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A
A






SEGUNDO CURSO



GUIN DE PRCTICAS




Curso 2007-2008


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I IN ND DI IC CE E


Normativa de las prcticas de Microbiologa ............................................................................................................. Pag. 3
Normas y reglas en el laboratorio de Microbiologa .................................................................................................. Pag. 4
Material de laboratorio ............................................................................................................................................... Pag. 5
Objetivo de las prcticas de Microbiologa ................................................................................................................ Pag. 6
Esquema de trabajo .................................................................................................................................................... Pag. 7
Toma de muestra ........................................................................................................................................................ Pag. 8
Preparacin de medios de cultivo ............................................................................................................................... Pag. 9
Mtodos de siembra .................................................................................................................................................. Pag. 10
Mtodos de incubacin ............................................................................................................................................. Pag. 15
Observaciones macroscpicas ................................................................................................................................... Pag. 15
Observaciones microscpicas ................................................................................................................................... Pag. 17
Morfologa de las bacterias ....................................................................................................................................... Pag. 21
Identificacin bacteriana ........................................................................................................................................... Pag. 22
Tiras Multisustrato .................................................................................................................................................... Pag. 30
Antibiograma ............................................................................................................................................................ Pag. 31
Prctica de Virologa ................................................................................................................................................. Pag. 36
Prctica de Micologa ................................................................................................................................................ Pag. 41
Anlisis de alimentos ................................................................................................................................................ Pag. 56
Medios de cultivo ...................................................................................................................................................... Pag. 59
Pruebas bioqumicas ................................................................................................................................................. Pag. 62
Supuesto prctico ...................................................................................................................................................... Pag. 72



3

N NO OR RM MA AT TI IV VA A D DE E L LA AS S P PR R C CT TI IC CA AS S D DE E M MI IC CR RO OB BI IO OL LO OG GI IA A

- Las prcticas de Microbiologa e Inmunologa son obligatorias para todos los alum-
nos matriculados en la asignatura y deben ser superadas para poder acceder al examen final de
la misma.

- Se exceptan de esta norma aquellos alumnos que las hayan superado en el curso an-
terior en esta Facultad. Los alumnos que hayan cursado prcticas de Microbiologa en otras
Universidades debern presentar un certificado acreditativo que ser evaluado por el Depar-
tamento para juzgar si procede o no a su convalidacin.

- Los alumnos sern convocados mediante listas que se expondrn con la debida ante-
lacin en el tabln de anuncios del Departamento (Pabelln de Sanidad Animal) y debern
venir provistos de bata de laboratorio y guin de prcticas, as como de dos artculos de
divulgacin, extrados de la prensa diaria reciente (peridicos o revistas que se puedan com-
prar en kioscos, y que no sean especficamente cientficos; tambin puede ser de Internet del
mismo tipo de publicaciones on-line).

- Las practicas transcurren a lo largo de dos semanas consecutivas. De martes a vier-
nes, en las que se realizarn las enseanzas prcticas de correspondientes a la asignatura de
Microbiologa.

- Los horarios sern de maana para los alumnos que cursan estudios por la tarde y de
tarde para los que cursan estudios por la maana. La duracin de cada una de las sesiones
prcticas es variable, estimndose en unas 3 h.

- Es obligatoria la asistencia a todas las sesiones prcticas que integran cada grupo.
Las faltas debern ser debidamente justificadas y la ausencia en ms de una sesin supondr
el paso directo al examen final de prcticas.

- Una parte importante de las prcticas corresponder a la realizacin de una identifi-
cacin bacteriana de una muestra problema. Al finalizar la misma, el alumno deber entregar
al profesor de prcticas un informe sobre el proceso seguido, en el que se incluya la biblio-
grafa consultada, y otros datos que considere de inters.

- La calificacin del alumno en lo que respecta a las prcticas de esta asignatura se ba-
sar en tres criterios: actitud del alumno a lo largo de las prcticas, conocimientos adquiridos,
e informe presentado.

- Los alumnos que no superen la evaluacin prctica podrn presentarse al examen fi-
nal de prcticas que tendr lugar antes del examen final terico de la asignatura.

- Tendrn derecho al examen final de prcticas todos los alumnos de la asignatura que
por cualquier causa no las hayan superado con anterioridad.

- Excepcionalmente podrn repetir las prcticas voluntariamente aquellos alumnos que
no habiendo superado la prueba correspondiente a su grupo, as lo soliciten y sean informados
favorablemente por el Profesor responsable de su grupo.

- Los cambios de grupos de prcticas slo se admiten en las siguientes circunstancias:



4

* Por razn de incompatibilidad con el horario laboral debidamente justificada y siem-
pre que se haga constar con claridad en la ficha de la asignatura.
* Por acuerdo con otra persona que deba tambin realizarlas pero en un turno diferente,
hacindolo constar igualmente muy claramente al rellenar la correspondiente ficha por
parte de ambas personas.
* Por razones de enfermedad debidamente justificadas.



N NO OR RM MA AS S Y Y R RE EG GL LA AS S E EN N E EL L L LA AB BO OR RA AT TO OR RI IO O
D DE E M MI IC CR RO OB BI IO OL LO OG GI IA A

Por escaso que sea el nivel de conocimientos que se posea de esta asignatura, cual-
quiera puede imaginarse fcilmente que en el trabajo cotidiano en un laboratorio de Microbio-
loga, uno de los problemas que hay que cuidar es el de las contaminaciones con microorga-
nismos no deseables, ya que su presencia en un cultivo es origen, en el mejor de los casos, de
errores en las pautas de identificacin, cuando no atentan contra la seguridad del microbilo-
go y de su entorno. Por este motivo, se deben respetar y cumplir unas reglas esenciales:

A - Evitar la contaminacin del material a estudiar.
B - Evitar la contaminacin por el material a estudiar.

Las normas bsicas de actuacin se concretan en:

1.- Del microbilogo:

1.1 La prenda adecuada para trabajar en un laboratorio de Microbiologa es la bata
blanca, que debe estar siempre limpia y usarse slo en el interior de los laboratorios.
1.2 Normas generales de higiene:
* Limpieza de manos antes y despus del trabajo.
* Si la longitud de los cabellos es notable, stos debern estar recogidos.
1.3 Normas generales de comportamiento:
* El material, mobiliario y dems utensilios deben cuidarse con el mayor es-
mero.
* No se puede fumar, beber o comer en el laboratorio bajo ningn concepto.
* Hay que evitar desplazamientos intiles y movimientos bruscos.

2.- Del lugar de trabajo:

2.1 Cada alumno dispone de un puesto de trabajo en el que podr encontrar:
* Un papel de filtro que cubre el lugar de trabajo.
* Un mechero de gas emplazado en el centro. El mechero debe permanecer en-
cendido durante la realizacin de los experimentos que requieran su utiliza-
cin, apagndose cuando no sea necesario.
* Los instrumentos y elementos especficos para la realizacin de cada prctica
concreta.

3.- Del trabajo:

3.1 No se debe comenzar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones precisas.
3.2 Se deben preguntar siempre todas las dudas que aparezcan antes de realizar el traba-
jo.


5

3.3 La mayor parte de los instrumentos que se utilizan deben ser y permanecer estriles,
por lo cual se manejan siempre en una zona aproximada de unos 15 cm alrededor
de la llama del mechero encendido.
3.4 La esterilizacin de algunos utensilios (asas de platino, boca de los tubos, etc) se
consigue mantenindolos en posicin oblicua sobre la llama. Estas operaciones se
realizan siempre antes y despus de utilizar tales instrumentos.
3.5 No se debe dejar nunca el tubo o la placa abiertos ms tiempo del estrictamente ne-
cesario, para evitar una posible contaminacin del cultivo. Tampoco se debe depo-
sitar el tapn del tubo con el que estamos trabajando sobre la mesa, debindose
mantener siempre en la mano hasta el momento de tapar el tubo.
3.6 La organizacin del trabajo vara segn la prctica que se est realizando, pero en
general:
* Deben evitarse las precipitaciones.
* Deben evitarse riesgos de confusin etiquetando o marcando el material.
* Deben evitarse riesgos de contaminacin (evitar contacto de la boca con las
manos, evitar chupar objetos del laboratorio, etc.).
* Deben tomarse todas las precauciones posibles para evitar accidentes (corta-
duras, quemaduras, etc.).
3.7 Despus del trabajo, tambin debe seguirse un plan ordenado.
* El material utilizado debe transportarse al lugar donde contine su procesa-
miento.
* El material y utensilios utilizados deben ser lavados y esterilizados para su
posterior uso o bien eliminarse previa esterilizacin si son de un solo uso.
* El puesto de trabajo debe quedar al final ordenado y limpio, tal como se en-
contr al inicio de la sesin.


M MA AT TE ER RI IA AL L D DE E L LA AB BO OR RA AT TO OR RI IO O

El material utilizado en un laboratorio de Microbiologa es muy variado y depende
fundamentalmente de las lneas de trabajo a las que est dedicado; evidentemente, no se preci-
sa el mismo equipamiento en un centro de investigacin con un alto grado de especializacin
que en un laboratorio de Bacteriologa Clnica.
Por tanto, aqu slo nos referiremos al material bsico que se suele encontrar en un laboratorio
mnimamente dotado.

A) Material de uso corriente:

* Material de vidrio o plstico que se usa para contener o medir: aqu se incluyen tubos de
ensayo, vasos de precipitado, matraces, embudos, probetas, pipetas, dosificadores, etc.,
todo ello de distintos tamaos y capacidades. Tambin incluimos las placas de Petri, los
portaobjetos y cubreobjetos, cmaras de recuento, cestillos y cubetas para efectuar tin-
ciones, jarras para incubar en anaerobiosis, etc.

* Material de siembra: constituido principalmente por asas y filamentos de platino, asas de
Drigalski y pipetas estriles.

* Material para toma de muestras e inoculaciones: escobillones estriles, tubos y frascos
estriles, jeringas y agujas, trcares, cnulas, catteres y material de diseccin.

B) Aparatos productores de calor:



6

Se utilizan con diversas finalidades:

* Para esterilizacin: autoclave (calor hmedo), horno Pasteur (calor seco) y mechero Bun-
sen (esterilizacin por calentamiento directo).
* Para incubacin: estufas, baos de agua, de aceite o parafina y de arena.


C) Aparatos productores de fro:

* Refrigeradores: son indispensables para conservar los medios de cultivo, productos bio-
lgicos y patolgicos, as como mantener la supervivencia de algunos mo. Su tempera-
tura oscila alrededor de los 4C.
* Congeladores: alcanzan temperaturas entre -20 y -70 C y son indispensables para con-
servar determinados productos biolgicos (sueros, clulas, mo).
* Neveras porttiles: para trasladar muestras al laboratorio en condiciones de refrigeracin.


D) Material ptico:

Es de capital importancia en el laboratorio ya que permite la observacin de los mo..
* Microscopios: en su distintas versiones (campo claro, campo oscuro, contraste de fases,
fluorescencia).
* Lupa estereoscpica: permite observar colonias bajo distintas condiciones de ilumina-
cin.


E) Otro tipo de material y aparatos:

* Agitadores y homogeneizadores.
* Centrfugas.
* Balanzas.
* Liofilizadores.
* pHmetros.
* Espectrofotmetros.
* Destiladores, etc.


O OB BJ JE ET TI IV VO O D DE E L LA AS S P PR RA AC CT TI IC CA AS S D DE E M MI IC CR RO OB BI IO OL LO OG GI IA A

Las clases prcticas de Microbiologa tienen como objetivos bsicos los siguientes:

- Familiarizar al alumno con las normas generales de trabajo en el laboratorio.
- Iniciarle en el uso de los elementos y medios propios de la asignatura.
- Ensearle las tcnicas bsicas empleadas para el estudio de microorganismos.

Aislamiento e identificacin bacteriana.
Preparacin e interpretacin de antibiogramas.
Anlisis de microorganismos en alimentos.
Recuento de bacterias
Estudio e identificacin de hongos.
Observacin de la patogenicidad celular de virus.


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E ES SQ QU UE EM MA A D DE E T TR RA AB BA AJ JO O

A) BACTERIOLOGA

1) Anlisis clnico.

- Recogida de muestras:
* Condiciones de esterilidad
* Emisin de informe
* Envo rpido al laboratorio

- Anlisis
- Aislamiento:
* Medios de cultivo slido
* Siembra por agotamiento
* Incubacin:
* 37C
* 24/48 h
* Aerobiosis/anaerobiosis
- Identificacin:
* Anlisis macroscpico de colonias
* Anlisis microscpico:
- Formas y dimensiones
- Tincin de Gram
- Estructuras especiales
* Pruebas bioqumicas
* Pruebas serolgicas
* Identificacin por comparacin de datos
* Identificacin por tiras multisustrato

2) Antibiograma

* Preparacin
* Interpretacin

3) Anlisis de microorganismos en alimentos


B) MICOLOGIA

* Obtencin de cultivos puros
* Pautas de identificacin


D) VIROLOGA

* Efecto citoptico.


8

T TO OM MA A D DE E M MU UE ES ST TR RA A

Bajo la denominacin de muestra se incluye cualquier elemento orgnico, natural o
patolgico, procedente del animal vivo, del cadver, o de su entorno, que sea susceptible de
contener microorganismos. Son muestras por tanto, lquidos fisiolgicos (sangre, orina, sali-
va, heces), lquidos patolgicos (exudados, pus, esputos, vmitos) y slidos como biopsias o
piezas procedentes del cadver; tambin son muestras los alimentos, camas y el propio am-
biente en el que se encuentran situados los animales.

Recogida de muestras:

Las muestras deben ser recogidas con la mxima asepsia con el fin de no introducir en
ellas microorganismos ajenos al proceso. Esta asepsia se refiere:
* Al proceso y condiciones de la toma de muestras, que debe
evitar las contaminaciones.
* A los utensilios empleados, que deben estar estriles.
* A los recipientes destinados a la recogida y envo al laborato-
rio, que igualmente deben estar estriles.

Una vez recogidas, las muestras se deben enviar al laboratorio con la mayor rapidez
posible.

Toda muestra debe ir acompaada de un informe en el cual, de forma ordenada y
pormenorizada, se expondrn todos aquellos datos que tengan relacin con la misma y que
puedan ser tiles para orientar al laboratorio en su labor analtica. Estos datos suelen ser de ti-
po clnico (sintomatologa, lesiones, tratamientos efectuados) y epidemiolgicos (n de anima-
les afectados, n de bajas, edad, sexo, tipo de alimentacin, sistema de explotacin, vacuna-
ciones, enfermedades ms frecuentes en la zona, etc.).

En el momento de su recepcin en el laboratorio, toda muestra debe ser conveniente-
mente identificada a travs de un nmero de orden y de su inclusin en el libro de anlisis.




9

P PR RE EP PA AR RA AC CI IO ON N D DE E M ME ED DI IO OS S D DE E C CU UL LT TI IV VO O

1. Tipos de medios:
a) Por su objetivo:
- Aislamiento
- Enriquecimiento
- Identificacin
- Conservacin
- Recuento

b) Por su especificidad para los microorganismos:
- Comunes
- Selectivos

c) Por su composicin:
- Naturales o empricos
- Sintticos
- Semisintticos

d) Por su estado fsico:
- Slidos: por el empleo de agentes solidificantes.
* Agar:1,5-2 % medios slidos
0,2 % medios semislidos
* Gelatina.
- Lquidos

e) Por su forma de almacenamiento y empleo:
- En placa
- En tubo:* lquido
* slido vertical
* slido en pico de flauta

2. Material necesario:
- Preparacin: balanza, matraz, vaso de precipitados, esptula, probetas, tubos, tapones.
- Esterilizacin: autoclave/filtracin.

