118

La Catlisis Enzimtica
Introduccin Se denominan enzimas a los catalizadores biolgicos. Esta sentencia que parece ser trivial cobra importancia cuando se tiene en cuenta que una parte significativa de la organizacin biolgica recae sobre la denominada funcin enzimtica. Conceptualmente lo anterior se traduce en que buena parte de la historia de la bioqumica es tratada al estudiar la historia de las reacciones enzimticas. La historia Los primeros estudios sistemticos sobre los enzimas se realizaron en los primeros aos del siglo XIX al tratar de comprender los procesos digestivos. Sin embargo es solo hasta 1850 cuando Pasteur plante que la fermentacin del azcar hasta el alcohol se da por medio de unos fermentos presentes en las levaduras, cuando se fortalece el paradigma bioqumico. Paradjicamente como consecuencia de las interpretaciones de los estudios realizados, Pasteur consider que los fermentos eran inseparables de las clulas vivas aplicando una interpretacin vitalista. Para 1897 E. Buchner logr separar los fermentos del material vivo obteniendo alcohol y de paso contradijo de manera contundente la sentencia vitalista de Pasteur. James Sumner en 1926 aisl y cristraliz la ureasa y el anlisis qumico permiti deducir que se trataba de un material exclusivamente proteico, postulando entonces que todos los enzimas eran protenas. Esta sentencia que result polmica fue aceptada despus de que se aislaron la pepsina y tripsina. Hoy se considera que con excepcin de un pequeo grupo de RNA, la naturaleza de los enzimas es proteica y las estructuras (primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria-si existe-) son esenciales para que los enzimas tengan actividad cataltica. Generalidades El peso molecular en los enzimas puede fluctuar entre 12000 hasta ms de 1 milln, algunos no requieren de otros tipos de grupos qumicos para ser activos mientras que otros requieren para su actividad de la presencia de un componente qumico adicional al que se denomina cofactor. La tabla y figura siguientes resumen la descripcin y clasificacin de enzimas y cofactores. Es as como se denominan coenzimas a complejos orgnicos u organomentlicos que son necesarios para que se d la actividad enzimtica. En algunos
Simples Solo protena Fraccin Proteica (apoenzima) Complejas (holoenzima) Cofactor Enzima
Si el cofactor est unido covalentamente a la fraccin proteica se denomina grupo prosttico

Proteica

Cofactor

iones Compuesto Orgnico

Coenzima Complejos Organometlicos

No Proteica

RNA

119 casos se requiere la presencia tanto de coenzima como de otro cofactor. Si la coenzima o el ion metlico estn covalentemente unidos a la parte proteica del enzima se denomina grupo prosttico. El sistema completo y catalticamente activo se denomina holoenzima, mientras que la parte proteica del enzima se denomina apoenzima o apoproteina. Clasificacin Los enzimas han sido incluidos en 6 diferentes grupos segn los tipos de reacciones que catalizan y se resumen la tabla 12-2. Tabla 12-2

Para clasificar un enzima se recurre a dos hechos taxonmicos: El nombre sistemtico y el nmero de clasificacin. Por ejemplo, para la reaccin: ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa 6-fosfato Nombre sistemtico: ATP: glucosafosfotransferasa (indica que se transfiere un grupo fosforilo desde el ATP hasta la glucosa) Nmero de la Comisin Enzimtica (E.C. number): Nmero de cuatro dgitos donde: Dgito 1: Indica la clase del enzima (ver tabla 12-2) Dgito 2: Indica la subclase. Dgito 3. Indica el grupo (sustituyente) involucrado en la reaccin. Dgito 4. Indica el tipo de molcula sobre la que se opera en la reaccin. As para el enzima considerado en el ejemplo anterior el nmero sistemtico es: E.C. 2.7.1.1

120 Cintica enzimtica Como se deduce del sistema de clasificacin, cada enzima presenta puntos crticos o regiones geogrficas que son determinantes en su actividad qumica. En consecuencia, la regin ms trascendental en el enzima, para ejercer la funcin cataltica se denomina centro activo y se asocia a una hendidura o fisura (ubicada sobre la superficie del enzima) que se considera como complementaria topolgicamente al sustrato. En este centro activo transcurre la catlisis por la interaccin fsica entre sustrato y enzima. Esta unin puede originar modificaciones estructurales tanto en el enzima como en el sustrato. En la figura siguiente se presenta un esquema del sitio activo y de los aminocidos involucrados.
Los aminocidos en el centro activo se clasifican como: Aminocidos catalticos (identificados por la letra C), directamente implicados en los cambios covalentes del sustrato durante la reaccin enzimtica y que estn ubicados en el centro C. Aminocidos de especificidad o contacto (e1, e2 ), participan en la unin del sustrato al enzima, pero no intervienen en cambios covalentes (en el centro F). Aminocidos de conformacin, no estn relacionados con el proceso cataltico directamente, pero son necesarios para el mantenimiento de la estructura tridimensional del enzima.

