo (-OH), de uno de los dos grupos
carboaldehdo (-CHO) de la molcula de OPA. A continuacin, la amina primaria del
aminocido forma un enlace covalente con el carbono expuesto de OPA. El
hidrgeno expuesto de la amina primaria, reacciona con el grupo carboaldehdo
(-CHO) de OPA, liberndose una molcula de agua. La molcula resultante es un
isoindol (Rowley et al 1995; Jacobs, 1986).

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Fig 37. Representacin de la reaccin qumica entre OPA, un grupo sulfito y un aminocido.
La molcula final corresponde a un grupo N-alquilo-1-isoindol sulfonatoFuente: Jacobs,
1986.

La estabilidad descrita para los derivatizados de OPA en presencia de un
grupo sulfito, constituye otra de las razones principales, por las cuales, se eligi el
protocolo de Rowley et al (1995) como protocolo base para este trabajo.

Por otra parte, la magnitud de la reaccin no depende solamente de la
estabilidad de los derivatizados sino tambin del pH alcalino (pH 8-11) (Phyllis,
1997). Otro factor importante en el desarrollo de la reaccin es la concentracin de
OPA. En los anlisis de estabilizacin de las reas relativas (figura 34) se observa
una mayor afinidad entre el aminocido GABA el OPA. De hecho, los primeros
puntos de la curva demuestran como el rea relativa de GABA es comparativamente
mayor a la del resto de los aminocidos. Tambin se observa que conforme se
aumenta la cantidad de L de OPA, las reas relativas de GABA decrecen
paulatinamente hasta estabilizarse. El fenmeno contrario se observa con las reas
de glutamato y glutamina, es decir, un crecimiento comparativo de las reas seguido
de una estabilizacin posterior.

La lgica del ensayo del porcentaje de reas relativas segn la concentracin
de solucin de derivatizacin agregada, reside en el rendimiento de la reaccin. Es
decir, que si las reas de los analitos se estabilizan probablemente se deba a que la
reaccin entre este reactivo y los aminocidos lleg a su punto mximo, a medida
que se aumenta la concentracin de OPA.

El uso de representaciones grficas con estabilizacin de reas, a pesar de
ser un dato cualitativamente til, no tiene valor estadstico. En la figura 34, se puede
observar, una respuesta relativamente uniforme en las reas relativas de cada
aminocido al comparar, la cantidad de 44L con aproximadamente la mitad de la
cantidad agregada (20L/mL). La concentracin final de OPA obtenida (1,9mM) al
agregar 44L de solucin de derivatizacin (OPA 43mM) en un mililitro de solucin
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de aminocido, corresponde a una concentracin de OPA cercana a la propuesta en
el artculo (1,72mM). Por otro lado, la concentracin final de OPA, obtenida al
agregar 20L de solucin de derivatizacin (OPA 43mM) en un mililitro de solucin
acuosa de aminocidos, corresponde exactamente a la mitad de la concentracin
propuesta por Rowley (0,86mM).

Basados en los resultados obtenidos, se construyeron curvas de linealidad
en ambos extremos de concentracin de OPA, lo que permiti corroborar finalmente,
que existe una diferencia en el marcaje de analitos a concentraciones distintas.

Los coeficientes de correlacin que fueron mayores con OPA 86mM (cuadro
11) sugieren que esta concentracin es la mejor para obtener una mayor linealidad
para cada aminocido. Esto probablemente se deba a un mayor marcaje de
aminocidos a las concentraciones ms altas del rango.

Como es de esperar, para un anlisis de linealidad, hay una correspondencia
entre la concentracin del aminocido analizado y el rea del pico correspondiente:
en este caso particular, a medida que aumenta la concentracin aumenta el rea del
pico. Los coeficientes de correlacin muestran que la mejor linealidad se obtiene con
una concentracin de OPA de 86mM (cuadro 11). Al disminuir la concentracin del
aminocido, aumenta el OPA disponible para la reaccin y por lo tanto aumenta
tambin el marcaje de los aminocidos a analizar.

Debido a que los dems componentes del reactivo de derivatizacin se
mantuvieron constantes, al variar la concentracin de OPA, se puede asegurar que
el efecto observado en la deteccin de los aminocidos, se debe exclusivamente a
los cambios en la concentracin de OPA y no a cambios de alcalinidad.

Por otro lado, el aumento de la concentracin de OPA y de la cantidad de
buffer tetraborato, deben ser manejados con cuidado, porque podran ocasionar
daos estructurales en la columna, cuyo rango de trabajo se encuentra a un pH
entre 2,5-8. Una alcalinidad mayor puede causar la disolucin de la slica, que
compone la columna de separacin (Nollet; 2004).