3. Mtodo de preparacin:
- Pesar las cantidades fijadas para cada medio de cultivo.
- Hidratar con agua destilada hasta el volumen preciso.
- Ajustar el valor del pH.
- Homogeneizar por calentamiento para una buena solubilizacin de los componentes.
- Esterilizacin.
* Por autoclave: material que no se altere por
** Caramelizacin: ciertos azcares.
** Precipitacin: ciertos minerales.
** Desnaturalizacin: ciertas protenas.
* Por tyndalizacin: material que se altere a temperaturas de autoclave.
* Vapor fluente.
* Filtracin: ** Filtros adaptables a jeringuillas.
** Sistemas de filtros Millipore.

4. Medios incompletos:
Son aqullos a los que hay que aadir algn otro componente tras la esterilizacin (normal-
mente es un componente sensible al calor); p.e., yema de huevo, sangre, etc..


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M ME ET TO OD DO OS S D DE E S SI IE EM MB BR RA A

El primer paso a seguir en la identificacin de un microorganismo es proceder a su ob-
tencin en cultivo puro, pues es obvio que las reacciones de cultivos mixtos no podrn ser
usadas en la identificacin.

El mtodo ms comn de obtencin de un cultivo puro consiste en tomar una sola co-
lonia del medio de aislamiento y proceder a su siembra por agotamiento.

Pauta general:

1. Coger el asa de platino como se indica en la figura 1.
2. Flamear el asa de platino hasta que tome color rojo. Flamear tambin el resto del vstago
(figura 2).
3. Toma de muestra
3.I Si se parte de una muestra lquida (o cultivo lquido):
3.I.a. Agitar el tubo (figura 3).
3.I.b. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4).
3.I.c. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5).
3.I.d. Introducir el asa en el tubo de forma que el extremo quede justo por de-
bajo de la superficie (figura 6).
3.I.e. Esperar a que deje de burbujear y extraer el asa. La pelcula formada es-
tar cargada de microorganismos.
3.I.f. Volver a flamear el tubo.
3.I.g. Poner el tapn.
3.II. Si se parte de un cultivo slido:
3.II.a. Enfriar el extremo del asa en una zona del medio de cultivo donde no
haya crecimiento.
3.II.b. Tomar una colonia bien aislada.
4. Siembra en el medio de cultivo.
4.I. Siembra en medio lquido:
4.I.a. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4).
4.I.b. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5).
4.I.c. Introducir el extremo del asa, previamente cargada en el tubo con medio
lquido y se agita con energa para desprender los microorganismos.
4.I.d. Volver a flamear el tubo.
4.I.e. Poner el tapn.
4.II. Siembra en medio slido:
4.II.a. Tomar una placa de medio slido no utilizada y por tanto estril.
4.II.b. Colocarla sobre la mesa de trabajo de forma invertida de tal forma que
se encuentre el medio de cultivo en la parte superior. De esta forma se
puede destapar la placa con una sola mano.
4.II.c. Una vez destapada, se apoya el extremo del asa cargada con microorga-
nismos sobre la superficie y se efecta la siembra.
5. Flamear el asa hasta que se ponga incandescente.
6. Rotular las placas o los tubos de forma que se puedan identificar.

- Tipos de siembras:

a) Siembra por agotamiento: La finalidad de esta siembra es obtener colonias aisla-
das del microorganismo o microorganismos sobre el medio de cultivo slido. Consiste en


11

desplazar el asa de platino sobre la superficie del medio slido siguiendo cualquiera de los si-
guientes procedimientos:

* En zig-zag: consiste en desplazar el asa por el medio haciendo un movimiento
en forma de zeta desde un borde de la placa hacia el opuesto. Cuando se llega
al centro de la placa, se levanta el asa y se repite el movimiento empezando por
el otro extremo de la misma (figura 7). Este tipo de siembra tambin se puede
hacer en tubo con medio slido en pico de flauta.

* En estras: con el asa cargada se trazan dos o tres lineas tangenciales en un
borde de la placa; se flamea el asa, se enfra en una zona no sembrada y de
nuevo se trazan dos o tres estras que crucen a las anteriores; este procedimien-
to se repite hasta que se completa la superficie de la placa (Figura 7).

b) Siembra en masa: primero se aade un volumen conocido de suspensin de mi-
croorganismos en una placa estril; despus se aaden 10-15 ml de medio de cultivo fundido
a 45C, se mezcla el contenido de la placa con movimientos circulares y se deja solidificar.

c) Siembra en superficie: sobre una placa con medio solidificado se deposita una
cantidad medida de suspensin de microorganismos y se extiende de forma uniforme con un
asa de Drigalski (figura 8).

d) Siembra por picadura: se utiliza el filamento de platino que se introduce de forma
vertical en un tubo con medio slido (figura 9).

e) Siembra por inundacin: sobre una placa con medio solidificado se vierte una
suspensin densa de microorganismos de forma que "se inunde" toda la placa. Se espera unos
15 minutos para que se adsorban los microorganismos y se elimina el lquido restante guar-
dando condiciones de esterilidad.


12

TCNICAS DE AISLAMIENTO: TOMA DE MUESTRAS





13

Figura 7.- Tcnicas de aislamiento: agotamiento de asa en placa








1. Estras
2. Flameado
Enfriar
3. Estras
4. Flameado
Enfriar
5. Estras
6. Flameado
Enfriar
7. Estras
B.- OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS TRAS LA INCUBACIN
A.- PASOS SUCESIVOS DEL AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA
Obtencin de colonias aisladas


OTROS SISTEMAS DIFERENTES DE AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA


14







15

M ME ET TO OD DO OS S D DE E I IN NC CU UB BA AC CI IO ON N

1. Temperatura:
* Bacterias patgenas: 37C; excepcionalmente otras T
as
.
* Hongos: ver prctica correspondiente.

2. Atmsfera de incubacin:
* Aerobiosis: trasladar las placas a la estufa e incubarlas de forma invertida (tapa aba-
jo; medio inoculado arriba). Los tubos se incuban siempre en posicin vertical.
* Microaerofilia:
** Mtodo de la vela: en la jarra se introduce una vela encendida que va con-
sumiendo el oxgeno acumulado tras cerrar la jarra.
** Estufa de CO
2
: permite regular la cantidad de CO
2
en la atmsfera de incu-
bacin.
* Anaerobiosis (Mtodo de GasPak): en una jarra de anaerobiosis junto a las placas o
tubos se introduce un preparado comercial que produce H
2
, el cual se combina con el
O
2
y produce agua.


O OB BS SE ER RV VA AC CI IO ON NE ES S M MA AC CR RO OS SC CO OP PI IC CA AS S

A) Crecimiento en medio slido: las clulas microbianas se reproducen habitualmente con tal
rapidez que en 18 - 24 horas dan lugar a la aparicin de masas visibles de clulas sobre me-
dios slidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que est formada por un
nico tipo de microorganismo.

Las colonias tienen una morfologa caracterstica que se estudia a simple vista o con la
ayuda de una lupa. Los caracteres ms importantes de las colonias y cuyo estudio tiene inters
en la caracterizacin son los siguientes:






16

1. Forma: Puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada

2. Tamao: Se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm.

3. Elevacin: Vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve), convexa,
pulvinada (ms elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbili-
cada (con una depresin central).

4. Forma del borde: Puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso,
y rizado.

5. Superficie:
* Lisa
* Rugosa
* Mate
* Brillante
* Transparente
* Opaca

6. Color:
Presencia de colores caractersticos y difusin de pigmentos en el medio.

7. Capacidad de emulsin en agua:
* Forma una suspensin uniforme
* Forma una suspensin grumosa
* No se emulsiona


B) Crecimiento en medio lquido: tiene inters los siguientes aspectos:
1. Cantidad de crecimiento:
* Ninguna
* Escasa
* Moderada
* Abundante.

2. Crecimiento en la superficie:
* Positivo
* Negativo
* Formacin de un anillo
* Pelcula superficial que se desintegra o no al agitar

3. Turbidez:
* Uniforme
* Floculante
* Negativa

4. Depsito en el fondo del tubo:
* Ausente
* Granular
* Floculante
* Viscoso
* Se desintegra o no al agitar


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O OB BS SE ER RV VA AC CI IO ON NE ES S M MI IC CR RO OS SC CO OP PI IC CA AS S

El ndice de refraccin de las bacterias es similar al medio que las rodea y por tanto
son difciles de ver al microscopio. En cambio son qumicamente muy diferentes; estas dife-
rencias son las que permiten distinguir las bacterias por medio de TINCIONES. Las tinciones
son de dos tipos:

a) Tinciones simples: Son aqullas que utilizan un solo colorante. Muestran la forma,
el tamao y la ordenacin de las bacterias.

b) Tinciones diferenciales: Son aqullas que utilizan dos o ms reactivos. Con ellas
se pueden observar diferencias entre clulas o partes de clulas. Las ms importantes son:
1. Tincin de Gram.
2. Tincin de microorganismos cido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen).
3. Tincin de estructuras.
- Tincin de esporos.
- Tincin de flagelos.
- Tincin de cpsulas.
Los principales pasos para realizar una tincin para su posterior examen microscpico
son:

1. Extensin:
* A partir de un caldo de cultivo. Con un asa de platino se coloca una gota de caldo en el
portaobjetos y se extiende con movimientos circulares (figura 10).
* A partir de una colonia en medio slido. Con el asa de platino se toma una gota de agua
que se deposita en el portaobjetos; despus se toma una colonia, se mezcla y se extiende
como antes (figura 11).

2. Secar: dejando la preparacin al aire hasta la evaporacin

3. Fijacin:
Tiene como objeto fijar los microorganismos al portaobjetos por la llama hasta que se
seque, sin calentar demasiado (figura 12). El calor excesivo alterara la forma normal y la es-
tructura de los microorganismos que se van a teir. El portaobjetos debe notarse caliente, pero
no debe quemar cuando se coloca sobre el dorso de la mano.

4. Tincin: En funcin del objetivo existen distintos procedimientos de tincin.



Tincin de Gram

Cuando se emplea este mtodo de tincin, debido a diferencias en la pared celular, las
bacterias se dividen por lo general en dos grandes grupos, segn retengan o no el colorante
primario ("GRAMPOSITIVAS" o "GRAMNEGATIVAS" respectivamente) tras sufrir la ac-
cin de un decolorante.
En esta tcnica se emplean cuatro reactivos diferentes:

METODO: * Un colorante primario (violeta de genciana) durante tres minutos.
* Lavar con agua.
* Un mordiente (lugol) durante dos minutos.


18

* Lavar con agua.
* Un agente decolorante (alcohol-acetona) durante diez segundos.
* Lavar con agua.
* Un colorante de contraste (safranina) durante treinta segundos.
* Lavar con agua y secar sobre un papel de filtro.
(figuras 13, 14 y 15)
Las clulas que retienen el colorante primario se denominan "GRAMPOSITIVAS"
(color violeta) y las que se decoloran con el alcohol-acetona y se tien posteriormente con la
safranina reciben el nombre de "GRAMNEGATIVAS" (color rojizo).

* Observar al microscopio con el objetivo de inmersin (punto 4).



Tincin de esporos

Las bacterias de algunos gneros forman endosporos que son estructuras muy resisten-
tes a las altas temperaturas, a la falta de humedad y a la accin de productos qumicos. Los
endosporos son tambin resistentes a la penetracin de colorantes utilizados en Bacteriologa
y por tanto en una extensin teida segn el mtodo de Gram se pueden distinguir como zo-
nas incoloras en el interior de las formas vegetativas de las bacterias Gram positivas. Sin em-
bargo, una vez teidas su decoloracin suele ser difcil.

METODO (Bartolomew y Mittwer)
* Se prepara una extensin en la forma habitual y se fija intensamente al calor para lo
cual se pasa unas veinte veces por la llama.
* Se cubre la extensin durante 10 minutos con solucin acuosa saturada de verde ma-
laquita, calentando hasta la emisin de vapores.
* Se lava con agua y se aade safranina durante 30 segundos, se lava con agua y se seca
con papel de filtro.
* Observar al microscopio con el objetivo de inmersin

Segn este mtodo de tincin, los endosporos se tien en verde, pero el resto de la clula (o la
clula que no posee endosporos) se tie de rojo dbil.



Tincin de cpsulas

Los mtodos ordinarios de tincin no colorean la cpsula, aunque a veces se puede ob-
servar una zona clara rodeando al organismo teido. Para demostrar la presencia de cpsulas
se emplea generalmente la tincin negativa con tinta china o nigrosina.

METODO
* Depositar una gota de tinta china o nigrosina sobre un portaobjetos.
* Mezclar con ella una colonia procedente de un medio slido, con ayuda del asa de pla-
tino.
* Cubrir con un cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas de aire. Presionar con
fuerza entre papel de filtro para eliminar los restos de tinta china que puedan enturbiar
la observacin.
* Examinar al microscopio con el objetivo de inmersin


19

Las bacterias con cpsula aparecen rodeadas de una zona clara destacando del fondo gris os-
curo. Las bacterias no capsuladas no presentan esta zona clara.


5. Observacin al microscopio con el objetivo de inmersin

METODO

* Depositar en la preparacin una pequea gota de aceite de inmersin. De esta forma
se reduce la refraccin de los rayos de luz al pasar del portaobjetos al aire, consiguin-
dose que un mayor nmero de ellos penetren en el objetivo (figura 16).
* Colocar el portaobjetos en la platina.
* Elevar el condensador del microscopio al nivel de la platina para lograr el mximo de
luz.
* Bajar el objetivo de inmersin hasta que contacte con la gota de aceite y enfocar hasta
observar la morfologa del microorganismo.


20


Rayos no refractados
Aceite de inmersin Rayos de luz refractados
Aire Preparacin


21

M MO OR RF FO OL LO OG GI IA A D DE E L LA AS S B BA AC CT TE ER RI IA AS S

Las bacterias presentan una amplia diversidad de tamaos y de forma muy general
pueden aparecer bajo la luz del microscopio ptico o electrnico con morfologa esfrica (co-
cos), alargada (bacilos), y espiral (espiroquetas).
Los cocos libres aparecen como clulas esfricas aisladas, en pares como DIPLOCO-
COS, en cadenas como ESTREPTOCOCOS, o dependiendo de los planos de divisin, en te-
tradas o en grupos arracimados.
Los bacilos pueden variar considerablemente en longitud desde los que son muy cor-
tos, a veces denominados COCOBACILOS, hasta los bacilos largos que varan en longitud de
dos a diez veces su dimetro. Los extremos de los bacilos pueden ser suavemente redondea-
dos, o cuadrados. Las largas hileras aisladas se conocen como FILAMENTOS. Los bacilos
bacterianos fusiformes, que aparecen en la cavidad bucal e intestinal, son aguzados en ambos
extremos.
Los bastones curvos, o ESPIRILOS, varan desde microorganismos pequeos, en for-
ma de coma, o levemente helicoidales con una sola curvatura, o en forma de espiroquetas ms
largas y sinuosas.

FIGURA 17: MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS
a-e: cocos a: cocos arracimados
b-c: diplococos
d: cocos en cadena
e: cocos en ttradas
f: cocobacilos
g-i: bacilos g: bacilos aislados
h: bacilos en cadenas
i: bacilos aislados, en empalizada y formando ngulos
j-k: espirilos






22

I ID DE EN NT TI IF FI IC CA AC CI IO ON N B BA AC CT TE ER RI IA AN NA A

Los procedimientos para llevar a cabo la identificacin bacteriana van desde los sim-
plemente descriptivos (morfologa y tincin), pasando por las pruebas bioqumicas simples
para deteccin de productos metablicos o de una determinada reaccin enzimtica, llegando
hasta tcnicas muy sofisticadas como puede ser el clculo del porcentaje G+C en bacterias o
el empleo de sondas de ADN.