En el transcurso de una reaccin enzimtica operan transformaciones que se resumen en las figuras siguientes; en las que se plantean de manera esquemtica los conceptos enzimticos ms representativos. As en la parte izquierda se comparan energticamente las reacciones catalizadas y no catalizas. Posteriormente se compara la reaccin enzimtica al representar los sitios activos y finalmente en la pgina siguiente se relaciona la constante de equilibrio con la energa libre estndar para reacciones especficas y las ratas de incremento para reacciones catalizadas enzimticamente.

121

Se han descrito diferentes aproximaciones a la interaccin enzima-sustrato entre los cuales vale la pena destacar: Modelo llave-cerradura, ajuste inducido, modelo de compresin y de distorsin. Todas estas interacciones se presentan en la figura siguiente.

Modelos para la interaccin enzima-sustrato

Llave y cerradura S S E E E S

Ajuste inducido

S E

Compresin S S E E S

Distorsin

S E E

122 Deduccin de la Ecuacin de Michaelis-Menten Una reaccin enzimtica puede escribirse como:

Donde E, S y P representan el enzima, el sustrato y el producto respectivamente. Un grfico que resume la evolucin cintica de las reacciones enzimticas se presenta a continuacin.

A partir del esquema anterior y de los correspondientes equilibrios se tiene que la velocidad de catlisis es funcin de [ES] y k3 V = k3 [ES] La formacin de [ES] = k1 [E][S] La desaparicin de [ES] = (k2 + k3 )[ES] En el estado estacionario [ES] es cte. d[ES]/dt = 0 y adems se dan dos condiciones: 1) Las concentraciones de los intermedios no cambian 2) Las concentraciones de sustrato y producto varan

Segn lo anterior se pueden igualar la formacin y desaparicin del complejo [ES]

k1 [E][S] = (k2 + k3 )[ES] Dividiendo por k1 y despejando [ES], se tiene que [E] [S] [ES] = k2+k3/k1 KM = k2 + k3 k1

123 [E] [S] KM Redefiniendo [E] tenemos que [E] = [ET]-[ES] y al sustituir en la ecuacin se obtiene que: ([ET]-[ES]) [S] [ES] = KM Reagrupando KM [ES] = ([ET]-[ES]) [S]

[ES] =

Resolviendo para [ES] se obtiene [S] [ES] = ET [S] + KM

Reemplazando [ES] en la ec. de velocidad [S] V = k3 ET [S] + KM

V max. se da cuando el enzima est saturado. Esto es [S]/[S]+KM se aproxima a 1 Vmax = k3ET Al sustituir se obtiene la ec. de Michaelis-Menten [S] V= Vmax [S] + KM

Si [S]>>>KM entonces se igualan las velocidades Si [S] = KM entonces V = Vmax/2

124 La ecuacin de Michaelis-Menten puede transformarse hasta obtener una lnea recta que corresponde a un doble recproco que se denomina Lineweaver-Burk y que se presenta en el grfico siguiente

Al realizar una aproximacin ms detallada a las constantes de equilibrio que estn definidas en el proceso enzimtico, el complejo enzima-sustrato puede ser transformado de tal manera que se obtienen dos condicines: Una primera situacin en la que el complejo ES es similar al sustrato. Una segunda circunstancia donde el complejo se asemeja al producto.

Bajo esta nueva consideracin las constantes de equilibrio se tranforman hasta obtener la siguientes condiciones:

E+S

k1 k-1

ES

k2 k-2

EP

k3

E+P

Esta nueva aproximacin al equilibrio permite definir al kcat que est determinada por k3 . La constante kcat o nmero de produccin o recambio es equivalente al nmero de moleculas de sustrato convertidas en molculas de producto por unidad de tiempo mediante una molcula de enzima cuando se tiene el enzima saturado. La tabla siguiente presenta los parmetros km y kcat tpicos de algunos enzimas.