Las primeras evaluaciones del protocolo de referencia en homogeneizados
de cerebro (figura 24), comparadas con las que fueron realizadas en matriz blanca
de aminocidos no fueron satisfatorias debido a que no se observ una buena
93
separacin de los analitos de inters de otros componentes desconocidos de la
muestra. Para tratar de solventar este problema, podran variarse ciertas
condiciones de anlisis entre otras: la composicin qumica de la fase mvil (i.e.
quelante, proporcin agua/metanol, pH), el flujo de corrida (reduccin); la
temperatura (disminucin).

La fase mvil est compuesta por diversas sustancias, cada una de las
cuales, con una funcin muy especfica: quelantes de iones (en este caso EDTA);
buffer (fosfato monosdico) y metanol.

Los quelantes limitan la formacin de complejos entre iones metlicos
electroactivos, que pueden estar presentes en el eluente, en el sistema HPLC o en
el empaque de la columna y causar contaminacin del cromatograma. Por lo tanto,
el uso de EDTA, cuando se cuenta con un sistema de deteccin electroqumica,
favorece la calidad de la lnea base (Ganguly, 1991).

El otro componente de la fase mvil, el buffer fosfato, evita variaciones
significativas en el pH de la fase mvil tras la inyeccin de soluciones de
aminocidos de mayor o menor pH.

Por otra parte, el uso de diferentes proporciones de agua/metanol permite
variar gradualmente la polaridad de la fase mvil. Por ejemplo, el ndice de polaridad
del agua es de 10,2; mientras que el ndice de polaridad del metanol es de 5,1 (Fung
Ho et al; 2000). Este ndice, da una idea de la capacidad de un solvente de eluir un
componente en la columna. En la tcnica de cromatografa en fase reversa, la
retencin de los compuestos se basa en una atraccin primaria entre la fase
estacionaria y la regin no polar del analito. El orden de elucin de los componentes
ir de ms hidroflico a ms hidrofbico. Por ello, para aumentar la retencin de un
compuesto se debe aumentar la polaridad de la fase mvil (figura 25).

Otro elemento que altera las caractersticas qumicas de la fase mvil es el
pH. Como se observa en la figura 27 el aumento en el valor de pH, produce una
disminucin de los tiempos de retencin de los aminocidos analizados.

Segn, Blackburn (1987), este efecto es mayor en aquellos aminocidos que
presentan un grupo carboxlico en su cadena lateral. Por ejemplo, el rango de pH
bajo el cual se observan estos efectos, es consistente con la disociacin cida del
94
grupo carboxilo de la cadena lateral del Glutamato (pk
R
=4.25). El hecho que el
glutamato sea el primer aminocido en eluir de la columna con el aumento del pH a
5,5, significa que tiene una mayor afinidad por la fase mvil, a este pH . Debido a
que el glutamato posee dos cargas negativas y una positiva en este punto de pH, es
decir, una carga neta de -1. Esta carga, podra favorecer el tipo de interacciones que
pueden darse entre el glutamato, el agua y el metanol, tal como la formacin de
puentes de hidrgeno. Aunado a esto, la desprotonacin del grupo carboxilo delta
podra ser la causa del debilitamiento de las interacciones con la fase estacionaria
C18, al aumentar los valores de pH. En resumen, como consecuencia de las fuerzas
descritas, el glutamato presenta un tiempo de retencion corto.

Siguiendo el orden de elucin, el segundo aminocido detectado es la
glutamina. La glutamina es un aminocido polar con cadena lateral neutra, que
posee una carga positiva (pKNH3
+
=9,13) y otra negativa (pKCOOH=2,17), a pH
5,5; lo que le confiere una carga neta de 0 (Stenesh, 1998). La semejanza
estructural entre la glutamina y el glutamato y la ausencia de una carga neta a un pH
de 5,5 podra explicar el hecho de que esta molcula ocupe el segundo lugar de
aparicin dentro del grupo de aminocidos evaluados.

Los ltimos analitos en eluir son en su orden: la taurina, la arginina y el
GABA.
Por un lado, la taurina (tercer analito); es un cido orgnico, porque posee un
grupo sulfonato (Timothy, et al; 1998). A pH 5,5 el grupo amino de la taurina se
encuentra protonado, pero como no posee un grupo alfa carboxilo, como los otros
aminocidos, sino un grupo sulfonato, esto podra permitirle cierta interaccin con la
fase mvil, por medio de la formacin de puentes de hidrgeno.