Un proceso exhaustivo de identificacin bacteriana incluira los siguientes pasos:
1 Caractersticas macroscpicas.
2 Caractersticas microscpicas.
3 Condiciones de crecimiento.
4 Propiedades bioqumicas.
5 Susceptibilidad a los antibiticos.
6 Estructura antignica (serotipia) y fagotipia.
7 Composicin qumica.
8 Produccin de bacteriocinas.
9 Patogenicidad.
10 Composicin del ADN.

Las pruebas bioqumicas nos indican una serie de caractersticas metablicas que, en
conjunto, nos permitirn diferenciar unas bacterias de otras). Existe un gran nmero de estas
pruebas, por lo que en un problema concreto nos decantaremos por la realizacin de una u
otra prueba bioqumica basndonos en:
* Origen de la cepa: de dnde la hemos aislado.
* Condiciones bajo las que ha sido aislada.
* Morfologa.
* Tincin, especialmente la de Gram.
* Posibilidad de formacin de esporos.
* Posibilidad de formacin de cpsula.

Segn los resultados obtenidos de la observacin de estos parmetros, una vez consul-
tada la bibliografa sobre taxonoma bacteriana, el amplio espectro bacteriano, va a quedar
restringido a unos pocos gneros, por lo que el siguiente paso ser realizar las pruebas bio-
qumicas que nos ayuden a quedarnos con uno solo de ellos, y posteriormente llegar a la de-
terminacin de especie.

Es muy importante comprender que estas pruebas no han sido elegidas al azar, sino
siguiendo una pauta detallada con objeto de escoger aquellas que nos van a llevar a la
identificacin de especie lo ms rpidamente posible.

Son muchas las pruebas bioqumicas descritas, y es evidente que en cada caso intenta-
remos realizar las menos posibles, siempre y cuando stas nos lleven a una completa y segura
identificacin.

En la realizacin de pruebas bioqumicas hay que tener en cuenta que no todos los
miembros de una determinada especie bacteriana reaccionarn de la misma manera: Se pro-
ducen variaciones, y esto habr que recordarlo cuando se interpreten los cuadros para identifi-
cacin de bacterias. Al comparar los resultados obtenidos con un grupo tabulado de resultados
patrn, se debe utilizar el criterio de "aproximacin mxima": si un microorganismo se desva
de lo normal en uno o dos resultados de una batera de pruebas segn la tabla patrn, ello no
supone que necesariamente haya que descartarlo de esa especie.


23


Los resultados definidamente positivos (+) o negativos (-) son aquellos en que como
mnimo el 90% de las cepas de esa especie reaccionan de esa manera, mientras que los Varia-
bles (V) se refieren al hecho de que un 11 a 89% pueden hacerlo en uno u otro sentido, por lo
que no debe confiarse en stos para los fines de identificacin.

Las tablas siguientes son un resumen de las que se pueden encontrar en cualquier ma-
nual de identificacin bacteriana y que nos servirn para identificar los microorganismos uti-
lizados durante la primera semana de prcticas as como los empleados en el supuesto prcti-
co.



NO fermentativos, inmviles: G. Neisseria / Brahamella (Tabla VIII)
No fermentativos












Fermentativos








COCOS







BACILOS

OXIDASA (CATALASA +)
F. Enterobacteriaceae (Tabla XIV)
OXIDASA+


OXIDASA G. Acinetobacer (Tabla XI)
OXIDASA + Mviles/curvados: F. Vibrionaceae (Tabla XII)
CATALASA+ Inmviles/cocobacilos: G. Pasteurella / Mannheimia (Tabla XIII)
K
L
I
G
L
E
R

Ferm. Gluc. +: G. Staphylococcus (Tabla I)
Ferm. Gluc. -: G. Micrococcus (Tabla I)
COCOS







BACILOS

CATALASA +




CATALASA -
ClNa 6% +: G. Enterococcus (Tabla II)
ClNa 6% - : G. Streptococcus y Lactococcus (Tabla II)
CATALASA +








CATALASA -
B
A
C
T
E
R
I
A
S

G
R
A
M

+

B
A
C
T
E
R
I
A
S

G
R
A
M

-

Bacilos/cido de glucosa: G. Pseudomonas (Tabla IX)
Cocobacilos/no cido de glucosa G. Bordetella (Tabla X)
G. Salmonella
G. Shigella
G. Enterobacter
G. Yersinia
G. Escherichia
G. Klebsiella
G. Enterobacter
G. Yersinia
Regulares/pequeos: G. Listeria (mvil a 22C, inmvil a 37C) (Tabla VII)
Regulares/grandes: G. Bacillus (Tabla V)
MVILES
INMVILES G. Corynebacterium (Tabla III)
G. Clostridium (Tabla VI) MVILES
G. Erysipelothrix (Tabla IV) INMVILES
G. Salmonella
G. Proteus
G. Edwarsiella
G. Citerobacter
G+L+Gas+SH2-
G+L- GasV SH2+
G+L- GasV SH2-
G+L+Gas+SH2V+


24




Crecimiento
MacConkey
Metabolismo Gneros
B
A
C
T
E
R
I
A
S

G
R
A
M

N
E
G
A
T
I
V
A
S

C
O
C
O
S

(
c
o
c
o
-
b
a
c
i
l
o
s
)

Negativo Oxidativo
Cat+/Ox+
Neisseria spp.
Branhamella spp.
Positivo Oxidativo o no reactivo
Cat.+/Ox-
Acinetobacter spp.
B
A
C
I
L
O
S

Negativo Oxidativo
Cat+/Ox+
Flavobacterium spp.
Fermentativo
Cat+/Ox+
Pasteurella spp. (la mayora)
No reactivo
Cat+/Ox+
Brucella spp.
Haemophilus spp.
Pasteurella anatipestifer
Taylorella equigenitalis
No reactivo
Cat+/-/Ox+/-
Moraxella spp.
Campylobacter spp.
No reactivo
Cat+/Ox-
Francisella tularensis
Positivo Oxidativo
Cat+/Ox+
Pseudomonas spp. (la mayora)
Burkholderia cepacia
Fermentativo
Cat+/Ox+
Aeromonas spp.*
Pasteurella heamolytica*
Plesiomonas spp.*
Fermentativo
Cat+/-/Ox+/-
Actinobacillus spp.
Fermentativo
Cat+/Ox-
Enterobacteriaceae*
Pasteurella caballi
No reactivo
Cat+/Ox+
Bordetella spp.*
Alcaligenes spp.*
B
A
C
T
E
R
I
A
S

G
R
A
S

P
O
S
I
T
I
V
A
S

C
O
C
O
S

Oxidativo
Cat+/Ox+/-
Micrococcus spp.
Fermentativo
Cat+/Ox-
Staphylococcus spp.
Fermentativo
Cat-/Ox-
Streptococcus spp.
No reactivo
Cat+/Ox-
Rhodococcus equi
B
A
C
I
L
O
S

Oxidativo
Cat+/Ox-
Nocardia asteroides (algunos)
Bacillus spp.* (algunos)
Fermentativo
Cat+/Ox-
Actinomyces viscosus
Bacillus spp.* (algunos)
Corynebacterium spp.
Listeria spp.*
Fermentativo
Cat-/Ox-
Actynomyces spp.** (la mayora)
Actinomyces pyogenes
Erysipelothrix spp.
Clostridium spp.**/*
Eubacterium spp.**
Lactobacillus spp.
No reactivo
Cat+/Ox-
Rhodococcus equi
Cat=catalasa; Ox=oxidasa; +: reaccin positiva; -: reaccin negativa; V= variable; *=mvil; **=anaerobio
25

TABLA I. FAMILIA Micrococcaceae


Gnero Staphylococcus Gnero Micrococcus
S. intermedius S. aureus S. simulans S. epidermidis M. luteus M. roseus M. varians
Nitratos + + + V
+
- + +
Motilidad - - - - - V +
O/F
glucosa
F F F F O O O
Manitol V + + - + + +
Maltosa - + - + - - V
Coagulasa + + - - - - -
V.P. - + - V
+
- - -
DNAsa + + - - - - -
Lecitinasa + + +dbil - - - -
Ureasa + V
+
+ + V - +

O
: Oxidativo;
F
: Fermentativo;
V+
: Mayora de cepas positivas;
V
: Variable.



TABLA II. Gneros Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus

Hemlisis CAMP
Hidrlisis
ClNa
6,5%
V.P.
Acidificacin
Esc. Hipur. Arg. Sal. Raf. Sorb. Lac. Man. Rib.
S. agalactiae , ,no + - + + - + V
+
- - V
-
- +
S. dysgalactiae , no - - - + - - - - - + - +
S. uberis , no - + + + - + + - + + + +
S. suis no + - ND - - + - - + - ND
S. bovis , no - + - - - + + + - V
+
V -
L. garvieae - + - + - + + - - V
-
V
+
+
L. piscium No - + ND - - ND + + - + + +
E. faecalis ,no - + (+) + + + + - + + + +
E. faecium , no - + + + + + + - - + (+) +
E. hirae No - + - + + + + D - + - +

hemlisis =incompleta; hemlisis =completa; Esc: esculina; Hipur: hipurato; Arg: arginina; V.P.
Voges Proskauer; Sal: salicina; Raf: rafinosa; Sorb: sorbitol; Lac: lactosa; Man: manitol; Rib: ribosa;
V+
:
Mayora de cepas positivas;
V-
: Mayora de cepas negativas;
V
: Variable.





TABLA III. GENERO Corynebacterium


Nit. Ureasa Esculina
Fermentacin
Gluc. Sac. Manit. Xyl. Malt. Rib.
C. pseudotuberculosis V + - + - - - + +
C. renale - + - + - - - - +
C. bovis - V
-
- V
+
- - - - -
C. urealyticum - + - - - - - - -

Nit. =reduccin nitratos; Glu =glucosa; Sac: sacarosa; Manit: manitol; Xyl: xylosa; Malt: maltosa; Rib:
ribosa;
V+
: Mayora de cepas positivas;
V-
: Mayora de cepas negativas;
V
: Variable.


26

TABLA IV. GNERO Erysipelothrix

E. inopinata E. rhusiopathiae E. tonsillarum
Lactosa - + -
Ribosa V
+
- +
Trehalosa + - -
Arabinosa - + V
+


V+
: Mayora de cepas positivas




TABLA V. GNERO Bacillus


B
.

a
n
t
h
r
a
c
i
s

B
.

c
e
r
e
u
s

B
.

m
e
g
a
t
e
r
i
u
m

B
.

s
u
b
t
i
l
i
s

B
.

p
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m
i
l
u
s

B
.

l
i
c
h
e
n
i
f
o
r
m
i
s

B
.

p
o
l
i
m
i
x
a

B
.

s
t
e
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r
o
t
h
e
r
m
o
p
h
i
-
l
u
s
B
.

c
o
a
g
u
l
a
n
s

B
.

a
l
v
e
i

B
.

b
r
e
v
i
s

Motilidad - V
+
+ + + + + + + V
+
+
Nitratos + + V + - + + V V - V
V.P. + + - + + + + - V + -
O/F F F O O O F F F F F O
Lecitanasa + + - - - - - - - - -
Arabinosa - - V + + + + V V - -
Xilosa - - V + + + + V V - -
Manitol - - V + + + + V V - V
Crecimiento Anaerobiosis + + + - - + + V + + +

O
: Oxidativo;
F
: Fermentativo;
V+
: Mayora de cepas positivas;
V
: Variable.




TABLA VI. GNERO Clostridium


C. tetani C. perfringens
C. botulinum tipos
C. difficile C. septicum
I II III
Motilidad V - V + V V
+
V
+

Indol V
-
- - - V
-
- -
Lecitinasa - + - - V - -
Nitratos - + - - - - V
+

Esculina - V
+
+ - - + +
Hemlisis + V + + + - +
Morf.esporos RT OS OS OS OS OS OS

RT: Redondos/Terminales; OS: Ovales/Subterminales;
V+
: Mayora de cepas positivas;
V-
: Mayora de cepas
negativas;
V
: Variable.




27

TABLA VII. GENERO Listeria
-
Hemlisis
Test de CAMP Reduccin
Nitratos
Acidificacin de azcares
R. equi S .aureus D-Manitol L-Ramnosa D-Xilosa
L. monocytogenes + +
C
+ - - + -
L. ivanovii ++ +
P
- - - - +
L. seeligeri + +
c
+ - - - +
L. innocua - - - - - +/- -
L. welshimeri - - - - - +/- +
L. grayi - - - +/- + -/+ -

C
: En forma de cerilla.
P
: En forma de pala.
c
: En forma de cerilla, dbil.







TABLA VIII. GNEROS Moraxella, Brahamella y Neisseria


M
.

b
o
v
i
s

M
.

l
a
c
u
n
a
t
a

M
.

p
h
e
n
y
l
p
r
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v
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c
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B
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c
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B
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o
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B
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c
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N
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f
l
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v
e
s
c
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n
s

N
.

l
a
c
t
a
m
i
c
a

Morfologa cb cb cb c c c c c c
Hemlisis V
+
- - - + - - - -
MacConkey - - V
+
- - - - - -
Oxidasa + + + + + + + + +
Catalasa V
+
+ + + + + + + +
Red. Nitratos - + V
+
+ + - + - -
Ureasa - - + - - - - - -

C
: Cocos.
cb
: Cocobacilos.
V+
: Mayora de cepas positivas.





TABLA IX. GNEROS Pseudomonas y Burkholderia

P. aeruginosa P. fluorescens P. putida B. cepacia
MacConkey crece crece crece crece
Nitratos + - - V
-

Citrato + + - +
Lecitinasa - + - No relevante
Pigmentacin verde verde V no
Acidificacin:
Maltosa - - - +
Glucosa + + + +
Lactosa - - - +
Manitol V + - +

V-
: Mayora de cepas negativas;
V
: Variable.




28



TABLA X. GNERO Bordetella

B. avium B. bronchiseptica B. parapertussis
Movilidad + + -
MacConkey + + +
Hemlisis - +
Reduccin nitratos - + -
Ureasa - + +
Oxidasa + + -







TABLA XI. GNERO Acinetobacter

A. baumanni A. calcoaceticus A. lwolffii
Hemlisis - - -
Citrato + + -
cido de glucosa + + -
Crecimiento 41-44 C + - -









TABLA XII. FAMILIA Vibrionaceae

Gnero Vibrio Gnero Aeromonas Gnero Plesiomonas
ClNa 6% + - -
Sensibilidad O129 V
+
resistente sensible
V. fluvialis V. vulnificus A. hydrophila A. salmonicida P. shigelloides
Motilidad + + + - +
Lisina-DC - + V
+
- +
Ornitina-DC - V
-
- - +
Nitratos + + + - +
Indol + + + - +
Arabinosa V
+
- + + -
Sacarosa V
+
- + - -

V+
: Mayora de cepas positivas;
V-
: Mayora de cepas negativas









29

TABLA XIII. GNEROS Pasteurella y Mannheimia

P. multocida P. pneumotropica M. haemolytica
MacConkey No crece No crece Crece
Indol + + -
Ureasa - + -
ONPG V
-
+ +
Ornitina-DC V
+

-
+
-
V
-

+ -hemlisis
Acidificacin:
Manitol V
+
- +
Rafinosa - + V
+

Lactosa V
-
V
+
V
+


V+
: Mayora de cepas positivas;
V-
: Mayora de cepas negativas



TABLA XIV. FAMILIA Enterobacteriaceae

Citrobacter Enterobacter Escherichia Klebsiella Salmonella Proteus Yersinia

C
.

d
i
v
e
r
s
u
s

C
.

f
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n
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E
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l
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K
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K
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o
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e

K
.

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a
e

S
.


a
r
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a
e

S
.