En esta nueva condicin la ecuacin de Michaelis-Menten queda de la forma:

Vo =

kcat [Et][S] km + [S]

Si se tiene la condicin cintica de que [S]<< km la ecuacin anterior se transforma en:

125

Vo = kcat km

[Et][S]

El factor kcat/Km es el mejor parmetro cintico para comparar la eficiencia cataltica. En la tabla siguiente se presenta un resumen de este factor reportado para diferentes enzimas.

Las reacciones enzimticas estn condicionadas en su actividad por factores ambientales tales como pH y temperatura. En este sentido la catlisis debe operarse en las condiciones ms apropiadas para el enzima. En la figura siguiente se presenta un esquema del efecto que sobre la actividad enzimtica tienen las variables pH y Temperatura. Las valoraciones enzimticas emplean trminos De sna especficos entre los que se tur ali pueden destacar: za v
t opt.

ci n

tr

mi ca

pH
Efecto del pH sobre la conformacin del enzima

t + NH3 .. NH2- H .. NH2 COO-

+ NH3

- H+ + H+

+ NH3

- H+ + H+

- H+ + H+

COOH

COOH

COO-

COO-

+ H+

1. Unidad de enzima (U, mU, KU): Cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1mol por minuto en condiciones normalizadas. 2. Actividad especfica (U/mg prot): Unidades de enzima en trminos de la protena. 3. Kacal (kat): Cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato por segundo.

1 kat = 6 x 107 U 1U = 16,67 nkat (nanokatales)

126 Inhibicin Enzimtica Una caracterstica importante de las reacciones enzimticas es la interaccin con sustancias diferentes al sustrato y que conducen a la alteracin de los parmetros cinticos que cualifican la reaccin. En consecuencia, un inhibidor es cualquier ligando que se une al enzima reversible o irreversiblemente (esta ltima condicin tambin denominada inactivacin) disminuyendo la velocidad de reaccin o bloqueando la catlisis. La inhibicin enzimtica se puede entender como la disminucin en la capacidad cataltica de un enzima y se clasifica en dos grandes grupos: 1. 2. Inhibicin reversible. Denominada as porque al eliminar el inhibidor el enzima recupera su actividad normal. Inhibicin irreversible. Est mediada por la unin covalente entre enzima e inhibidor, quedando el enzima modificado sin posibilidad de regeneracin.

La inhibicin reversible a su vez se subdivide en: Inhibicin Competitiva. El enzima se une al sustrato o al inhibidor (ES o EI) en el mismo espacio molecular (sitio activo). En consecuencia se tiene una COMPETENCIA que se evidencia experimental en el aumento en el Km. Inhibicin no Competitiva (mixta). El inhibidor no se fija al enzima en el sitio activo. Tanto el inhibidor como el sustrato se unen al enzima formando un complejo terciario. La evidencia experimental es la disminucin de la velocidad mxima. Inhibicin incompetitiva. En este caso el competidor se une al complejo ES.

127 Mecanismos Catalticos (tomado de voet y voet) La catlisis es un proceso en el que se aumenta la velocidad sin afectar el equilibrio. Tal como se discuti, la velocidad de una reaccin es funcin de la energa libre de activacin y un catalizador acta rebajando la altura de esta barrera cintica. Es decir, un catalizador estabiliza el estado de transicin con respecto a la reaccin sin catalizar. En muchos casos, no hay nada especial en los mecanismos de catlisis enzimticos en comparacin con los mecanismos no enzimticos. Al parecer, existen dos propiedades relacionadas que hacen que los enzimas sean unos catalizadores tan poderosos: Su especificidad en la fijacin de sustrato, combinada con una conformacin ptima de sus grupos catalticos. La conformacin de los grupos catalticos y de fijacin de un enzima, es el producto de eones de evolucin y por tanto se tiene que la naturaleza ha tenido muchas oportunidades para afinar las funciones de los enzimas. Los tipos de mecanismos catalticos por los cuales operan los enzimas se han clasificado en: 1. Catlisis cido-base 2. Catlisis covalente 3. Catlisis por iones metlicos 4. Catlisis electrosttica Adicionalmente dos hechos han sido considerados como definitivos para el entendimiento de los mecanismos enzimticos: 1) Los efectos de proximidad y orientacin y 2) La fijacin preferencial del complejo del estado de transicin En esta seccin, se examinan estos diversos fenmenos, haciendo referencia a los modelos orgnicos que sustentan conceptualmente estos mecanismos. 1. Catlisis cido-base La catlisis cida general es un proceso en el que la transferencia parcial de un protn desde un cido de Bronsted (especie que puede donar protones) disminuye la energa libre del estado de transicin de una reaccin. Por ejemplo, una reaccin de tautomerizacin cetoenol tiene lugar de manera muy lenta debido a la elevada energa de su estado de transicin, tipo carbanin (Ver figura). La cesin de un protn al tomo de oxgeno, sin embargo, reduce el carcter de carbanin del estado de transicin, catalizando por consiguiente la reaccin. De otro lado, una reaccin tambin puede realizarse por catlisis bsica general si su velocidad aumenta debido a la abstraccin parcial de un protn por una base de Bronsted (especie que se puede combinar con un protn). Algunas reacciones pueden estar sujetas simultneamente a ambos procesos: reaccin con catlisis cido-base general concertada. La mutarrotacin de la glucosa proporciona un ejemplo instructivo de