La arginina, por su lado, es un aminocido de naturaleza polar, posee dos
cargas positivas a un pH de 5,5, correspondientes a los dos grupos amino
(pKCOOH=2,17 ; pKNH3
+

= 9,04; grupo guanidino, pK
R
= 12,48) (Stenesh, 1998).
Dichas cargas positivas, podran fortalecer la interaccin con la fase estacionaria de
la columna, causando una retencin comparativamente mayor, con glutamato,
glutamina y taurina.

Por ltimo, el quinto aminocido en eluir, el GABA, tiene una carga neta de 0
a pH 5,5; se caracteriza por ser la molcula ms pequea de las anteriormente
mencionadas y por tener un pKNH3
+
= 10,5. Adems, carece del grupo alfa
95
carboxilo. El tiempo de retencin del GABA podra deberse a la polaridad reducida
que le confiere su estructura qumica, la cual, consiste en un grupo amino y un
grupo carboxilo distribuidos en extremos opuestos del esqueleto de carbono
(Williams, 2003).

Con base en los argumentos expuestos, la migracin diferencial de los
aminocidos, a un pH de 5,5; utilizando una fase estacionaria de slica y una
concentracin constante de metanol al 23%, podra atribuirse a dos factores
principalmente: a los valores de la carga neta del aminocido, asociado a la
capacidad de cada molcula para donar o aceptar protones a pH 5,5; y al grado de
polaridad de cada aminocido, que le confiere una mayor o menor interaccin con la
fase C18 estacionaria y/o una mayor o menor solubilidad en la fase mvil metanol
(23%):agua.

Segn, Blackburn (1989); bajo caractersticas similares de pH (5,7); fase
mvil (agua: metanol) fase estacionaria (C8), y condiciones isocrticas, el orden de
elucin de aminocidos es el siguiente: 1) aminocidos cidos, 2) bsicos, 3)
aminocidos con cadena lateral de grupo alquilo y 4) aminocidos hidrfobos. Esto
concuerda, con los resultados obtenidos en este trabajo.

En la figura 38, se muestra un estudio realizado (Rea, et al; 2005); bajo una
escala de pH similar a la estudiada en este trabajo. Ntese el acortamiento en los
tiempos de retencin de GABA y glutamato, bajo condiciones de fase mvil distintas
(70 mM de fosfato disdico; 400 M EDTA, 0.15% (v/v) tetrahidrofurano y 30%
metanol). La taurina tambin presenta un comportamiento similar al obtenido bajo el
protocolo descrito en este trabajo.

Figura 38. Corridas realizadas bajo los mismos valores de pH evaluados pero bajo
condiciones cromatogrficas y de fase mvil distintas. Fuente: Rea, et al; 2005.
96

El protocolo desarrollado en este trabajo, posee diversas ventajas sobre
otros protocolos publicados (Rea, Rowley,).

La mayora de los protocolos revisados (Zhang et al, 2005; Bianchi et al,
1999), no recirculan la fase mvil con el fin de evitar la contaminacin de la misma,
lo que podra afectar el cromatograma resultante. Con el protocolo desarrollado en
este trabajo, se obtienen datos replicables, lineales, a pesar de que la fase mvil se
recircul. Esto es de gran importancia, no solamente porque reduce e gasto en
reactivos, sino tambin, porque disminuye el tiempo de preparacin de fase mvil
nueva. La vida til, para una fase mvil de 250mL, alrededor de dos semanas, lo
que corresponde aproximadamente a 196 muestras.

Por otro lado, la elucin de los aminocidos es comparativamente ms
rpida que la registrada en otros protocolos (Lasley et al; 1984; Zhang; 2005) (20
minutos a 0,45mL/min), obtenindose tiempos de corrida menores de un 63% y
hasta un 75%.

Como consecuencia directa de esto se pueden inyectar un nmero mayor de
muestras por da.

Asimismo, el protocolo permite la cuantificacin de tres neurotransmisores: el
GABA, el glutamato y la glutamina, en una sola corrida, utilizando una bomba
isocrtica. En otros trabajos, en los que se logra la resolucin de estos tres
aminocidos, se logra utilizando gradientes de solvente, para lo cual se necesita de
una bomba binaria (Zhang et al, 2005; Bianchi et al, 1999). Este logro, demuestra
que el protocolo desarrollado es concordante con el equipo con el que se cuenta en
el programa de neurociencias.