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l
l
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n
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r
u
m

P
.

m
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r
a
b
i
l
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s

P
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l
g
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s

Y
.

e
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t
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r
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c
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l
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t
i
c
a

Y
.

r
u
c
k
e
r
i

Indol + - - V - V
-
+ + - - - - - + V -
Rojo M + + - V
+
- - + - + + + + + +
V.P. - - V
+
V + + - V - - - - - - - V
-

Citrato + V
+
V
+
+ + + - + - V
+
+ - V - - V
-

Urea - - - - - - - + - V
+
- - + + + -
ADH V - + - V
+
+ - - - - + - - - - -
Lisina-DC - - - - - - V + - + + + - - - +
Ornitina-DC + - + - + + V
-
- - - + - + - + +
Movilidad + + + + + + + - - - + + + + - -
Lactosa + V + V
-
+ + + + + + V
-
ND - - - -
ONPG + + + + + + + + + + + - - - + V

V+
: Mayora de cepas positivas;
V-
: Mayora de cepas negativas;
V
: Variable;
ND
:No determinado



30

T TI IR RA AS S M MU UL LT TI IS SU US ST TR RA AT TO O

Dentro de las tiras multisustrato, el sistema API es un mtodo rpido de identificacin
microbiana mediante el empleo de pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas.

Cada tira API consta de un nmero variable de microtubos que contienen los sustratos
deshidratados. Existen varios tipos de sistemas API compuestos por diferentes combinaciones
de pruebas bioqumicas, con el objeto de identificar correctamente los diversos grupos micro-
bianos. Los tipos de sistemas API ms utilizados son:
* API 20 E. Identificacin de Enterobactiaceae y otros Gram negativos.
* API 20 A. Identificacin de bacterias anaerobias.
* API Strep. Identificacin de Streptococcus.
* API Staph. Identificacin de Staphylococcus.
* API 50 CH. Estudio del metabolismo de hidratos de car-bono.
* API Z. Deteccin de Salmonella, Shigella y Yersinia.
* API S. Deteccin de enterobacterias.
* API 20 EC. Deteccin de enterobacterias coliformes.
* API 20 NE. Identificacin de Gram negativos no enterobacterias.
* API 20 C AUX. Identificacin de levaduras.
* API 20 B. Deteccin de bacterias hetertrofas anaerobias.
* API ZYM. Estudio de actividades enzimticas.
* API 10 M 5 FC. Deteccin de levaduras.

Los componentes del sistema API son:
* Tira o galera con pruebas bioqumicas.
* Cmara de incubacin.
* Medio de suspensin. Unicamente se provee en los casos en que se requiere
un medio especial, en el resto la suspensin se realiza en solucin salina est-
ril.
* Hoja de resultados.

Deben conservarse en refrigeracin (2-8C) y utilizarse antes de la fecha de caducidad
indicada en el envase.

Modo de empleo
1. Preparacin de la cmara de incubacin. Se aade agua (unos 5 ml) en los alveolos de
la base de la cmara, con el fin de proporcionar una atmsfera hmeda.
2. Preparacin del inculo. Tomar colonias del microorganismo a analizar y diluirlas
homogneamente en un medio de suspensin mediante agitacin.
3. Inoculacin de la tira. Se utilizarn micropipetas o puntas de pipeta estriles. Deben
llenarse los microtubos de cada prueba bioqumica, evitando la formacin de burbujas.
En caso de que el nombre abreviado de la prueba aparezca rodeado por tres barras
(p.ej. |CIT ), tambin debe llenarse la cpula del microtubo, y si aparece subrayado
(p.ej. ADH), la cpula debe completarse con aceite de parafina o de vaselina estril.
4. Incubacin. Introducir la tira en la cmara de incubacin. La temperatura y condicio-
nes de aerobiosis o anaerobiosis dependern del anlisis. El tiempo normal de incuba-
cin es de 18-24 horas, en caso de que las reacciones sean dudosas debe reincubarse
durante otras 24 horas.
5. Lectura de resultados. Se aadirn reactivos en las pruebas que necesiten revelado. Se
anotarn en la hoja de resultados las pruebas positivas y negativas (en las hojas hay
algunas pruebas que deben hacerse aparte, p.ej. catalasa, motilidad, oxidasa, creci-
miento en agar McConkey, etc., que tambin deben anotarse).
6. Identificacin. Mediante el empleo del programa de ordenador Apilab Software. Tam-
bin pueden utilizarse tablas y manuales especficos para sistemas API.


31

A AN NT TI IB BI IO OG GR RA AM MA A

Podemos definir en lneas generales como agentes antimicrobianos a aquellas sustan-
cias que inhiben el crecimiento de los microorganismos o producen suinactivacin. Por lo tan-
to, y dependiendo de la accin que dichos agentes ejercen sobre los microorganismos, pode-
mos dividirlos en:

* Agentes microbiostticos: son aquellos en los que la inhibicin del crecimiento que
producen desaparece cuando dejan de actuar sobre el microorganismo.
* Agentes microbicidas: son aquellos que producen una accin letal irreversible sobre
los microorganismos.

Dependiendo de su naturaleza y procedencia, las sustancias antimicrobianas pueden
ser productos qumicos de sntesis o bien productos naturales producidos por microorga-
nismos u otros organismos vivos. A estos ltimos se les considera Antibiticos si bien algu-
nos de ellos, que fueron primero descubiertos en la naturaleza, se obtienen en la actualidad
sinttica o semisintticamente, de una forma ms sencilla y barata. Entre las sustancias anti-
microbianas qumicas de sntesis se ha englobado dentro del concepto de Quimioterpico a
aquellas que pueden interferir directamente en la proliferacin de los microorganismos a con-
centraciones toleradas por el husped. Por lo tanto, al ser sustancias que poseen una toxicidad
selectiva, pueden utilizarse teraputicamente (de ah su nombre) para inhibir a un determinado
microorganismo sin ocasionar lesiones importantes en el hospedador.

Esta serie de propiedades (toxicidad selectiva, especificidad y extremada actividad)
justifican la aplicacin de este tipo de sustancias en la clnica cuando las defensas corporales
no bastan para que el individuo supere la enfermedad. De esta manera, el individuo puede re-
cuperarse sin consecuencias graves, permitiendo la destruccin o eliminacin del agente
etiolgico sin excesivos riesgos (o por lo menos menores que los producidos por la infeccin)
en el hospedador.

La resistencia bacteriana a quimioterpicos y antibiticos tom su verdadera impor-
tancia cuando se comprob la posibilidad de su adquisicin por mecanismos de transforma-
cin, conjugacin y transduccin. De esta manera se obtiene la resistencia a gran cantidad de
antibiticos y quimioterpicos al contactar cepas patgenas con cepas saprofitas que, al ser
huspedes habituales del hombre y los animales, estn continuamente expuestas a gran canti-
dad de estas sustancias. El suministro de estos agentes antimicrobianos a los animales y hom-
bre provoca la seleccin (que no el acostumbramiento) de los mutantes resistentes a estas sus-
tancias. Si esta resistencia es extracromosmica, puede ser transferida a otros microorganis-
mos menos frecuentes y ms patgenos.

VALORACION DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS: ANTIBIOGRAMA

La accin de los agentes antimicrobianos debe estudiarse sobre cultivos "in vitro" del
agente en cuestin. Con los datos obtenidos puede planificarse la posible utilidad teraputica
del producto ensayado.

Entre estos datos puede ser interesante conocer los tipos de microorganismos sobre los
que acta un antibacteriano (espectro antimicrobiano), las concentraciones necesarias para
inhibir el crecimiento de un microorganismo (sensibilidad), el efecto de las condiciones am-
bientales sobre la sensibilidad (pH, temperatura, etc.), si posee accin microbicida o micro-
biosttica, etc.



32

Uno de los datos que ms se maneja a nivel clnico y que ms trascendencia tiene es el
de la sensibilidad; para calcularla se enfrentan los microorganismos problema a diversas con-
centraciones de sustancias antibiticas o quimioterpicas. Mediante este sistema definimos la
Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) que es la menor concentracin de una sustancia que
es capaz de inhibir el crecimiento visible de un microorganismo.

La realizacin de esta tcnica es lo que se conoce como antibiograma, permitiendo el
conocimiento de la CMI y la posible aplicacin teraputica, para cada caso clnico en particu-
lar, de la sustancia adecuada a la dosis correcta.

Para la realizacin del antibiograma se pueden utilizar varias tcnicas, siendo la ms
difundida y sencilla el Tcnica de Difusin en Agar, que a continuacin se detalla.


ANTIBIOGRAMA POR TECNICA DE DIFUSION EN AGAR

Esta prueba consiste en enfrentar a un microorganismo a diversas sustancias antimi-
crobianas a una concentracin determinada para establecer la sensibilidad o resistencia de di-
cho microorganismo a las mismas. Hay que sealar que el antibiograma se debe realizar con
un solo tipo de microorganismo cada vez, es decir, con un microorganismo en cultivo puro,
no debindose utilizar una poblacin mixta de microorganismos para realizar el antibiograma.
Por tanto, debern realizarse tantos antibiogramas como microorganismos significativos en-
contremos en la muestra clnica.

* Medio de cultivo: el medio que se utiliza es el Mueller-Hinton. Las placas se secan
30 minutos a 37C antes de su empleo.

* Inculo: la cepa que se estudia se cultiva durante 24 horas en medio de cultivo sli-
do, normalmente a la temperatura de 37C; posteriormente se realiza una suspensin en solu-
cin salina estril, de manera que obtengamos aproximadamente una concentracin de 10
6
de
bacterias/ml.

* Discos de antibiticos.

Tcnica:

1. Siembra: se realiza una siembra por inundacin, utilizando 3-5 ml de la dilucin
preparada. Se deja reposar 5 minutos. Posteriormente se elimina el sobrenadante inclinado la
placa en varias direcciones, para dejar secar la placa durante 10 minutos a 37C en posicin
invertida.

2. Aplicacin de los discos antibiticos: los discos se ponen a unos 15 mm de la peri-
feria de la placa con ayuda del aplicador, apretando ligeramente los discos que no hayan en-
trado totalmente en contacto con el medio usando para tal fin el asa de platino esterilizada a la
llama. Se pueden colocar aproximadamente 6 discos por placa, teniendo en cuenta que las zo-
nas de inhibicin de los diferentes discos no deben entrecruzarse para que se puedan efectuar
la lectura de los dimetros de los halos de inhibicin en varias direcciones.

3. A continuacin se dejan secar las placas de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente
para que se sequen por completo.

4. Incubacin de las placas a 37C durante 18-24 horas.


33

Tras este periodo se observar el crecimiento bacteriano y los halos de inhibicin, si
los hubiera.

* Lectura de la zona de inhibicin: se mide el dimetro (en milmetros) de la zona de
inhibicin con una regla o comps (Figura 18). Cuando el borde no es neto, la lectura se reali-
za en la zona que corresponda aproximadamente al 80% de inhibicin. Ciertos antibiticos
producen a veces extensas colonias perifricas que no hay que tener en cuenta en la medicin
del dimetro si stas son escasas.







* Interpretacin del antibiograma: se comparan los dimetros de los halos de inhibi-
cin producidos por cada uno de los antibiticos utilizados con los que se detallan en la Tabla
1 adjunta. En esta tabla se relacionan las zonas de inhibicin con la potencia de los discos y la
sensibilidad bacteriana, por lo que debemos asegurarnos que la potencia de los discos que re-
fleja la tabla coincide con la usada por nosotros.

Para el uso clnico se han clasificado las bacterias en tres grandes grupos, segn su
sensibilidad antibitica:

- Cepa sensible: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento a la do-
sis habituales por va general.

- Cepa intermedia: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento local,
mediante un aumento de las dosis por va general, o por una concentracin fi-
siolgica particular (orina, bilis, etc.).

- Cepa resistente: es aquella que probablemente no ser afectada con las dosis
habituales, sea cual sea el tipo de tratamiento.



34

CONSEJOS PARA LA REALIZACION DE UN ANTIBIOGRAMA

1. No se debe realizar el antibiograma sobre una poblacin mixta de microorga-
nismos, debindose proceder previamente al aislamiento y cultivo en pureza de los distintos
microorganismos encontrados en la muestra clnica, para, posteriormente, realizar un antibio-
grama para cada uno de los distintos tipos de microorganismos de significacin clnica halla-
dos.

2. No deben incluirse un nmero muy elevado de antibiticos.

3. Hay que realizar las siguientes consideraciones:

3.a. Se debe limitar el estudio de la sensibilidad a los antibiticos a aque-
llos que presumiblemente sean activos sobre el microorganismo implicado en el
proceso infeccioso. Ha de tenerse en cuenta que, a pesar de que el espectro antibacte-
riano es el mismo para una misma familia de antibiticos, los fenmenos de resistencia
no son siempre extrapolables a todos los miembros de dicha familia.

3.b. Se deben tener en cuenta las contraindicaciones de la especie animal a
tratar.


35

TABLA 1:CRITERIOS PARA ESTABLECER CATEGORAS EN ANTIBIOGRAMAS
Antimicrobiano Disco Dimetro (Interpretacin)
S I R
Aplicable en: Referencia
cido Nalidxico NA 30g 19 14 18 13 Enterobacterias NCCLS 2002(V)
cido Oxolinico OA 2g 11 10
Ampicilina

AM 10g 17 14 16 13
29 - 28
17 - 16
26 19 25 18
Enterobacterias
Estafilococos
Enterococos
Estreptococos (salvo S. pneumoniae)
NCCLS 2002(V)
Amoxicilina AMX 25g 21 14 SFM 2001
Amoxicilina+cla

AMC 30g 20 19
18 14 17 13
Estafilococos
Otros organismos
NCCLS 2002(V)
Amikacina AN 30g 17 15 16 14 NCCLS 2002(V)
Apramicina APR 40g 14 13 VAV
Aztreonam ATM 30g 22 16 21 15 Enterobacterias NCCLS 2002(H)
Ceftazidima CAZ 30g 18 15 17 14 Enterobacterias NCCLS 2002(H)
Ceftiofur EFT 30g 21 18 20 17 Actinobacillus pleuropneumoniae
Pasteurella multocida
Salmonella enterica
NCCLS 2002(V)
Cefotaxima CTX 30g 23 15 22 14 Enterobacterias NCCLS 2002(H)
Cefoxitina FOX 30g 18 15 17 14 Enterobacterias NCCLS 2002(H)
Ciprofloxacina Cip 5 g 21 16 20 15 Enterobacterias NCCLS 2002(H)
Cloranfenicol C 30g 18 13 17 12
21 18 20 17
Salvo Estreptococos
Estreptococos (no S. pneumoniae)
NCCLS 2002(V)
Colistina CL 50g 15 < 15 SFM 2001
Doxiciclina D 30g 16 13 15 12 Estafilococos, Enterobacterias y
Pseudomonas
NCCLS 2000(H)
Enrofloxacina ENR 5g 23 17 22 16
21 17 20 16
P. multocida, E. coli (Aves)
Mannheimia haemolytica, P. multocida y
H. somnus (bovino)
NCCLS 2002(V)
Eritromicina E 15g 23 14 22 13
21 16 20 15
Salvo Estreptococos
Estreptococos
NCCLS 2002(V)
Estreptomicina S 10g 15 12 14 11 Enterobacterias NCCLS 2002(H)
Espectinomicina SPC 100g 14 11 13 10 M. haemolytica, P. multocida y
H. somnus (bovino)
NCCLS 2002(V)
Florfenicol FFC 30g 19 15 18 14 M. haemolytica, P. multocida y
H. somnus (Bovino)
NCCLS 2002(V)
Flumequina AR 30g 19 14 18 13
Gentamicina GM 10g 15 13 14 12 NCCLS 2002(V)
Imipenem IMP 10g 16 14 15 13 NCCLS 2002(V)
Kanamicina K 30g 18 14 17 13 NCCLS 2002(V)
Lincomicina L 15g 21 < 17 SFM 2001
Marbofloxacina MAR 5g 18 15 17 14 ROSCO
Marbofloxacina MAR 5g 18 15 17 14 VTOQUINOL
Neomicina N 30g 17 13 16 12 LIOFILCHEM
Penicilina


P 10g 29 - 28
15 - 14
28 20 - 27 19
Estafilococos
Enterococos
Estreptococos (salvo S. pneumoniae)
NCCLS 1999(V)
Sulfafurazol (sul-
famidas)
SF 300g 17 13 16 12 NCCLS 2002(V)
Tetraciclina TE 30g 19 15 18 14
23 19 22 18
Otros salvo Estreptococos
Estreptococos
NCCLS 2002(V)
Tiamulina T 30g 20 16 LIOFILCHEM
Tilmicosina TIL 15g 14 11 13 10
11 10
M. haemolytica (Bovino)
P. multocida, A. Pleuropneumoniae (Por-
cino)
NCCLS 2002(V)
Tilosina TY 30g 20 16 LIOFILCHEM
Trimetoprim TM 30g 16 11 15 10 Enterobacterias , Estafilococos NCCLS 2002(H)



36

P PR R C CT TI IC CA A D DE E V VI IR RO OL LO OG G A A

INTRODUCCIN

Los virus son agentes infecciosos extraordinariamente pequeos compuestos por pro-
tena y un nico tipo de cido nucleico, ARN o ADN pero no ambos. Aquellos que tienen en-
voltura, adems poseen lpidos y, en algunas ocasiones, las protenas ms superficiales poseen
grupos azcares (glucoprotenas).