128 catlisis cido-base. Recurdese que una molcula de glucosa puede adoptar cualquiera de las dos formas anomricas cclicas, a travs de una forma lineal intermedia. En disolventes acuosos, se observa que la velocidad inicial de mutarrotacin de la -D-glucosa, tal como se sigue por polarimetra, cumple una relacin cuya constante de velocidad es de primer orden. La velocidad de mutarrotacin aumenta con la concentracin de cidos y bases. Se ha postulado que ambos catalizan la mutarrotacin segn el mecanismo que se describe a continuacin.

En la catlisis es determinante como se identifica el sustrato que acta como base o como cido en una reaccin. La figura siguiente ilustra como se reconoce cada caso.

129

Muchos tipos de reacciones de importancia bioqumica son susceptibles de catlisis cida y bsica. Entre ellas, se cuentan la hidrlisis de pptidos y de steres, las reacciones del grupo fosfato, tautomerizaciones y adiciones de grupos carbonilo. Las cadenas laterales de los restos de aminocidos Asp, Glu, His, Cys, Tyr y Lys tienen valores de pK en o cerca del intervalo de pH fisiolgico lo que, como se ver, les permite actuar en la capacidad enzimtica de catalizadores cidos o bases generales de forma anloga a los mecanismos orgnicos conocidos. Evidentemente, la capacidad de los enzimas para situar varios grupos catalticos alrededor de sus sustratos hace que la catlisis cido-base concertada sea un mecanismo enzimtico comn. La reaccin de la RNAsa A representa un muy buen ejemplo de la catlisis cido-base general. Este enzima gobierna la hidroliza del RNA a sus nucletidos constituyentes. La reaccin supone un proceso de dos etapas donde la primera involucra la His 12 que acta como una base general al abstraer un protn del carbono 2'-OH situado en el RNA. Este ataque promueve un ataque nucleoflico sobre el grupo fosfato adyacente. La His 119 por su parte acta como un cido general al incidir sobre la rotura del enlace por protonacin del grupo saliente. El intermedio 2',3'-cclico que se forma es rpidamente hidrolizado por lo que podra considerarse el proceso inverso, con la excepcin de que el agua reemplaza al grupo saliente. En resumen, la His 12 acta como un cido general y la His 119 acta como una base general.

130 En la tabla siguiente se refieren los aminocidos que pueden actuar como cidos o bases en la catlisis enzimtica.
Aminocido Acido General (donador de protones) Base General (aceptor de protones)

2. Catlisis covalente La catlisis covalente implica que la disminucin en la energa de activacin est mediada por la formacin transitoria de un enlace covalente entre el enzima y el sustrato. La descarboxilacin del acetoacetato, catalizada qumicamente por aminas primarias se constituye en un muy buen ejemplo de tal proceso, tal y como se muestra en la figura siguiente. La primera parte de la reaccin implica que la amina ataca nucleoflicamente el grupo carbonilo del acetoacetato, formando entonces una base de Schiff (enlace imino). El tomo de nitrgeno del intermedio acta como fuente de electrones. La base de schiff puede formarse o descomponerse rpidamente y por tanto determina la velocidad de reaccin. La catlisis covalente tiene tanto pasos nucleoflicos como electroflicos y por tanto la catlisis covalente se puede descomponer conceptualmente en dos pasos: l. La reaccin nucleoflica entre el catalizador y el sustrato para formar un enlace covalente. 2. La eliminacin de electrones del centro de reaccin por el catalizador que, ahora es electroflico. Los mecanismos de reaccin covalente se clasifican, de manera algo arbitraria en catlisis nucleoflica o catlisis electroflica, segn cul de estos efectos proporciona una mayor fuerza propulsora a la reaccin, es decir, cul de ellas cataliza la etapa determinante de velocidad. La descarboxilacin del acetoacetato catalizada por aminas primarias es una reaccin de catlisis electroflica ya que su fase nucleoflica -formacin de la base de Schiff- no es la etapa limitante de velocidad. No obstante, en otras reacciones catalizadas covalentemente la fase nucleoflica puede ser la determinante de velocidad.