En algunos trabajos, se ha visto la necesidad de llevar a cabo un lavado de
la columna (Lasley,et al; 1984), utilizando diferentes solventes, despus de cada
inyeccin, para evitar interferencia de algunos aminocidos con tiempos de
retencin superiores que podran quedar atrapados dentro de la columna.
Posteriormente, esta columna debe ser reequilibrada para retomar las condiciones
iniciales para la siguiente inyeccin. El protocolo implementado en este trabajo, es
tal que no se requiri ni el lavado ni el reequilibrio de la columna durante los anlisis.
97
Esto redunda en una disminucin del tiempo requerido para el anlisis de cada una
de las muestras.

Durante el desarrollo del protocolo resultante de este trabajo, se probaron
diferentes condiciones para el anlisis de homogeneizados de cerebro de rata, como
se describi en la seccin de resultados. Bajo esas condiciones experimentales, se
presentaron varios inconvenientes, que impidieron la obtencin de resultados
adecuados para los analitos de inters.

Bajo las condiciones cromatogrficas establecidas por Rowley (1995), se
observa una resolucin deficiente de los picos correspondientes a glutamina y
glutamato, lo que impidi una cuantificacin exitosa de los mismos. La causa de
este problema radic posiblemente en la presencia de otros aminocidos o
compuestos presentes en el tejido cerebral que no fueron tomados en cuenta,
inicialmente.

Ya en otros estudios (Cazes, 2001), se sugiere la adicin de inhibidores de
proteasas a la solucin en la que se introduce el tejido cerebral. sto podra
solucionar parcialmente este problema, impidiendo la protelisis de protenas
celulares y de esa manera, disminuira la cantidad de aminocidos libres que
podran reaccionar con el OPA, produciendo interferencias.

Posteriormente utilizando algunos de los parmetros establecidos por
Rowley (flujo: 0,65ml/min; potencial: 850mV; intensidad: 20nA) y variando la
concentracin de metanol de 25 a 23% y el pH de 4,5 a 5,5, se observ una leve
mejora en la resolucin de los cromatogramas, sin ser totalmente satisfactoria.
Datos posteriores no sistematizados (ver figura 39 en anexos), sugieren que se
deberan modificar algunas de las condiciones propuestas en los dos mtodos
anteriormente mencionados, para optimizar los resultados. Por un lado,
disminuyendo la temperatura (5-7C) a la cual se lleva a cabo la corrida y
reduciendo el flujo a 0,3ml/min.

Por otra parte, el mtodo desarrollado no es muy robusto debido a que los
cambios en parmetros de temperatura, pH, metanol e ndice de flujo, provocan
cambios en los tiempos de retencin de los aminocidos. Por esta razn, es
conveniente el seguimiento fiel de los parmetros establecidos como: la preparacin
98
de la fase mvil y de la solucin de derivatizacin y la aplicacin de las condiciones
cromatogrficas establecidas.

Es importante mencionar que la temperatura tiene un efecto sobre el tiempo
de corrida de los cromatogramas, a mayor temperatura menor tiempo. Al mismo
tiempo cabe notar que los neurotransmisores se ven afectados de manera
diferencial, por dichos cambios en la temperatura en cuanto a sus tiempos de
retencin. Aquellos aminocidos que se encuentran cerca de la lnea de frente se
afectan en menor grado por los cambios de temperatura (glutamina glutamato y
taurina), que aqullos que estn ms alejados de la lnea de frente (GABA y
arginina). En este trabajo se estudiaron temperaturas desde los 10 a 26C,
demostrndose que las temperaturas comprendidas entre 17 y 23 C, proporcionan
una mayor confiabilidad en cuanto a la resolucin de los picos y adems, reducen el
tiempo de corrida.

Como se mencion anteriormente, durante el proceso de preparacin de la
fase mvil, fue necesario registrar la temperatura asociada al valor de pH de
resultados cromatogrficos ptimos, con el fin de permitir la reproducibilidad del
mtodo.

En este estudio se demostr que el pH ptimo para una buena separacin de
los picos es de 5,5. Al mismo tiempo, se observ que leves cambios de temperatura
alteran el pH de esa fase mvil. Por esa razn, es que la preparacin de la misma,
debe ser controlada la temperatura de manera exhaustiva, para obtener resultados
ptimos. Por lo tanto, se recomienda una temperatura de preparacin aproximada
de 22,4C. Es importante mencionar tambin que la temperatura no solamente
afecta el pH sino tambin el tiempo de corrida de manera inversa, es decir, a medida
que aumenta la temperatura disminuye el tiempo de corrida. Aunque esto puede ser
ventajoso para el anlisis en corta duracin de los aminocidos, puede tambin
ocasionar el traslape entre ellos y adems un acercamiento a la lnea de frente del
cromatograma.