Dada su extrema simplicidad estructural, los virus son incapaces de llevar una vida in-
dependiente y necesitan parasitar clulas que les van a aportar aquellos materiales de los que
carecen y van a permitir su replicacin. Por lo tanto, en el ciclo de vida de los virus se puede
hablar de dos fases:
a) fase extracelular, en la que actan como partculas inertes sin actividad metablica algu-
na, simplemente para pasar de clula a clula;
b) fase intracelular, en la cual desarrollan su ciclo de vida, y de la cual se deriva su efecto
patognico.

Algunos virus pueden prescindir de la fase extracelular porque son captados por otra
clula no infectada segn geman o emergen, o porque aprovechan que la clula se est divi-
diendo para transmitirse a las clulas hijas. Pero ningn virus puede prescindir de fase intra-
celular. Por este motivo, el estudio de los virus siempre requiere el uso de clulas vivas.
Afortunadamente, en la actualidad se dispone de lneas celulares continuas: clulas que se
multiplican en un medio adecuado en frascos de cultivo en el laboratorio y que cuando hay
muchas se prescinde de parte de ellas para que las que permanecen puedan seguirse multipli-
cando, y as bsicamente de una forma indefinida.

Las clulas as mantenidas son muy susceptibles a alteraciones accidentales tales
como contaminaciones, variaciones de temperatura, de pH, de presin de oxgeno, etc. Han de
ser cultivadas en unos ambientes muy restringidos, manteniendo las condiciones lo ms cons-
tantes posible. Por este motivo, el acceso a la sala de cultivos debe ser restringido y no es
aconsejable incluir en las prcticas el manejo de las clulas, bien infectadas o bien sin infectar
por virus.

Los virus son demasiado pequeos para ser observados con el microscopio ptico. Sin
embargo, al desarrollar su ciclo de replicacin utilizan productos celulares y alteran la vida de
la clula, y en muchas ocasiones esto s que se puede observar con el microscopio ptico.
Como se indic ms arriba, ste es el llamado efecto citoptico. Los posibles efectos citop-
ticos son numerosos. Entre ellos se cuentan la aparicin de sincitios, la lisis celular, el desa-
rrollo de cordones, la vacuolizacin, la aparicin de clulas gigantes, etc. Al final de la des-
cripcin de esta prctica hay algunas fotos demostrativas. En la WebCT de la Microbiologa,
en Laboratorio Virtual de Microbiologa Veterinaria, en la parte destinada a Laboratorio de
Virologa hay imgenes de efectos citopticos y cmo se van desarrollando.


OBJETIVO

El objetivo de esta prctica es hallar la cantidad de virus presente en una muestra de
origen infeccioso. Para ello, realizaremos una titulacin, a fin de determinar la Dosis Infectiva
en Cultivo Tisular 50 (TCID
50
), o cantidad de muestra que produce efecto citoptico en 50%


37

de los cultivos. Los clculos son muy similares a los que se realizan para determinar cualquier
otra dosis infectiva, letal, etc 50.

DESARROLLO

Todo el proceso debe realizarse en condiciones de la mxima esterilidad. Se dis-
pondr de una placa de 96 pocillos en la que se van a hacer dos titulaciones. Las placas son
muy parecidas a las de ELISA pero estn tratadas para que las clulas se adhieran a las mis-
mas. A diferencia de las bacterias, los virus no crecen bien en cualquier clula y son muy es-
pecficos. En el laboratorio generalmente hay que disponer de una veintena o ms de lneas
celulares para garantizar que un virus procedente de un aislamiento concreto puede crecer en
alguna de ellas. Sin embargo, en estas prcticas se va a titular un virus que sabemos que crece
sobre la lnea celular CRFK, fibroblastos de rin felino. Para la titulacin, haremos dilucio-
nes del virus que iremos aadiendo a los pocillos. Transcurridas 24 h veremos el efecto ci-
toptico.

Protocolo de la prctica

En la placa, en cada uno de los 96 pocillos hay alrededor de 20.000 clulas en 100 l
en un medio de cultivo especfico para cultivos titulares. Cada placa ser empleada para dos
titulaciones, aadiendo 100 l de cada dilucin del virus a cuatro pocillos diferentes.

1. Realizar diluciones de la muestra de virus en base cinco.
Preparar una batera de tubos Eppendorf estriles, hasta un total de 10 tubos.
Aadir 800 l de medio de cultivo (RPMI con suero fetal bovino y antibiti-
cos, para evitar en la medida de lo posible el crecimiento de bacterias) a cada
uno.
Tomar con una micropipeta 200 l de muestra de virus, y transferirlos al pri-
mer Eppendorf. En este tubo, el virus habr quedado diluido 1:5.
Mezclar concienzudamente, y transferir 200 l del tubo 1:5 al siguiente tubo,
quedando el virus diluido 1:25.
Repetir el paso 5 hasta el final, partiendo siempre del ltimo tubo en donde se
ha realizado la dilucin.
2. Una vez estn todas las diluciones hechas, pasar 100 l de cada dilucin a cuatro poci-
llos distintos. La dilucin final del virus en cada pocillo ser la mitad que la inicial, ya
que en el volumen final, tan slo la mitad corresponde a la dilucin del virus.
3. No aadir dilucin de virus a las dos ltimas columnas, para considerarlas controles.
En estos pocillos, las clulas tienen que crecer perfectamente.
4. Incubar a 37C durante 24 horas en atmsfera con 5% de CO
2
y humedad.

Al da siguiente se procede a observar el resultado. A partir de aqu ya no es necesario
mantener las condiciones de esterilidad.

1. Eliminar el medio de cultivo por absorcin con una pipeta multicanal.
2. Fijar las clulas con metanol, aadiendo 100 l a cada pocillo con la pipeta multicanal
y dejndolo actuar durante 5-10 minutos.
3. Eliminar el metanol y lavar con el agua del grifo dejndola caer en los pocillo con mu-
cho cuidado para que no se desprendan las clulas.
4. Aadir 100 l de solucin Giemsa, y dejndolo actuar durante 30 minutos. Si el colo-
rante no est preparado, diluir 1 gota de la solucin madre en 1 ml de agua.


38

5. Eliminar la solucin de Giemsa y lavar con cuidado con el agua del grifo.
6. Observar al microscopio.
7. Anotar en un papel los pocillos en los que hay efecto citoptico (aquellos en los que
las clulas pegadas al pocillo son menos de la mitad que en los controles).



RESULTADOS

Para evaluar los resultados y dar un ttulo hay que aplicar una frmula estadstica.
Aqu se muestra el mtodo de Karber.

TCID50 =- -(S-0.5)

=log
10
de la ltima dilucin con 100% de cultivos positivos (con efecto citoptico)

=log
10
del factor de dilucin
log
10
10 =1
log
10
5 =0,7
log
10
3 =0,5
log
10
2 =0,3

S =suma de la fraccin de pocillos con efecto citoptico en cada dilucin, desde la dilu-
cin en la que el 100% lo muestra. Este ltimo caso tiene un valor de 1 y todos los
dems sern una fraccin de 1.


En el ejemplo de la pgina anterior

=-2,4 (log
10
de 1:250, ltima dilucin con el 100% de efecto citoptico).
=0,7 (diluciones en base 5)
S =la suma de
Dilucin 1:250 = 4/4 =1
Dilucin 1:1250 = 3/4 =0,75
Dilucin 1:6.250 =1/4 =0,25
Dilucin 1:16.250 =0/0=0
Suma = 2,00

Sustituyendo los valores en la ecuacin:
TCID
50
=- 2,4 (0,7 x (2-0,5)) =-2,4 (0,7 x 1,5) =- 2,4 1,05 =-3,45



39

Tubo-
Columna
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (11) (12)
Dilucin
en el Ep-
pendorf
1:5 1:25 1:125 1:625 1:3125 1:15.625 1:78.125 1:390.625 1:1.953.125 1:9.765.625 Contr Contr





RPMI 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l
Virus 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l
Dilucin
final en
pocillo
1:10 1:50 1:250 1:1250 1:6.250 1:16.250 1:156.250 1:781.250 1:3.906.250 1:19.531.250 0 0


Ejemplo


40

Algunos ejemplos de efecto citoptico




a) Efecto citoptico inexistente b) Lisis, calvas o placas












c) Efecto citoptico: leucemia d) Efecto citoptico: sincitios


























41



P PR RA AC CT TI IC CA A D DE E M MI IC CO OL LO OG GI IA A


Objetivos:

En esta prctica el alumno debe cubrir los siguientes objetivos:
Conocimiento de las tcnicas bsicas utilizadas en el laboratorio de Micologa.
Reconocimiento de las distintas estructuras que tienen los hongos cuando se des-
arrollan sobre medios de cultivo.
Conocer las caractersticas morfolgicas (macro y microscpicas) de los distintos
grupos taxonmicos de inters veterinario.
Aprender a utilizar las claves dicotmicas bsicas de identificacin de hongos.

Teora:

1. Medios de cultivo: no difieren en principio de las normas generales expuestas al hablar de
bacterias. Los aspectos diferenciales que podemos destacar son los siguientes:

Se utilizan medios selectivos con los siguientes objetivos:

a) Inhibir el crecimiento de bacterias. Para ello se han empleado dos estrategias bsi-
cas:
** Medios con pH cido (<5).
** Medios a los que se aade antibiticos de amplio espectro: tetraciclina, pe-
nicilina/ estreptomicina, cloranfenicol, gentamicina, etc.
b) Inhibir el crecimiento de un determinado grupo de hongos:
** Actidione (cicloheximida) que inhibe el crecimiento de la mayora de los
hongos saprofitos, se utiliza en los medios de aislamiento de los hongos der-
matofitos.
c) Restringir el crecimiento de hongos de desarrollo invasivo, como en el caso de los
Zygomycetes, agregando Rosa de Bengala, al 03 por mil.

2. Incubacin:

* La incubacin se realiza en aerobiosis.
* Se utilizan diferentes temperaturas de incubacin dependiendo del tipo de muestra
en estudio:
** Temperatura de 22-28C: cuando se quiere aislar hongos que colonizan sus-
tratos no vivos (alimentos, ambientes....).
** Temperatura de 32C: cuando se procesan muestras clnicas para el dia-
gnstico de micosis superficiales.
** Temperatura de 37C: cuando se procesan muestras clnicas de mamferos
para diagnstico de micosis profundas.
* El periodo de incubacin vara entre 3-5 das y hasta 21 das en dermatofitos.








42


3. Mtodos de aislamiento: Obtencin de cultivos puros.

Mtodos:
- Siembra por agotamiento: utilizado para levaduras (ya descrito en las
tcnicas de bacteriologa.

- Siembra en tres puntos: utilizado para hongos miceliares.



Siempre que trabajemos con un cultivo de hongos debemos tener en cuenta que estos
se reproducen por medio de esporas, y que estas se dispersan muy fcilmente por el ambiente,
contaminando el laboratorio. Por tanto, debemos tomar precauciones en la manipulacin de
los cultivos, de tal forma que se evite, en lo posible, la contaminacin, para lo cual:

- Debemos tener las placas abiertas el menor tiempo posible.
- Las placas con crecimiento fngico siempre se abren boca abajo, dejando
la tapa en la mesa y manteniendo el cultivo hacia abajo con el fin de que
las esporas no se diseminen.

Mtodo de siembra en tres puntos
a. Con el asa de platino estril y fra se raspa ligeramente el centro de la colonia del
hongo.
b. En una placa con medio de cultivo se toca en tres puntos equidistantes con el asa de
platino cargada.
c. Se lleva a incubar a temperatura y periodo ptimos dependiendo del tipo de proble-
ma en estudio.

4. Mtodo de identificacin de hongos aislados sobre medio de cultivo: La identificacin
se realiza siguiendo las pautas:

* Anlisis macroscpico de las colonias: por el aspecto de la colonia podemos saber si se tra-
ta de una levadura o de un hongo miceliar o filamentoso.
Los caracteres macroscpicos de la colonia que presentan inters taxonmico son:
Color (anverso y reverso), tonalidad y distribucin.
Textura superficial, surcos y/o estras.
Exudados y pigmentos.
Tamao



43


* Anlisis microscpico.
a.- Para levaduras: siguiendo procedimiento similares a las tcnicas bacteriolgicas ya
descritas.
- En fresco, sin fijar.
- Fijadas y teidas
b.- Para hongos miceliares: las preparaciones para la observacin microscpica se
montan normalmente utilizando los siguientes elementos:
- Agua o azul de metileno como agente de montaje.
- Agujas enmangadas o "celo" para toma del material a examinar.
Tcnica de la cinta adhesiva:
1. La placa de cultivo se abre sobre la mesa.
2. Se corta un trozo de papel celo que se pone en contacto con una colonia del hongo.
3. Sobre un porta depositamos una gota de agua o azul de metileno.
4. Se presiona el celo sobre el porta, eliminando el exceso de agua o colorante con pa-
pel secante (filtro), evitando la formacin de burbujas.
5. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos.

Tcnica del cubreobjetos

1. La placa de cultivo se abre sobre la mesa.
2. Con dos agujas enmangadas se toma una porcin del centro de la colonia.
3. Sobre un porta depositamos una gota de agua o azul de metileno.
4. Se dislacera, con ayuda de las agujas, la porcin de colonia en estudio.
5. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin, eliminando el resto de agua
o colorante con papel secante (filtro).
6. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos.

El agua para el montaje de la preparacin, se emplea cuando queremos conocer la co-
loracin que tienen las estructuras de los hongos.

Caracteres que presentan valor taxonmico:

a) En la identificacin de levaduras.
b) En la identificacin de hongos miceliares.

a) Criterios de identificacin para levaduras:
Caractersticas de cultivo:
- Medio lquido: formacin de velo o anillo.
- Medio slido: Caractersticas macroscpicas de la colonia (ya descritas)
Caractersticas microscpicas de la levadura:
- Forma, tamao de las clulas.
- Tipo de reproduccin asexual.
- Tipo de reproduccin sexual.
Caractersticas fisiolgicas:
- Utilizacin de los compuestos de carbono:
** Fermentacin
** Oxidacin
** Hidrlisis de la arbutina
- Utilizacin de los compuestos de nitrgeno.