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La nucleofilicidad de una sustancia est estrechamente relacionada con su basicidad. Desde luego que el mecanismo de la catlisis nucleoflica se parece al de la catlisis bsica general, con la excepcin de que, en lugar de abstraer un protn del sustrato, el catalizador ataca nucleoflicamente el sustrato para formar un enlace covalente. Por consiguiente, si la formacin del enlace covalente es la etapa determinante de velocidad de una reaccin catalizada covalentemente, la velocidad de reaccin tiende a aumentar con la basicidad del catalizador covalente (pK). Un aspecto importante de la catlisis covalente es: Cuanto ms estable es el enlace formado, con menor facilidad se descompondr en las etapas finales de la reaccin. Un buen catalizador covalente debe combinar, por tanto, las aparentemente contradictorias propiedades de alta nucleofilicidad y la capacidad de formar un buen grupo saliente, es decir, revertir fcilmente el paso de formacin del enlace. Los grupos con elevado grado de polarizacin (electrones muy mviles), tales como las funciones imidazol y tiol, poseen estas propiedades y de ah que sean buenos catalizadores covalentes. La Quimotripsina es una proteasa ampliamente estudiada en lo referente al mecanismo de reaccin. Se considera como un mecanismo mixto entre catlisis acido-base general y catlisis covalente. El mecanismo general se presenta en el esquema siguiente. El mecanismo detallado de la hidrlisis del enlace peptdico plantea que el sustrato se ubica en el sitio activo del enzima y la reaccin est dividida en dos partes: En la primera (que comprende las etapas 1-3) se da la formacin del enlace covalente temporal entre el enzima y el sustrato denominandose fase de acilacin. Las etapas 4-7 corresponden a la fase de desacilacin, al final de la cual se recupera el enzima libre.

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133 3. Catlisis por Iones Metlicos. Aproximadamente una tercera parte de las actividades enzimticas funcionan por la mediacin de iones metlicos. Los enzimas que requieren presencia de iones para su funcionamiento se pueden clasificar en dos grupos: 1. Los metaloenzimas. Que contienen iones metlicos con uniones fuertes y que normalmente corresponden a metales de transicin. Ejemplos: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ o Co3+. 2. Enzimas que se activan por metales fijados dbilmente y que estn presentes en disolucin. Normalmente estos iones corresponden a metales alcalinos o alcalino-trreos: Na+, K+, Mg2+ o Ca2+. El efecto cataltico de los iones metlicos se da de tres modos principales: 1. Fijacin al sustrato al orientar al sustrato adecuadamente para una interaccin efectiva. 2. Participando en las reacciones de oxidacin-reduccin por cambios reversibles en el estado de oxidacin del ion metlico. 3. Estabilizando o apantallando electrostticamente las cargas negativas. Se considera que los iones metlicos, al estabilizar la carga en el sitio activo, consolidan la catlisis. En los estudios sobre las reacciones catalizadas por estos mecanismos se ha establecido que lo iones actan de manera similar a los protones (cido de Lewis), con la ventaja de que pueden estar presentes a elevadas concentraciones y a pH neutro y adems estn en capacidad de tener cargas > +l. De este hecho se desprende que en muchos casos los iones metlicos han sido denominados "superridos. La descarboxilacin del dimetiloxaloacetato, catalizada por iones metlicos como Cu2+ y Ni2+, es un ejemplo no enzimtico de catlisis por iones metlicos:

Tal y como se plante anteriormente, una funcin enzimtica importante de los iones metlicos se da por la posibilidad que poseen para apantallar las cargas. El ejemplo ms plausible probablemente sea el de las quinasas (enzimas que transfieren grupos fosfatos) que resultan ser complejos Mg2+-ATP.