Por otra parte, para evitar la formacin de precipitados que afectaran el
anlisis cromatogrfico posterior, la solucin de derivatizacin debe prepararse
agregando los reactivos en el siguiente orden 1) OPA, 2) etanol, 3) sulfito de sodio,
y 4) tetraborato de sodio.

99
Otro punto que hay que tomar en cuenta para el buen funcionamiento del
reactivo de derivatizacin, es la refrigeracin. Este reactivo va perdiendo su
actividad con el tiempo, si se mantienen en rangos de temperatura que oscilan entre
los 25 y 30C aproximadamente. El mantener dicho reactivo en refrigeracin permite
que la actividad del mismo se mantenga hasta tres das despues de su preparacin.

Adicionalmente, parece ser indispensable el uso de agua desionizada para la
preparacin de las soluciones de aminocidos. Esto posiblemente, reduce la
formacin de interacciones entre iones y aminocidos, o bien entre iones y el
reactivo de derivatizacin, lo que en consecuencia promueve una lnea base mucho
ms estable y sin interferencias. Es recomendable adems, la limpieza del inyector
con agua desionizada entre cada una de las inyecciones, para evitar la aparicin de
picos fantasma en el cromatograma. Estos picos podran ser el resultado de la
acumulacin de solucin de derivatizacin en el inyector; presencia de iones
electroactivos presentes en el mismo; y/o a la acumulacin de otro tipo de
sustancias oxidables.

En las diferentes fases del experimento (estudios de repetibilidad y
linealidad) es muy importante realizar un procedimiento de limpieza sistemtico,
tambin para viales de polietileno y puntas de micropipetas, para evitar variaciones
significativas en los resultados.

Para mejorar la repetibilidad del estudio, las soluciones que incluyeron los
cinco aminocidos fueron realizadas nicamente en dos pasos: con una primera
dilucin en un baln de 100mL y una dilucin final en otro baln del mismo volumen,
con el fin de alcanzar la concentracin deseada de 0,015g/L, lo que corresponde
a una concentracin cercana a 100M para cada uno de los aminocidos.

Por otra parte, los rangos de concentracin de cada aminocido, utilizados
en las pruebas de linealidad, tomaron en cuenta los valores citados en la literatura
para cerebro de rata: 300-450 M para GABA y 250 M para glutamato y para
glutamina (Kasper, et al; 2003; Lasley, et al; 1985). Para GABA, se obtuvo un alto
coeficiente de correlacin (r
2
= 0,999) dentro de un rango de concentracin (45-
727M) que incluye los valores citados en la literatura. Sin embargo, para glutamato
(14 a 435 M) y glutamina (14-435 M), el rango de concentracin al cual se obtuvo
un coeficiente de correlacin alto (r
2
=0,998) no incluye los valores citados en la
literatura. Por esta razn, es que se sugiere que a la hora de hacer el estudio de los
100
homogeneizados de cerebro, deben realizarse diluciones para que la concentracin
de estos dos aminocidos se encuentre dentro del rango de linealidad establecido
en este protocolo.

Con el fin de determinar si existe una diferencia en la deteccin de
aminocidos individuales o en conjunto, en los estudios de linealidad se utiliz una
concentracin de OPA 86mM. Se observ que para los aminocidos individuales se
da una respuesta que excede, en la mayora de los casos, el rango de deteccin
establecido (10-50nA), (exceptuando para glutamato a 14 y 27M) pero para la
mezcla de aminocidos, todos los picos se encontraban dentro de este rango de
deteccin. Demostrndose de esta manera, un efecto de matriz que debe ser
tomado en cuenta para futuros anlisis. Sin embargo, dicho efecto no pudo ser
cuantificado mediante un estudio de significancia.

Para los estudios de linealidad tambin se realizaron pruebas, a diferentes
intensidades de corriente con el fin de poder detectar en una sola corrida, todos los
picos (fig 32). La intensidad de corriente ptima fue de 10nA durante los primeros
12 minutos en los que se detectan los aminocidos glutamato y glutamina y
posteriormente, fue de 50nA para la deteccin de GABA.

En este trabajo se tom como referencia el trabajo de Rowley ya que muchas
de las condiciones cromatogrficas establecidas en l, se asemejan a las presentes
en el laboratorio del PIN. Por ejemplo, anlisis isocrtico y no en gradiente como en
otros artculos (Zhang et al, 2005; Bianchi et al, 1999), deteccin electroqumica de
los analitos; tipo de columna utilizada y el tipo de derivatizacin precolumna, que no
requiere la automatizacin del sistema (Cazes, et al; 2001; Lingeman, et al; 1990).
Adems, presentaba algunas ventajas como tiempos de corrida cortos (20 minutos);
anlisis de los aminocidos de inters en una sola corrida; y la obtencin de
derivatizados ms estables. A pesar de lo mencionado anteriormente, para
desarrollar el protocolo final de este trabajo, se tuvieron que hacer algunas
modificaciones al propuesto por Rowley, todo esto con el fin de lograr una mejor
resolucin de los picos correspondientes a cada aminocido.