44


- Capacidad de crecimiento en medios libres de vitaminas.
- Hidrlisis de la urea
- Produccin de pigmentos.
- Capacidad de licuar gelatina.

b) Criterios de identificacin para hongos miceliares:
Caractersticas de cultivo: a partir de las colonias desarrolladas en medios de culti-
vo slidos ejem: agar extracto de Malta, agar glucosado de Sabouraud, Czapex-
Dox, etc.
- Caractersticas macroscpicas: (ya descritas)
- Caractersticas microscpicas:
** Caractersticas de las hifas:
Dimetro.
Color: (hialino, dematiceo =oscuro, marrn)
Presencia o ausencia de septos.
Presencia de determinadas formaciones caractersticas: hifas en raqueta,
hifas en espiral, hifas peptinadas, formacin de clamidosporas.

** Caractersticas de las estructuras reproductoras asexuales:
- Hongos cenocticos:
Morfologa del esporangio
Morfologa de la columela
Presencia o ausencia de apfisis, rizoides...
- Hongos septados
Presencia o ausencia de conidiforo.
Morfologa del conidiforo.
Morfologa y tipo de clula conidigena.
Tipo de conidiogenesis: tlica o blstica.
Estructura y caractersticas de los conidios.

** Caractersticas de las estructuras reproductoras sexuales (si las hay).
- Hongos cenociticos
Morfologa de la zigospora
- Hongos septados
Presencia de cuerpos fructferos sexuales (cleistotecios, apotecios, peri-
tecios).
Presencia y tipos de ascas y ascosporas.

En la mayor parte de los hongos miceliares la informacin obtenida del estudio de sus carac-
tersticas de cultivo (anlisis macro y microscpico) es suficiente para poder identificarlos uti-
lizando las claves dicotmicas.

En algunos casos, para poder discernir entre dos gneros prximos o bien dentro de un gnero
determinado entre dos especies, se tiene que recurrir a pruebas fisiolgicas, que nos pondrn
en evidencia diferencias metablicas entre ellas (presencia o ausencia de un determinado en-
zima, capacidad de asimilacin de determinados sustratos.......).






45


IDENTIFICACIN DE HONGOS-CLAVES DICOTOMICAS

1.a - Crecimiento en Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias ms o me-
nos mucosas, de color blanco, crema, rosa, rojas .......etc., sin formacin de fi-
lamentos.................................................................................LEVADURAS



1.b - Crecimiento en medio Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias de
apariencia miceliar........................................................................................... 2


2.a - Hifas no septadas (o con septos muy escasos en las proximidades de los
rganos, reproductores). Dimetro de la hifa >4. Esporas asexuales se for-
man en el interior de receptculos cerrados (esporangios)
HONGOS CENOCITICOS
Div. Zygomycota


2.b - Hifas septadas. Dimetro de la hifa variable normalmente <4u
HONGOS TABICADOS
Div. Ascomycota
Div. Deuteromycota






46



HONGOS CENOCITICOS.


Division Zygomycota

Crecimiento en medios slidos, generalmente muy expansivo, algodonoso, hifas hia-
linas, los esporangios se ven como puntos oscuros en la superficie de la colonia



Caractersticas de inters taxonmico











47


1.a.- Esporangiosporas formadas en el interior de merosporangios.........................
.............................................................................................. Syncephalastrum



1.b.- Esporangiosporas formadas en esporangios globosos con colume-
la......................................................................................................... 2




2.a.- Micelio vegetativo con rizoides. El esporangio presenta apfisis ................. 3















48


2.b.- Ausencia de rizoides y de apfisis........................................................... Mucor



3.a.- Rizoides situados en la base del esporangio. Columela de forma globosa
............................................................................................................ Rhizopus


3.b.- Rizoides presentes pero a menudo difciles de observar. Apfisis en forma de
embudo.................................................................................................. Absidia




HONGOS TABICADOS.

Divisin Ascomycota. Divisin Deuteromycota.

1.a.- Organos reproductores cerrados presentes: sexuales (cleistotecio, peritecio y
apotecio) o asexuales (picnidios, acervulos)............................................................2






49


1.b- Organos reproductores sexuales ausentes. Organos reproductores asexuales
cerrados ausentes................................................................... Div. Deuteromycota
Clase Hyphomycetes

2.a.-Organos reproductores sexuales presentes. Espora sexual en el interior de una
clula en forma de saco (asca)...............................................Div. Ascomycota

2.b.- Organos reproductores sexuales ausentes. Organos reproductores asexuales
cerrados presentes.................................................................... Div. Deuteromycota
Clase Coelomycetes


Divisin Deuteromycota. Clase Hyphomycetes.

1.a.- Conidios ausentes............................................... Micelio estril.
1.b.- Conidios presentes........................................................ 2.


2.a.- Conidios mayoritarios formados por un proceso tlico . .............................. 3.






50


2.b.- Conidios mayoritarios formados por un proceso blstico. ............................ 6


3.a.- Conidio formado por fragmentacin de micelio vegetativo (sin diferenciacin
previa), formando artroconidias exclusivamente. Micelio hiali-
no............................................................................................. Geotrichum



3.b.- Artroconidia ausente o poco abundante,presencia de otro tipo de conidios tli-
cos. Micelio hialino.................................................................................... 4.

4.a.- Presencia de dos tipos de conidios tlicos: unicelulares (microconidios) y
pluricelulares con tabiques transversales (macroconidios)........................... 5.













51

4.b.- Presencia de un solo tipo de conidio pluricelular (tabicado con septos trans-
versales)......................................................................... Epidermophyton


5.a.- Macroconidia de pared gruesa y rugosa. Relativamente ms abundantes que
las microconidias.......................................................................... Microsporum


5.b.- Macroconidia de pared delgada y lisa. Microconidia relativamente ms abun-
dante que las macroconidias............................................... Trichophyton



6.a.- Conidios generalmente unicelulares............................................................ 7.
6.b.- Conidios generalmente pluricelulares......................................................... 10.

7.a.- Conidios mayoritarios formados a partir de micelio indiferenciado por gema-
cin (blstico). Colonias viscosas, aspecto levaduriforme, color variable ini-


52

cialmente (blanquecinas, rosas, marrn plido) evolucionando a marrn oscu-
ro........................................................................................Aureobasidium

7.b.- Conidios formados sobre clulas conidigenas diferenciadas y agrupados
de forma caracterstica constituyendo conidioforos...................................... 8.


8.a.- Colonias en tonos blancos o marrones claros cuando envejecen. Clulas co-
nidiognas anelidicas, conidios generalmene rugosos de base truncada,
agrupados formando cadenas...................................................Scopulariopsis

8.b.- Colonias en tonos blancos, amarillos, azules, verdes, generalmente de creci-
miento rpido. Clulas conidiogenas fialidicas....................................... 9.

9.a.- Las fialides insertadas sobre el pice de una hifa diferenciada, ensanchada,
que constituye la vescula. Pudiendo tener uno o dos verticilos de clulas co-
nidiogenas................................................................................... Aspergillus


53



9.b.- Las fialides constituyen el ltimo verticilo del conidioforo que tiene la forma
caracterstica de pincel.................................................................... Penicillium


10.a.- Colonias blancas, amarillas, rosadas.Generalmente los macroconidios tienen
Forma de hoz con tabiques transversales.Tambin pude tener microconidios
unicelulares........................................................................................ Fusarium

10.b.- Colonias generalmente de coloresoscuros (verde, marron). Micelios oscuros
(dematiaceos). Conidios maduros pluricelulares con tabiques de orientacin
irregular, transversales, longitudinales y oblicuos (dictioconidio).... Alternaria











54

Levaduras





















































55

Glosario de los terminos micolgicos empleados
en la clave de identificacin de las prcticas


Anlide: tipo de clula conidiogena que produce conidios blsticos de una manera baspeta, alargandosese con
la produccin de cada conidio, que deja cicatrices en forma de anillo en la superficie externa.

Aplanospora: espora inmvil.

Apfisis: dilatacin en el extremo del esporangiforo situado debajo del esporangio de los Zygomicota.

Artrospora. Espora resultante de la fragmentacin de la hifa.

Cenoctica: no septada.

Clamidospora: conidio tlico de pared gruesa, que generalmente funciona como espora de resistencia.

Columela: estructura estril existente dentro de un esporangio u otra fructificacin.

Conidio: espora asexual no movil, que suele formarse en el pice o en el lado de la clula esporgena (clula
conidigena).

Conidio blstico: conidio que se forma por un proceso de gemacin a partir de una clula conidigena.

Conidio tlico. Conidio formado por transformacin de la totalidad de una clula hifal preexistente.

Conidiforo: hifa simple o ramificada que sale de una hifa somtica y se modifica de tal forma que en su pi-
ce, o en un lado lleva una o ms clulas conidiogenas.

Dictioconidio: espora con tabique transversales , longitudinales y oblicuas.

Esporangio: estructura en forma de saco cuyo contenido protoplsmico completo se transforma en un nmero
indefinido de esporas.

Esporangiolo: esporangio pequeo que contiene pocas esporas.

Esporangioforo: hifa portadora de un esporangio.

Filide: tipo de clula conidiogena que produce conidios blsticos de unamanera baspeta, sin un aumento de-
tectable de la longitud.

Hifa hialina: hifas transparentes, incoloras.

Hifa dematiacea: hifas de color oscuro.

Merosporangio: esporangio cilndrico.

Rizoide: ramificacin corta y delgada de las hifas semejante a la raiz de una planta.

Zoospora: espora movil, producida asexualmente.




56

A AN NA AL LI IS SI IS S D DE E A AL LI IM ME EN NT TO OS S

La existencia de microorganismos en los alimentos no significa en muchos casos un
peligro para el consumidor o una calidad deficiente de los mismos. Slo en aquellos casos en
los que los alimentos vehiculan grmenes potencialmente patgenos o en los que la manipula-
cin y las condiciones de higiene y almacenamiento han sido deficientes pueden constituir un
serio peligro para la salud del consumidor. No obstante la legislacin vigente exige la ausen-
cia de determinados microorganismos, y un nmero mximo de otros, con lo que sea por la
causa que sea, el anlisis de alimentos microbiolgico de alimentos es obligatorio. Como con-
secuencia la determinacin en el laboratorio de ciertos grupos de microorganismos cuya pre-
sencia en los alimentos en determinado nmero indica que estos alimentos estuvieron expues-
tos a condiciones tales que permitieron la entrada y multiplicacin de agentes infecciosos o
toxignicos. A estos grupos de microorganismos se les denomina "indicadores" y sirven para
evaluar la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y sus toxinas.

En otros casos se pueden seleccionar otros grupos de bacterias, aadiendo al agar nu-
tritivo inhibidores selectivos con actividad de superficie o colorantes, modificando la compo-
sicin de la atmsfera de incubacin, eliminando por ejemplo el oxgeno.

METODO:

Objetivo: Determinar el nmero de microorganismos totales o un grupo de ellos en
concreto que hay en 1 ml o en 1 g del alimento a analizar.

Recuentos en placa de bacterias: Dichos recuentos se basan en la determinacin del
nmero de colonias que crecen en placas de agar nutritivo que han sido sembradas con canti-
dades conocidas del alimento diluido e incubadas en determinadas condiciones ambientales.

Como se ha sealado anteriormente, la siembra en la placa de agar nutritivo del ali-
mento se realiza con este diluido. Los diluyentes utilizados, varan dependiendo del tipo de
muestra que se deba analizar; en general suelen ser sustancias tales como agua destilada, solu-
cin salina, solucin Ringer, solucin tampn fosfato, y para el recuento bacteriano en ali-
mentos est especialmente recomendada una solucin al 0,1% de peptona en agua destilada o
solucin salina.

El mtodo para diluir alimentos slidos o lquidos es diferente.

1. Muestras lquidas:

1.a. Homogeneizacin de la muestra usando el agitador excntrico.
1.b. Con una pipeta se toma 1 ml de la muestra y se deposita en el primer tubo
de dilucin que contiene 9 ml de diluyente (figura 20).
1.c. Una vez utilizada la pipeta se elimina.
1.d. Este primer tubo se homogeneiza
1.e. De este tubo se toma 1 ml que se deposita en un segundo tubo de dilucin
con otros 9 ml de diluyente.
1.f. Se elimina nuevamente la pipeta utilizada.
1.g. Se homogeneiza este segundo tubo.

Este procedimiento se repite tantas veces cuantas diluciones sean necesarias.

2. Muestras slidas:


57


En el caso de muestras slidas o semislidas, se considera que 1 g de muestra equivale
a 1 ml del mismo producto en estado lquido; de este modo 10 g de la muestra y 90 ml de di-
luyente convenientemente homogeneizados en una batidora, constituirn la primera dilucin.
Posteriormente se procede igual que en el caso anterior.

El segundo paso sera sembrar en superficie un determinado volumen (0,1-0,2 ml) de
cada dilucin en placas de agar nutritivo, para lo que se utiliza el asa de Drigalski tal y como
se describe en la pgina 11.

INTERPRETACION:

Para hacer recuento de microorganismos aerobios mesfilos las placas sembradas de
esta forma se incuban a 32-37C durante 24-48 horas.

Trascurrido el periodo de incubacin se procede a contar el nmero de colonias que
haya en las placas correspondientes a las distintas diluciones, teniendo en cuenta que slo se
deben considerar aquellas placas cuyo nmero de colonias sea superior a 30 e inferior a 300.
Las colonias se cuentan punteando con rotulador cada una de ellas por el reverso de la placa
de Petri, con el fin de no contar una misma colonia dos veces.

Tras contarlas se debe utilizar este dato , junto a los de volumen sembrado y dilucin
que corresponda , para calcular el nmero de microorganismos por unidad de volumen o peso
de muestra. As, por ejemplo, si en la dilucin 10
-7
, hemos contado 35 colonias, multiplicare-
mos este nmero por el inverso de dicha dilucin, con lo cual obtendremos 35x10
7
en el vo-
lumen que hemos aadido a la placa (0,1 ml). Como el resultado debe darse por mililitro de
muestra original, el resultado final ser 35x10
8,
o, expresado ms sencillamente, 3,5x10
9




58









Batera de tubos conteniendo cada uno NUEVE
ml exactos de solucin salina estril
De cada tubo del banco de di-
luciones se siembran una o va-
rias placas Petri con agar nu-
tritivo o medio selectivo es-
pecfico.
Demasiadas colonias Nmero adecuado Pocas colonias
para recuento
(30 a 300)


59


M ME ED DI IO OS S D DE E C CU UL LT TI IV VO O

MEDIOS GENERALES

AGAR SANGRE
Composicin en g/l:

* Peptona de casena............ 12'0
* Peptona de carne............... 11'0
* Almidn............................. 1'5
* Cloruro Sdico.................. 5'0
* Agar................................. 15'0
pH final: 7'3 aproximadamente

Tambin pueden emplearse como medio base para el agar sangre el agar Columbia o el agar
de Soja Tripticasena (TSA). El medio base, una vez esterilizado debe enfriarse hasta una temperatura
de 45C. En ese momento se aade la sangre desfibrinada de carnero o de caballo hasta una concentra-
cin del 5% . En el caso de que se aadiera la sangre a una temperatura mayor a 45C, sta se hemoli-
zara, con lo que obtendramos el denominado "Agar-chocolate".

Se trata de un medio de uso general (no selectivo), que soporta bien el crecimiento de bacte-
rias normales como las enterobactericeas y otros ms exigentes como Pasteurella y Brucella, etc. Es-
te medio contiene una mezcla equilibrada de peptonas de carne y casana, que lo hacen muy adecuado
para la preparacin de medios selectivos y diagnsticos con la adicin de sangre y/o inhibidores. Tal
como se presenta, es decir sin adiciones y aadiendo sangre, es un excelente medio de cultivo general.
Normalmente, las bases de Agar Sangre contienen una peptona de casena que facilita la produccin
de colonias de gran tamao y una peptona de carne, que proporciona unos halos de hemlisis muy de-
finidos, propiedad que es muy importante desde el punto de vista taxonmico.