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El papel del ion Mg2+ es dual: En primer lugar logra un efecto orientador del sustrato y simultneamente apantalla electrostticamente las cargas negativas de los grupos fosfato de tal manera que estas cargas no logren repeler los pares electrnicos de los nuclefilos que atacan y muy especialmente de aquellos que poseen carcter aninico. 4. Catlisis Electrosttica. Cuando se da la fijacin de un sustrato en el sitio activo, se da generalmente un desplazamiento o exclusin del agua. Por tanto, la constante dielctrica del sitio activo se asemeja a la de un disolvente orgnico y por lo tanto, interacciones electrostticas son mucho ms fuertes que las que tienen lugar en solucin acuosa. La distribucin de carga en un medio de constante dielctrica baja puede influir mucho sobre la reactividad qumica. As, los valores de pK de las cadenas laterales de aminocidos en las protenas pueden desplazarse varias unidades de sus valores nominales debido a la proximidad de grupos cargados. Se ha establecido que el ion carbonio en la reaccin de la lisozima est estabilizado debido a la interaccin con el ion carboxilato del Asp 52, lo que equivale a un aumento de velocidad de 4x106 Efectos de proximidad y orientacin Si bien los enzimas utilizan mecanismos catalticos similares a los que se presentan en las reacciones orgnicas modelo, son catalticamente mucho ms eficientes. La diferencia en la eficiencia se estima que proviene de las condiciones fsicas especficas en el sitio cataltico del enzima, que estimulan la correspondiente reaccin qumica. Los efectos ms obvios son los de proximidad y orientacin: los reactivos han de entrar en contacto con la relacin espacial adecuada para que tenga lugar la reaccin. Por ejemplo, en la reaccin bimolecular entre el imidazol y el p-nitrofenilacetato se tiene la condicin cintica que se presenta en la figura del costado. En el caso presentado en el esquema se tiene que en k1 la constante de velocidad de pseudoprimer orden, es 0,0018 s-1 cuando [imidazol] = 1M ( = fenil). Sin embargo, en la reaccin intramolecular que se presenta a continuacin, da otra circunstancia:

135 La constante de primer orden k2 = 0,043 s-1, es decir, k2 = 24 k1 . Esto significa que cuando se fija el catalizador (imidazol 1M) de manera covalente al reactivo, el resultado es 24 veces ms efectivo que cuando est libre en solucin. En otras palabras, el grupo imidazol en la reaccin intramolecular acta como si su concentracin fuese 24M. Daniel Koshland propuso un protocolo para determinar como se afecta la velocidad de una reaccin por la proximidad de sus grupos reactivos y teniendo en cuenta los siguientes supuestos: 1. Las especies reactivas, es decir, los grupos funcionales, son aproximadamente del tamao de molculas de agua. 2. Cada especie reactiva en solucin tiene 12 molculas vecinas prximas, como esferas empaquetadas del mismo tamao. 3. Las reacciones qumicas slo se dan entre reactivos que estn en contacto. 4. La concentracin de reactivo en solucin es suficientemente baja, de forma que la probabilidad de que cualquier especie reactiva est en contacto con ms de una molcula del otro reactivo sea despreciable. En estas condiciones, la reaccin:

A+B
d [A-B]

k1

A-B

obedece la ecuacin de velocidad de segundo orden

=k1 [A][B] = k2 [A,B]pares dt donde [A,B]pares es la concentracin de molculas de A y B que estn en contacto. El valor de esta cantidad es:

v=

[A,B]pares =

12 [A][B] 55,5 M

Dado que existen 12 maneras por las que A pueden entrar en contacto con B, y [A]/55,5 es la probabilidad de que una molcula de B se encuentre al lado de una molcula de A ([H2O]=55,5M en soluciones acuosas diluidas). Al combinar las ecuaciones de velocidad, tenemos que:

136 La teora precedente es, por supuesto una simplificacin extrema. Por ejemplo, no se tiene en cuenta las interacciones de unos grupos reactivos respecto a los dems. Aunque el efecto debe ser poco dado que, en el estado de transicin, los grupos reactivos tienen poca movilidad relativa. De hecho, tal como demostr Thomas Bruice, las velocidades de las reacciones intramoleculares aumentan notablemente cuando se detienen los movimientos internos en una molcula (Tabla). As, cuando un enzima pone en contacto dos molculas en una reaccin bimolecular, no solamente aumenta su proximidad sino que congela sus movimientos translacionales y rotacionales relativas. Esto implica que disminuye su entropa y por tanto aumenta su reactividad. En la tabla se indica que estos incrementos de velocidad pueden ser enormes. Otro efecto que se pasa por alto en el concepto de la proximidad es el de la orientacin. Las molculas no reaccionan desde cualquier direccin, como supone la sencilla teora de Koshland. En realidad, slo reaccionan si se encuentran en la orientacin relativa adecuada. Efecto de la fijacin del estado de transicin. El incremento de la velocidad causado por los enzimas es a menudo superior a lo que se podra explicar mediante los mecanismos catalticos y efectos mencionados hasta ahora. No obstante, no se ha considerado uno de los efectos ms importantes involucrados en la catlisis enzimtica: La fijacin de1 estado de transicin a un enzima con mayor afinidad que los correspondientes sustratos/productos. Cuando se considera en conjunto el concepto de fijacin del estado de transicin con los mecanismos catalticos descritos previamente se puede explicar a satisfaccin las altas velocidades enzimticas observadas. El concepto original de la fijacin del estado de transicin propuso que los enzimas tensionan mecnicamente los sustratos, conducindolos hacia la geometra del estado de transicin, mediante sitios de fijacin en los que no encajaran perfectamente los sustratos sin distorsionar. Este mecanismo que coloquialmente se denomina el mecanismo del potro (en analoga con el instrumento medieval de tortura) se bas en multitud de pruebas sobre el papel que juega la tensin en las reacciones orgnicas. Por ejemplo, la velocidad de la reaccin en un compuesto aromtico es 315 veces ms rpida cuando R es CH3, que cuando es H. Esto se sustenta en las mayores repulsiones estricas que se establecen entre los grupos CH3 y los grupos reactivos que cuando R corresponde a H. De manera anloga, las reacciones que conducen a la apertura de anillos son considerablemente ms fciles cuando el anillo est tensionado -como es el caso del ciclopropano- en comparacin con lo que sucede para anillos sin tensionar tal y como se da para el ciclohexano. Se estima que el

137 reactivo tensionado se parece ms al estado de transicin de la reaccin que el correspondiente reactivo sin tensionar. As, tal como se sugiri originalmente por Linus Pauling y despus elaborado por Richard Wolfenden y Gustav Lienhard, las interacciones que fijan preferentemente el estado de transicin incrementan su concentracin y, por consiguiente, aumentan proporcionalmente la velocidad de reaccin.

Para el ejemplo anterior el incremento de la velocidad de reaccin por efecto estrico se resume en la tabla siguiente.
R H CH3 Vel. Vel. 1 315

138 TALLER 12 1. A continuacin se presenta una tabla de datos en la cual aparecen las concentraciones de sustrato y velocidades de una reaccin con y sin inhibidor, son estos datos realiza lo siguiente.
[S](mM) V, sin inhibidor (mM/min) 0,021 0,053 0,106 0,212 1,004 1,889 4,580 6,400 7,720 8,720 9,500 V, con inhibidor 3mM (mM/min) 0,017 0,043 0,085 0,169 0,802 1,508 3,660 5,120 6,180 6,980 7,600

0,010 0,025 0,050 0,100 0,500 1,00 3,00 5,00 7,00 9,00 11,00

a. Realice la grfica de Michaelis-Menten y determine KM, Vmax con y sin inhibidor b. Defina segn la forma de la grfica el tipo de inhibidor c. Obtenga una tabla para graficar la ecuacin de Lineweaver-Burrk y obtenga los valores exactos de KM y Vmax con y sin inhibidor d. Se sabe que en el experimento la concentracin de enzima era 0.5mM, en otro experimento con un enzima diferente con el mismo sustrato, se determin que KM era 6.25 mM y kcat era 27 s-1 para el nuevo enzima, determine cul de los dos enzimas es mejor para el sustrato y por qu razn. 2. Investigue cual es el enzima E.C.1.1.1.1 3. Investigue y explique los mecanismos de reaccin de los siguientes enzimas triosa fosfato isomerasa, quimiotripsina 4. Ejemplifique cada uno de los siguientes tipos de catlisis a partir de enzimas definidas a. Catlisis cido-base b. Catlisis covalente c. Catlisis por iones metlicos d. Catlisis electrosttica