Las modificaciones que se tuvieron que realizar, muy posiblemente se
debieron al hecho de que el protocolo de Rowley fue desarrollado para el anlisis de
aminocidos en microdializados, una matriz con caractersticas diferentes a las de
los homogeneizados de cerebro, utilizados en este trabajo. Por un lado, en los
101
microdializados se obtienen concentraciones menores de los aminocidos y adems
la matriz se encuentra menos contaminada, dado que la sonda de microdilsis
funciona como un filtro para sustancias no deseadas. En los homogeneizados, por el
contrario, debido a que son el resultado del tratamiento del tejido cerebral total (de
zonas especficas), pueden encontrarse otras sustancias, incluso otros aminocidos
que contaminen la muestra y dificulten su anlisis.

En el presente trabajo se cumplieron los objetivos planteados desde el inicio
en cuanto a la implementacin y optimizacin de Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin con deteccin electroqumica (HPLC-EC) para el anlisis de GABA y
glutamato. Esto se logr modificando el protocolo propuesto por Rowley (1995), en
cuanto algunos parmetros tales como la concentracin de metanol y el pH de la
fase mvil; la velocidad de flujo de la bomba de inyeccin; y la concentracin de
OPA en el reactivo de derivatizacin. Adems, se establecieron condiciones ptimas
en cuanto a la temperatura para lograr que las modificaciones establecidas
produjeran resultados repetibles (con una RSD menor al 10%) y lineales (r
2
0,997).

Los alcances de este trabajo, sobrepasaron lo esperado puesto que adems
de los dos neurotransmisores GABA y glutamato se pudo detectar en la misma
corrida y sin interferencias aparentes, el neurotransmisor glutamina.

Este neurotransmisor se ha asociado tambin con los procesos
responsables de la regeneracin y degeneracin del sistema nervioso central
(Aschner et al; 2005). Ya que GABA y glutamato, como se indic en la revisin de
literatura, estn relacionados de alguna manera con desrdenes psicoafectivos
como lo son la depresin y la ansiedad, y que estos a su vez han sido asociados
con procesos degenerativos, el anlisis de la glutamina en las mismas muestras de
tejido, podra aportar informacin suplementaria sobre los mecanismos que
subyacen a los desrdenes supracitados.

102
6. CONCLUSIONES

De acuerdo con los ensayos realizados y las condiciones de experimentacin
empleadas se conluye lo siguiente:

1. El protocolo segn Rowley(1995), para la cuantificacin de GABA, Glutamato y
Glutamina, ya que fue desarrollado para microdializados no cumple con los
requerimientos necesarios para la determinacin y cuantificacin de los
neurotransmisores mencionados en muestras provenientes de homogeneizados de
cerebro.

2. El aumento en la concentracin de metanol produce, de manera general, un
aumento en los tiempos de retencin de los aminocidos.

3. El aumento en los valores de pH, produce de forma general, una disminucin en
los tiempos de retencin de los aminocidos.

4. La temperatura modifica el pH de una fase mvil a razn de 0,01 puntos con el
aumento de 0,1-0,6C.

5. El potencial de corriente ms adecuado para el anlisis de aminocidos es de
10nA para Glutamato y Glutamina y de 50nA para GABA.

6. Las corridas realizadas entre 17-23C resultan adecuadas para la separacin de
los aminocidos en un tiempo corto de corrida (20 minutos).

7. Despus de las modificaciones implementadas, el protocolo resultante de este
trabajo tiene las siguientes caractersticas: fase mvil al 23% de metanol; 0,1M de
fosfato monosdico; 0,5mM de EDTA y pH 5,5 a un flujo de 0,45ml/min; y un
potencial de 850mV. Adems, es esencial el mantenimiento de un rango de
temperatura entre18-23C para asegurar resultados ptimos.

8. El OPA es una sustancia elctricamente activa que produce contaminacin del
cromatograma, por lo tanto hay que controlar la concentracin del reactivo para
evitar este efecto. En este estudio, la concentracin de OPA utilizada fue de 86mM.
Esta debe emplearse a razn de 20L por mL de solucin acuosa de aminocido.

103
9. Bajo refrigeracin (3C), el reactivo de derivatizacin presenta actividad hasta por
tres das.