MEDIO DE SOJA TRIPTICASEINA (TSA)

Composicin en g/l:

* Peptona de Casena............. 15'0
* Peptona de Soja....... ......... 5'0
* Cloruro de Sodio................. 5'0
* Agar................................... 15'0
pH final: 7'3 aproximadamente.

Se trata de un medio para uso general, que contiene dos peptonas, las cuales favorecen el cre-
cimiento de una amplia variedad de microorganimos. Es idneo para el cultivo tanto de aerobios como
anaerobios. Tambin se puede utilizar el medio como base de Agar Sangre; para ello se debe aadir un
7% de sangre. Igualmente, se puede usar para la preparacin de "Agar chocolate".


GAR DE MUELLER HINTON (MH)

Composicin en g/l:

* Peptona........................ 17'5
* Infusin de Carne............4'0
* Almidn........................ 1'5
* Agar............................. 15'0



60

Este agar fue ideado como medio de cultivo para aislamiento de especies patgenas del gnero
Neisseria. Sin embargo, a partir de 1970 la OMS propuso este medio de cultivo para los ensayos de
sensibilidad de antibiticos y sulfamidas, en un afn de estandarizar dichos ensayos.





MEDIOS SELECTIVOS

MEDIO DE BAIRD-PARKER (BP)
Composicin en g/l:

* Peptona de casena.............10'0
* Extracto de carne.............. 5'0
* Extracto de levadura...........1'0
* Cloruro de Litio................ 5'0
* Agar................................. 17'0
* Glicina............................. 12'0
* Piruvato de Sodio............ 10'0
pH final: 6'8 aproximadamente

Una vez esterilizado el medio, se aaden 10 ml de una solucin de Telurito Potsico al 1% y
una Yema de Huevo emulsionada.
Se trata de un medio altamente selectivo para el aislamiento y enumeracin de los miembros
del gnero Staphylococcus. El medio incorpora Piruvato Sdico como estimulante del crecimiento. As
mismo incorpora un fuerte inhibidor de muchos microorganismos como es el Telurito Potsico, ac-
tuando tambin como inhibidores, el Cloruro de Litio y la Glicina. La emulsin de Yema de Huevo
hace al medio opaco y permite observar si los microorganismos presentes en el medio poseen lecitina-
sa, una enzima que desdobla la lecitina presente en la Yema de Huevo. La actividad de esta enzima
produce zonas de aclaramiento o halos ms claros alrededor de las colonias.

Las colonias de Staphylococcus aureus aparecern brillantes y de color negro por la reduccin
del Telurito Potsico. Sin embargo, el color de las colonias no es decisivo para la identificacin:
miembros del gnero Listeria que presentan el mismo aspecto. En este medio tambin pueden desarro-
llarse microorganismos de los gneros Bacillus y Micrococcus.


MEDIO DE MacCONKEY (Mck)
Composicin en g/l:

* Peptona................... 20'0
* Lactosa................... 10'0
* Sales Biliares............ 2'5
* Cloruro Sdico......... 5'0
* Rojo Neutro............. 0'05
* Cristal Violeta.......... 0'001
* Agar........................ 15'0
pH final: 7'2 aproximadamente.

Se trata de un medio diferencial para la deteccin, aislamiento y enumeracin de coliformes y
patgenos intestinales en agua, productos lcteos y muestras biolgicas. Se utiliza fundamentalmente
para el aislamiento de miembros de la Familia Enterobacteriaceae y diferenciacin de Escherichia co-
li de otros patgenos intestinales de la misma familia. Los componentes selectivos lo constituyen el
Cristal Violeta (inhibidor de los microorganismos Gram-positivos) y las Sales Biliares. La concentra-
cin de estas dos sustancias permite el crecimiento de todos los miembros de la familia anteriormente
citada. Las bacterias del gnero Pseudomonas pueden crecer tambin en este medio, aunque no perte-


61

necen a la Familia Enterobacteriaceae; sin embargo, se diferencian bien por ser las Pseudomonas
Oxidasa positivas y aerobias estrictas.

La incorporacin del rojo neutro (de color rosa en medio cido) permite la diferenciacin de
los microorganismos que fermentan la Lactosa de los que no lo hacen. Los primeros, al fermentar la
Lactosa acidificarn el medio, dando lugar a que las colonias presenten una coloracin rosada, que no
aparecer si no se hidroliza dicho disacrido.


MEDIO DE SABOURAUD (Sb)
Composicin en g/l:

* Glucosa............................. 40'0
* Peptona de Casena............. 5'0
* Peptona de Carne............... 5'0
* Agar....................... .......... 15'0
pH final: 5'6 aproximadamente.

Se trata de un medio indicado para el cultivo de hongos. Su selectividad se debe a su bajo pH
y a la alta concentracin de glucosa, que junto con una incubacin a temperaturas relativamente bajas
(25 a 30C), permiten favorecer el crecimiento de los hongos, al mismo tiempo que dificultan el de las
bacterias. Frecuentemente este medio es usado con antibiticos para el aislamiento de hongos patge-
nos, a partir de material que contenga gran cantidad de otros hongos o bacterias.






OTROS MEDIOS DE USO FRECUENTE

* Caldo BHI adaptado para el crecimiento de microorganismos exigentes.
* Agar Columbia, medio bsico enriquecido para microorganismos exigentes, tambin usado
como base para el agar sangre.
* Agar Salmonella-Shigella (SS) diferencial y selectivo para estos gneros.
* Agar Malta y Agar Czapek para el aislamiento de hongos.


62

P PR RU UE EB BA AS S B BI IO OQ QU U M MI IC CA AS S

UTILIZACION DE AZUCARES

Los azcares que vamos a utilizar son:
- GALACTOSA
- GLUCOSA
- INOSITOL
- LACTOSA
- MALTOSA
- MANITOL
- RAFINOSA
- RAMNOSA
- RIBOSA
- SALICINA
- SORBITOL
- XYLOSA

FUNDAMENTO: Estas pruebas bioqumicas se integran dentro del grupo que estudia la
determinacin de la capacidad de un microorganismo para utilizar un hidrato de carbono espec-
fico incorporado en un medio de cultivo bsico, originando un pH cido. El medio de cultivo
lleva incorporado un indicador de color (rojo fenol), de color rojo a pH alcalino y amarillo a pH
cido.

TECNICA: Se siembra con un inculo espeso. En el caso de querer apreciar la degrada-
cin en condiciones de anaerobiosis o cuando se desea estimar si se trata de metabolismo oxida-
tivo o fermentativo, se cubre el medio con 1-2 ml de parafina lquida estril.
Se incuba a 37C - 24 h.

RESULTADO +: color amarillo del medio, que indica acidez.
RESULTADO -: color rosa-rojizo del medio, que indica alcalinidad.



PRUEBA CAMP

FUNDAMENTO: La actividad hemoltica de la lisina estafiloccica sobre los eritro-
citos se ve intensificada por un factor extracelular producido por estreptococos del grupo B,
llamado factor CAMP. Por lo tanto, cuando ambos productos se encuentran juntos en una placa
de agar sangre ovina, se advierte una intensificacin de la reaccin hemoltica.



TECNICA: La prueba CAMP se realiza trazando una estra de estreptococos (por iden-
tificar) en forma perpendicular a otra estra de una cepa de Staphylococcus aureus conocida co-


63

mo productora de lisina. Ambas lneas no deben tocarse (figura 22A). Las placas se deben in-
cubar en aerobiosis.

INTERPRETACION: Como se ilustra en la figura 22B, la zona de intensificacin de li-
sis asume la forma de una punta de flecha en la interseccin de ambas estras.



PRUEBA DE LA CATALASA

FUNDAMENTO: El perxido de hidrgeno se forma como un producto terminal oxida-
tivo de la descomposicin aerbica de los azcares. Si se deja acumular, el perxido de hidr-
geno es txico para las bacterias, por lo que deben tener el enzima catalasa, que lo descompone
a agua y oxgeno.

TECNICA: Seguiremos el mtodo del portaobjetos: Con un asa de platino se recoge una
colonia del cultivo puro y se coloca sobre un portaobjetos.
Se agrega una gota de Perxido de hidrgeno al 30% con una pipeta Pasteur.

RESULTADO +: Inmediata formacin de burbujas por la liberacin de gas.
RESULTADO -: No hay formacin de burbujas.



CITRATO

FUNDAMENTO: Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como
nica fuente de carbono para el metabolismo. El medio utilizado incluye citrato como nica
fuente de carbono y fosfato amnico como fuente de nitrgeno. Las bacterias que metabolicen
el citrato, tambin utilizarn el fosfato amnico, con la consiguiente alcalinizacin del medio.

TECNICA: Se emplea el medio slido Citrato de Simmons, con azul de bromotimol
como indicador de pH: presenta color amarillo en condiciones cidas (pH=6), azul en medio al-
calino (pH=7.6), y verde en el medio no inoculado (pH=6'9). El medio se prepara en pico de
flauta largo, con poca profundidad.
Se inocula nicamente en zig-zag sobre el medio en pico de flauta. Se incuba a 37C 24 a 48
horas, si bien a veces incluso son necesarios 4 das.

RESULTADO +: Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta.
RESULTADO -: No se observa crecimiento ni cambio de color, apareciendo verde.



COAGULASA EN PORTA ("CLUMPING FACTOR")

FUNDAMENTO: Vamos a investigar la capacidad de produccin del enzima coagula-
sa. No se conoce exactamente su mecanismo de accin, aunque va a actuar de alguna forma so-
bre el mecanismo de coagulacin del suero provocando la transformacin de fibringeno en fi-
brina, con la consiguiente formacin del cogulo.
TECNICA: Se emplea normalmente plasma de conejo.
Se coloca una gota estril de plasma de conejo con anticoagulante (EDTA), y se emulsiona en
ella suavemente una suspensin espesa de microorganismos.
Se pueden colocar en el mismo porta microorganismos de control positivo y negativo.



64

RESULTADO +: Se observa la inmediata formacin de un precipitado macroscpico en
forma de aglutinados blancos (grumos).
RESULTADO-: Se considera negativo si no se produce la aglutinacin en 3-4 minutos.


DNAsa

FUNDAMENTO: Empleamos un medio de cultivo cuya caracterstica principal es la de
poseer cido desoxirribonucleico, con objeto de investigar si es hidrolizado por el microorga-
nismo problema, en caso de que posea la enzima desoxirribonucleasa.

TECNICA: Se siembra en el medio Agar DNAsa con una estra central.
Se incuba a 37C - 24 h.
Trs el periodo de incubacin, se inunda la placa con cido clorhdrico 1N.

RESULTADO+: Al aadir el ClH, hace que el ADN existente precipite, produciendo
con ello un enturbiamiento del medio. Es evidente que donde ya no quedaba ADN por
la accin de la DNAsa microbiana, el medio aparecer transparente. Esto suceder en la
zona contigua al crecimiento, indicando con ello que el microorganismo ha hidrolizado
el cido nucleico.
RESULTADO -: El ADN no ha sido despolimerizado, con lo que precipita por el ClH
en toda la placa, y no va a haber zona transparente.


HIDROLISIS DE LA ESCULINA

FUNDAMENTO: la esculina, un glicsido, es hidrolizada por algunas bacterias, dando
como productos de degradacin glucosa y esculetina. La esculetina al reaccionar con el hierro
forma un complejo de color castao oscuro o negro.

TECNICA: se emplea un medio que lleva esculina, y al que se han incorporado sales de
hierro como indicadores de la presencia de esculitina. El microorganismo se siembra por agota-
miento.

RESULTADO +: presencia de color negro/castao oscuro alrededor de las colonias.
RESULTADO -: ausencia de color negro.


DECARBOXILACIN DE AMINOCIDOS
(ARGININA, LISINA Y ORNITINA DECARBOXILASAS)

FUNDAMENTO: Algunas bacterias (p.e. ciertas enterobacterias) poseen unas enzimas
decarboxilasas especficas que son capaces de atacar el grupo carboxilo de determinados ami-
nocidos, produciendo anhdrido carbnico y una amina, o diamina, con la consiguiente alcali-
nizacin del medio. As:
- La lisina decarboxilasa (LDC) produce, a partir de la L-lisina, cadaverina.
- La ornitina decarboxilasa (ODC) produce putrescina.
- El aminocido L-arginina posee un sistema especial de transformacin: primero por
accin de una descarboxilasa se transforma en un producto intermedio, la agmatina,
la cual, por una Arginina dehidrolasa (ADH) pasa a putrescina y urea. Si el micro-
organismo es productor de ureasa transformar a su vez la urea en amoniaco y anhdrido
carbnico.



65

TECNICA: Se emplea un medio de cultivo con glucosa (medio Moeller), que incorpora el ami-
nocido en cuestin (arginina, lisina u ornitina). Utilizamos como indicador el prpura de bro-
mocresol, amarillo en medio cido y prpura en medio alcalino. Cuando el medio se inocula con
una bacteria capaz de fermentar glucosa, se produce cido que baja el pH del medio y cambia el
color del medio del prpura al amarillo. La condicin cida estimula la actividad decarboxila-
sa y si el organismo produce la enzima apropiada (descarboxilasa), el aminocido es degradado
a su correspondiente amina. La formacin de estas aminas (cadaverina o putrescina), eleva el
pH del medio y hacen que el indicador de pH vuelva a la alcalinidad, cambiando el color del in-
dicador del medio de amarillo a prpura o violeta. Si el organismo no produce la enzima apro-
piada, el medio permanece cido (amarillo).

Se inocula el medio de cultivo, y se cubre con 1-2 ml de parafina estril (para favorecer
las condiciones de fermentacin). Se incuba a 37C-24h.

RESULTADO +: color prpura turbio a prpura apagado.
RESULTADO -: color amarillo claro y brillante.









PRUEBA DE LA HIDRLISIS DE LA ARGININA

La L-arginina, adems de poder ser catabolizada por una decarboxilasa, puede ser direc-
tamente transformada por una hidrolasa con el mismo final anterior, la produccin de alcalini-
dad por formacin de aminas, aunque los compuestos intermedios sean distintos. Esta transfor-
macin la pueden llevar a cabo ciertos microorganismos, como por ejemplo, estreptococos y
bacterias relacionadas. As, la L-arginina, por accin de arginina dehidrolasa, produce L-
citrulina y amoniaco. Esta prueba no debe ser confundida con la ADH descrita en la prueba an-
terior.

FUNDAMENTO: Se trata de detectar la hidrlisis de la arginina mediante la enzima
que transforma este aminocido en citrulina, con liberacin de amoniaco.

TECNICA: Se inocula un tubo de caldo-arginina y se incuba junto a un tubo testigo
estril durante 24 h (en ocasiones 2-7 das). Transcurrido este tiempo se deposita una gota del
cultivo sobre un portaobjetos y se aade una gota del reactivo de Nessler, que reacciona con el
amoniaco. El desarrollo de un color entre anaranjado y marrn, indica la presencia de amoniaco.
El tubo estril que sirve de control debe ensayarse al mismo tiempo y debe ponerse de color
amarillo plido o no mostrar ninguna reaccin coloreada.

RESULTADO +: Color anaranjado-marrn.
RESULTADO -: Color amarillo plido o ausencia de color.





Arginina
Agmatina
Putrescina
+
Urea
DC DH
Arginina Decarboxilasa
Arginina
L-citrulina
+
Amoniaco
Arginina Dehidrolasa
DH


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GALACTOSIDASA (ONPG)

FUNDAMENTO: Existen microorganismos con capacidad para degradar la lactosa en
3-4 das, y no en 24 horas. Estos son los denominados "fermentadores tardos de la lactosa". En
este grupo de microorganismos podemos predecir la facultad de fermentar la lactosa demostran-
do la presencia o ausencia de actividad Galactosidasa mediante el empleo del compuesto org-
nico Orto- nitrofenil--D-Galactopiransido (ONPG), con un enlace similar al de glucosa - ga-
lactosa existente en la lactosa. Si se encuentran clulas positivas para la metabolizacin activa
de la lactosa, el reactivo ONPG incoloro es hidrolizado liberando un compuesto amarillo, el Or-
to-Nitrofenol.