10. La cantidad de solucin de derivatizacin establecida para el marcaje qumico de
1mL de aminocidos en matriz con una concentracin mxima de 375M para
GABA y 109 M para Glutamato y Glutamina, es de 22L de solucin de
derivatizacin con una concentracin de OPA de 86mM.

11. El mtodo desarrollado en este estudio resulta repetible a concentraciones
aproximadas de 100M y lineal bajo dentro de rangos de concentracin de 47M-
727M para GABA y de 14 -109 M para Glutamato y Glutamina.

12. Las pruebas de linealidad en aminocidos individuales sugieren un efecto de la
matriz (anlsis de todos los aminocidos en conjunto).

13. Los aminocidos Arginina y Taurina, no producen interferencias con los
aminocidos de inters en el protocolo desarrollado.

14. La robustez del mtodo es baja en trminos de variaciones de temperatura, pH,
% de metanol e ndice de flujo.

104
7. RECOMENDACIONES

1. Para asegurar un funcionamiento ptimo del protocolo desarrollado se
recomienda la preparacin de la fase mvil a pH 5,5 ; en un rango aproximado de
temperatura entre los 21,9C y 22,4C.

2. Para evitar la aparicin de picos fantasma en el cromatograma se debe lavar el
inyector entre inyecciones de estndares o de muestras, con 100L de agua
desionizada.

3. Para asegurar el buen funcionamiento de la solucin de derivatizacin es
recomendable la refrigeracin del reactivo, durante el da de trabajo.

4. Para evitar la formacin de precipitados en el reactivo de derivatizacin y
garantizar una concentracin adecuada de OPA, es imprescindible la preparacin
del mismo en el siguiente orden: 1) OPA, 2) etanol, 3) sulfito de sodio, 4) tetraborato
de sodio.

5. Por seguridad, es necesario el uso de guantes, mascarilla y GABAcha durante la
manipulacin de reactivos; y la bsqueda de MSDS (hojas de seguridad), de todos
los reactivos que sern empleados.

6. Para asegurar una temperatura de anlisis adecuada (18-23C), se recomienda
colocar la cmara de enfriamierto media hora antes del ensayo. Para tal efecto,
podran utilizarse tambin refrigeradores para columnas disponibles en el mercado.

7. La filtracin doble de la fase mvil y la desgasificacin por al menos 15 minutos,
es una prctica cromatogrfica que permite lograr resultados ptimos de anlisis.
Adems, se recomienda cubrir los recipientes que contienen los reactivos y la
revisin peridica de los mismos para detectar precipitados u otro tipo de anomalas.

8. De ser necesario, para lograr una mayor separacin entre los picos de
aminocidos, se puede cambiar la fase mvil, manteniendo las mismas
caractersticas establecidas en este protocolo pero con una concentracin de
metanol mayor.

105
9. Puede ser necesario agregar inhibidores de proteasas a los homogeneizados de
cerebro, con el fin de obtener los aminocidos con funcin de neurotransmisor y no
los que son producto de la protelisis del tejido que contaminaran la muestra.

10. Adicionalmente, en caso de obtener concentraciones fuera del rango de
linealidad establecido, se recomienda, la dilucin de la muestra a concentraciones
de 1/10; 1/100; 1/1000; 1/10000, etc; hasta obtener una concentracin cercana al
punto medio de la curva de linealidad.

12. Debido a que los aminocidos pueden quedar adheridos a superficies de vidrio,
afectando su posterior cuantificacin, se hace necesaria la utilizacin de recipientes
de polietileno.

106
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116
9. ANEXOS

Cromatograma logrado tras la optimizacin de las condiciones recomendadas
en este trabajo para el anlisis de muestras de cerebro

La figura 39, muestra el resultado final de la optimizacin del protocolo
creado en este trabajo. El cromatograma es el resultado del anlisis de una muestra
proveniente de corteza temporal.

Figura 39. Cromatograma de una muestra de homogeneizado de corteza temporal (azul).
Fase mvil 23%,pH 5,5; flujo 0,3ml/min, temperatura: 5-7C. De izquierda a derecha, se
muestran los picos marcados de Glu,Gln y GABA.

117

PROTOCOLOS DE LIMPIEZA Y PULIDO DEL ELECTRODO DE TRABAJO

Elaborado por Silvia Benavides V., para el Programa de Neurociencias, UCR.

Problema: La lnea base presenta picos angostos en intervalos de tiempo regulares

Revise lo siguiente:

1) Si la fase mvil ha sido cambiada recientemente, es posible que los picos
que aparecen sean causados por burbujas de aire que vienen con la nueva
fase mvil. Espere al menos dos horas, si el patrn de la lnea base ha
cambiado (aunque no se haya estabilizado todava), espere al menos 3
horas ms hasta que termine de estabilizarse, si el patrn del
comportamiento contina igual realice la limpieza de los electrodos.
2) Si el patrn aparece repentinamente y la fase mvil ha sido cambiada
hace ms de 24 horas, proceda a la limpieza de los electrodos.

Limpieza de los electrodos

Limpieza del electrodo de trabajo (celda)

Debe realizarse regularmente (una vez cada 15 das) sobre todo cuando los buffers
utilizados en las fases mviles contienen muchas sales.
Tambin debe limpiarse:
Cuando la respuesta (altura o rea de los picos) se ve disminuida
comparada con la respuesta obtenida en la misma solucin (solucin patrn,
por ejemplo) en ocasiones anteriores.
Cuando la lnea base se ve muy sucia sin un comportamiento regular
aparente.

Para limpiar la celda superficialmente siga las siguientes instrucciones:
Apague la celda y detenga el flujo.
Baje el tornillo que sostiene la celda muy lentamente, mientras sostiene a la
vez la celda para evitar que esta se desprenda abruptamente.
Desprenda con cuidado el electrodo y el empaque que lo adhiere al
detector. (NUNCA TOQUE DIRECTAMENTE EL ELECTRODO, ya que este
puede rayarse y entorpecer con eso la deteccin). Lave con agua destilada
el electrodo, utilizando para ello la pizeta (aplique el flujo de agua directo por
118
2 minutos). Posteriormente seque la celda con papel para lentes. Nunca
frote el papel sobre la celda y evite siempre el contacto con el electrodo,
solamente coloque el papel en la superficie y permita que el agua sea
absorbida por capilaridad.
Lave tambin el empaque con agua. Cmbielo si ha notado fugas o si el
material est muy desgastado. Antes de colocarlo squelo tambin
utilizando papel para lentes.
Antes de colocarlo asegrese que la direccin de los agujeros que tiene el
empaque coincidan con el electrodo en la celda.
Limpie los restos de lquido que tendr el detector y a continuacin coloque
el empaque y la celda. Presione ambos con el tornillo, la presin no debe
ser excesiva, procure de vuelta adicional, despus de que ha sentido la
presin en el tornillo.

Si la celda requiere una limpieza ms profunda, siga las siguientes instrucciones:
Apague la celda y detenga el flujo.
Baje el tornillo que sostiene la celda muy lentamente, mientras sostiene a la
vez la celda para evitar que esta se desprenda abruptamente.
Desprenda con cuidado el electrodo y el empaque que lo adhiere al
detector. (NUNCA TOQUE DIRECTAMENTE EL ELECTRODO, ya que este
puede rayarse y entorpecer con eso la deteccin).
Introduzca la celda en un beaker con metanol y colquela en el bao
ultrasnico durante 5 minutos. A continuacin introduzca la celda en agua
destilada filtrada y colquela nuevamente en el bao ultrasnico durante 5
minutos.
Seque la celda con papel para lentes. Nunca frote el papel sobre la celda y
evite siempre el contacto con el electrodo, solamente coloque el papel en la
superficie y permita que el agua sea absorbida por capilaridad.
Limpie los restos de lquido que tendr el detector y a continuacin coloque
el empaque y la celda en el lugar respectivo. Presione ambos con el tornillo
(la presin no debe ser excesiva, procure de vuelta adicional despus de
que ha sentido la presin en el tornillo).

Pulido del electrodo de trabajo

Si a pesar de realizar la limpieza del electrodo de trabajo la deteccin no mejora,
utilice el kit de pulido del electrodo de la siguiente manera:
119
Retire la franela que est en el vidrio y reemplcela por una nueva.
Use la franela oscura (microcloth) para pulir el electrodo con micropolish
alumina 0.05M, o en su defecto utilice la franela clara (texmet) si el pulido se
realizar con 1 micron o pulido de diamante (jeringa con pasta celeste).
Micropolish almina se usa para un pulido superficial, se aplica una gota de
la pasta sobre la franela adherida al vidrio

Cromatograma logrado tras la optimizacin de las condiciones recomendadas
en este trabajo para el anlisis de muestras de cerebro
Gua de calibracin del electrodo
Hojas para el registro de datos
Protocolo de referencia
Hojas de calibraciones por PROCAME

Implementacion de Un Protocolo Por HPLC para La Cuantificacion de Acido Gamma Aminobutirico y Glutamato en Cerebro de Rata

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