TECNICA: Se siembra en un tubo con aproximadamente 2 ml de solucin Ringer. Se
aade el disco reactivo de ONPG.
Se incuba a 37C - 24 h.

RESULTADO +: se produce el cambio de color a amarillo.
RESULTADO -: continua incoloro.


HIDROLISIS DEL HIPURATO

FUNDAMENTO: La hipuricasa es una enzima que produce la hidrlisis del hipurato de
sodio, con la formacin de benzoato de sodio y glicina.

TECNICA: Se inocula un caldo hipurato con el organismo por investigar, y se incuba
durante 20-24 horas. Posteriormente se traspasan 0,8 ml de la parte superior del cultivo a un tu-
bo vaco y se aaden a ste 0,2 ml del reactivo cloruro frrico y se mezcla bien. El cloruro frri-
co precipita protenas, hipurato y benzoato; sin embargo, las protenas y el hipurato se disuelven
ms fcilmente en exceso de reactivo. Por lo tanto, la persistencia de un precipitado en el caldo
hipurato tras aadir un exceso de cloruro frrico indica la presencia de benzoato y, por tanto,
una prueba positiva de hidrlisis de hipurato.

RESULTADO +: Presencia de un precipitado en el fondo del tubo.
RESULTADO -: Ausencia de precipitado.


INDOL

FUNDAMENTO: Por la degradacin del triptfano se libera indol, cido pirvico,
amoniaco y energa. Ese indol puede ser detectado por el empleo de determinados reactivos que
dan una reaccin de color.

TECNICA: Se emplea un medio con triptfano.
Incubacin a 37C - 24 h.
Con objeto de visualizar el indol formado debemos aadir 5 gotas del reactivo de Ko-
vacs, directamente al tubo ya incubado, y se agita suavemente. Cuando existe indol, ste se
combina con el aldehido que se encuentra en el reactivo de Kovacs, para dar un color rojo en la
capa de alcohol del reactivo de Kovacs.

RESULTADO +: Anillo de color rojo en la superficie del medio.
RESULTADO -: Anillo del color del Reactivo de Kovacs (ocre oscuro).




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AGAR KLIGLER

FUNDAMENTO: Determinar la capacidad de un organismo de utilizar los hidratos de
carbono glucosa y lactosa incorporados a un medio de crecimiento, con produccin o no de ga-
ses, junto con la posible produccin de cido sulfhdrico.
Se utiliza un medio de agar inclinado que contiene dos hidratos de carbono: Lactosa en una con-
centracin al 1% y Glucosa al 0'1%. Algunos microorganismos utilizarn ambos azcares, otros
solo la glucosa y otros ni glucosa ni lactosa. La utilizacin puede ser con produccin o no de ga-
ses, y se producir aerbicamente (en el pico de flauta) y anaerbicamente (en el fondo del tu-
bo). Por tanto, los resultados que pueden obtenerse sern los siguientes:

1 Utilizacin slo de la glucosa: Aparecer el pico de flauta alcalino y la capa profunda
cida. El pico de flauta es alcalino (color rojo), lo que indica que se ha producido la degradacin
aerbica de la glucosa. Despus de 18-24 h de incubacin, la baja concentracin de glucosa
(0'1%) ha sido consumida por completo y el organismo comienza a utilizar las peptonas del me-
dio con objeto de obtener los nutrientes precisos para su crecimiento. Sin embargo, en la capa
profunda se observa un color amarillo debido a la degradacin anaerbica de la glucosa, ms
lenta que la aerbica, dando lugar a productos cidos ms estables que hacen que el pH perma-
nezca cido a las 24 h.
Por tanto, si la lectura se efectuara a las 12 h, aparece color amarillo en todo el tubo. Si
la lectura se efectuara a las 48 h, aparecera color rojo en todo el tubo.

2 Utilizacin de glucosa y lactosa: Como hemos mencionado anteriormente, la lactosa
se encuentra en el medio en una concentracin del 1%, es decir, 10 veces ms que la glucosa.
Esto hace que en 24 h se habr consumido aerbicamente la glucosa, pero no toda la lactosa,
momento en que se iniciara el consumo de peptona, existiendo por tanto todava una condicin
cida. Si este tubo se leyera a partir de las 48 h, el pico de flauta se habra vuelto alcalino por
depleccin de la lactosa y consiguiente utilizacin de las peptonas.

3 No utilizacin ni de glucosa ni de lactosa. Como estas bacterias son incapaces de to-
mar sus nutrientes de los hidratos de carbono, acuden a la peptona que contiene el medio. Si la
utilizan tanto anaerbica como aerbicamente, todo el tubo aparece de color rojo. Si solo la uti-
lizan aerbicamente , el pico de flauta aparece alcalino y el resto sin cambios.

En resumen, con respecto a los azcares, el agar Kligler puede interpretarse de 4 mane-
ras, teniendo en cuenta que el primer trmino corresponde al pico de flauta y el segundo al fon-
do del tubo:

1. Alcalina/Acida (Rojo/Amarillo): Solamente es utilizada la glucosa.
2. Acida/Acida (Amarillo/Amarillo): Son utilizadas la glucosa y la lactosa.
3. Alcalina/Alcalina (Rojo/Rojo): No es utilizada la glucosa ni la lactosa. Se uti-
lizan las peptonas.
4. Alcalina/Sin cambio (Rojo/Granate): No son utilizadas glucosa ni lactosa. Se
utilizan las peptonas aerbicamente.

Adems de estas reacciones, podemos investigar la aparicin de gas como producto
terminal del metabolismo de los hidratos de carbono. Dicho gas aparecer en forma de burbujas
en el fondo del tubo, que pueden llegar incluso a desplazar al medio de cultivo.

Tambin podemos investigar la produccin de sulfhdrico en el medio. Para ello el me-
dio contiene 2 indicadores: citrato frrico amnico y tiosulfato de sodio. En principio la bacteria
reacciona con el tiosulfato para dar lugar a sulfhdrico, que es incoloro. ste despus reacciona
con iones frricos, dando lugar a sulfuro ferroso, que da un precipitado negro insoluble.



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TECNICA: La inoculacin se hace a partir de una colonia de cultivo puro, inoculando
en zig-zag en el pico de flauta y por picadura en la capa profunda (figura 23).
Se incuba a 37C de 18-24 h, ni antes ni despus.

RESULTADOS: El orden en que deben ser leidas las pruebas es: 1 Glucosa; 2 Lacto-
sa; 3 Gas; 4 Sulfhdrico. Ejo: G+L-G+SH-.
Glucosa +: color amarillo en el fondo del tubo.
Glucosa -: color rojo en el fondo del tubo.
Lactosa +: color amarillo en el pico de flauta.
Lactosa -: color rojo en el pico de flauta.
Gas +: aparicin de burbujas en el medio, incluso con desplazamiento del mis-
mo del fondo del tubo.
Gas -: no se aprecian burbujas.
SH
2
+: color negro en la capa profunda.
SH
2
-: no se aprecia color negro.

LECITINASA

FUNDAMENTO: Determinar la presencia del enzima lecitinasa. Para ello empleamos
un medio rico en lecitina, como pueda ser un medio nutritivo enriquecido con yema de huevo.

TECNICA: Se siembra en placa haciendo una doble estra central, como en el caso de la
DNAsa.
Incubacin a 37C - 24 a 48 h.

RESULTADO +: Se formar un halo ms claro alrededor de la zona de crecimiento mi-
crobiano debido a la degradacin de la lecitina por el microorganismo.
RESULTADO-: No existe halo opaco alrededor de la zona de crecimiento microbiano.

MOTILIDAD

FUNDAMENTO: Queremos investigar si un microorganismo es mvil o no. Para ello
se emplea un medio semislido (con Agar al 0'2%), en el que la bacteria mvil difunda lo ms
rpidamente posible.

TECNICA: La inoculacin se debe hacer por picadura en el centro del medio de cultivo
con el asa de picadura hasta una profundidad de 1,2 a 1,5 cm.
Incubacin a 22C a 37C - 24 h.

RESULTADO +: Aparece una turbidez que se difunde por todo el tubo.
RESULTADO -: Se produce una lnea de crecimiento limitada a seguir la lnea de
siembra, mientras que el medio que la rodea se mantiene claro.

NITRATOS

FUNDAMENTO: Determinar la capacidad de un organismo de reducir el Nitrato a Ni-
tritos o N
2
libre. Este proceso de reduccin tiene lugar generalmente en condiciones anaerbi-
cas, en las cuales el microorganismo obtiene el Oxgeno del Nitrato.

TECNICA: Empleamos el medio caldo con nitrato, distribuido a razn de 2 ml por tubo.
Se inocula y se incuba a 37C - 24 h.
Antes de hacer la interpretacin debemos aadir los reactivos al medio: 1 ml de -naftol
y 1 ml de acido sulfanlico.


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RESULTADO +: color rosado a rojo intenso, lo que indica la presencia de nitritos en el
medio por reduccin de los nitratos. Es decir, estos colorantes detectan la presencia de
nitritos en el medio.

En caso de que no se desarrolle color, no damos la reaccin negativa, pues nicamente
indica que no hay nitritos en el medio, pero pudo haberlos, y haber pasado a nitrgeno libre por
la accin del microorganismo. Para ello se utiliza el mtodo de reduccin por el zinc, aadiendo
directamente al tubo una pizca (20 mg) de polvo de zinc, que producira el paso de nitratos a ni-
tritos en caso de que el microorganismo no lo hubiera hecho anteriormente.
RESULTADO +: Si no se desarrolla color es porque haba ausencia de nitritos en el
medio. Es decir, el microorganismo redujo el nitrato a nitrito, y luego redujo nuevamen-
te el nitrito, que por ello ha desaparecido.
RESULTADO -: color rosado a rojo intenso: el nitrato presente no ha sido reducido por
el organismo, sino que ha sido el zinc el que lo ha reducido.


PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION DE LA GLUCOSA

FUNDAMENTO: La fermentacin es un proceso en que el aceptor final de electrones
es un compuesto orgnico, que proviene de la propia degradacin del substrato inicial.
La respiracin es un proceso en que el oxgeno es el aceptor final de electrones.
El hecho de que la fermentacin sea un proceso anaerbico no implica en absoluto que
no pueda desarrollarse en presencia de oxgeno: las bacterias disponen de l, pero no lo utilizan
para degradar la glucosa.

TECNICA: Se inoculan 2 tubos de caldo glucosado con indicador de pH (rojo fenol),
que en condiciones bsicas es rojo mientras que a pH cido es amarillo. Uno de ellos se cubre
con 1- 2 ml de parafina fundida estril con objeto de conseguir condiciones de anaerobiosis.
Se incuba a 37C durante 24 a 48 h.

RESULTADO +: viraje del indicador dando color amarillo del medio que indica acidi-
ficacin por degradacin de la glucosa:
a) Si es en los 2 tubos: Fermentacin.

OXIDASA

FUNDAMENTO: La prueba de la oxidasa est basada en la presencia en la bacteria del
enzima citocromo oxidasa.

TECNICA: Empleamos un bastoncillo estril, uno de cuyos extremos est impregnado
con un reactivo (N,N,N',N'-tetrametil -p-phenilenediamina dihydrochloride). Este extremo del
bastoncillo se pone en contacto con una colonia del microorganismo y se esperan unos minutos.

RESULTADO +: Las colonias que producen citocromo oxidasa hacen que el reactivo
pase a un color prpura oscuro.
RESULTADO -: No se produce cambio de color del reactivo.


ROJO DE METILO

FUNDAMENTO: Se trata de una prueba para detectar la produccin de cidos fuertes
(lctico, frmico y actico) a partir de la fermentacin "cido-mixta" de la glucosa. Se conside-
ran rojo de metilo positivos slo aquellos microorganismos que puedan mantener un pH cido


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bajo, tras una incubacin prolongada (24-48 h) contrarrestando el sistema estabilizador de pH
del medio. Se basa simplemente en el empleo de un indicador de pH (Rojo de Metilo) para de-
terminar la concentracin de iones Hidrgeno (pH) presentes cuando un organismo degrada la
glucosa.

TECNICA: Tras la inoculacin en caldo glucosafosfato, se incuba a 37C - 24 h.
Despus de la incubacin, para llevar a cabo la interpretacin, se aade el reactivo Rojo
de metilo: unas 5 gotas. El resultado se interpreta inmediatamente: con un pH inferior a 4'4 el
reactivo permanece rojo, y con un pH superior a 6 vira a color amarillo. Con un pH entre 5 y 5'8
se producen diferentes tonalidades de anaranjado.

RESULTADO +: color rojo del medio.
RESULTADO -: color amarillo o cobrizo en la superficie del medio.

UREA

FUNDAMENTO: La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la
descomposicin de los compuestos orgnicos. Por su accin desdobla la urea, liberando 2 mol-
culas de amoniaco.
Empleamos un indicador de pH, el rojo fenol, con color amarillo en medio cido y ro-
sado en medio alcalino.

TECNICA: Se emplea un medio agar base con un 20% de urea. Hay que tener la pre-
caucin de no calentar, pues la urea se descompone con el calor. Por ello, este medio se debe es-
terilizar por filtracin.
Se incuba a 37C - 24h.

RESULTADO +: color rojo rosado del medio, que indica alcalinizacin por el amonia-
co tras el desdoblamiento de la urea.
RESULTADO -: color amarillo anaranjado del medio.


VOGES PROSKAUER (Prueba de la Acetona)

FUNDAMENTO: Esta prueba bioqumica permite determinar la presencia de ace-
til-metil-carbinol en los cultivos. Este compuesto es un producto final neutro derivado del meta-
bolismo de la glucosa, concretamente de una fermentacin particular, denominada butileno-
gliclica, la cual predomina en ciertas bacterias.

TECNICA: Inoculacin con un inculo poco denso en caldo glucosa fosfato. Se incuba
a 37C durante 24-48 horas.
Una vez finalizado el periodo de incubacin y para proceder a la lectura de la prueba bioqumi-
ca, se aaden los reactivos:
1 En primer lugar, 0'6 ml de una solucin de -naftol al 5% en alcohol etlico absoluto,
que actuar como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reaccin sin
prdida de su especificidad.
2 Despus se aaden 0'2 ml de una solucin alcalina (KOH al 40% o NaOH al 40%).
Este lcali, en presencia de acetil-metil- carbinol se oxida a diacetilo, dando un color rosa-
do-salmn.
A continuacin debe agitarse suavemente el tubo, dejndolo reposar durante 10-15 mi-
nutos antes de interpretar la reaccin.

RESULTADO +: color rojo-rosado en la superficie del medio (presencia de acetoina).
RESULTADO -: no existe cambio de color.


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S SU UP PU UE ES ST TO O P PR RA AC CT TI IC CO O

* Durante la segunda semana de prcticas cada equipo de trabajo (2 personas)
tendr que aplicar los conocimientos adquiridos en la primera semana para identificar
los distintos microorganismos de una muestra clnica.

* Los microorganismos presentes en la muestras no tienen que ser necesaria-
mente los mismos de la primera semana de prcticas, pero a cuya identificacin se
podr llegar a travs de las tablas del guin de prcticas.

* A lo largo de la segunda semana se podr solicitar al profesor de prcticas to-
dos los medios de cultivo, reactivos y pruebas bioqumicas que se consideren necesarias
para la identificacin de los microorganismos.

* Se elaborar un cuaderno de trabajo en el que se justificar y razonar cada
uno de los pasos seguidos, as como la interpretacin que se da a cada uno de ellos y el
resultado obtenido.

* La calificacin final ser individual para cada alumno.